Name: adoptive immunotherapy of inkt cells in glucose-6-phosphate isomerase (g6pi)-induced ra mice
Uploaded: 2020-01-31T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice at JoVE.com

Vores undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (NSFC) (81771755), Colleges og universitetets videnskab og teknologi centrale forskningsprojekt i Hebei-provinsen (ZD2017009) og Animal Lab of Medical Experiment Center, Hebei University. Vi er taknemmelige for deres støtte.

Alle eksperimentelle mus (150 i alt) var raske mandlige DBA/1 mus, 6-8 uger gamle (20,0 ± 1,5 g), opdrættet i et specifikt patogenfrit (SPF) miljø. Der er ingen særbehandling før modellering. Forsøget blev opdelt i en sund kontrolgruppe (15 mus), en modelkontrolgruppe (15 mus) og en celleterapigruppe (55 mus). Denne undersøgelse blev godkendt af Hebei Universitys dyrevelfærds- og etiske udvalg.
1. Konstruktion af sygdomsmodellen
<ol><li>Duplikere RA dyremodel<ol>
<li>1,75 mg både hG...

<ol>
	<li>Tob&#243;n, G. J., Youinou, P., Saraux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+environment,+geo-epidemiology,+and+autoimmune+disease:+Rheumatoid+arthritis.">The environment, geo-epidemiology, and autoimmune disease: Rheumatoid arthritis.</a> Autoimmunity Reviews. 35 (1), 0 (2010).</li><li>Cross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+rheumatoid+arthritis:+estimates+from+the+Global+Burden+of+Disease+2010+study.">The global burden of rheumatoid arthritis: estimates from the Global Burden of Disease 2010 study.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1316-1322 (2014).</li><li>Kanashiro, A., Bassi, G. S., Queir&#243;z Cunha, F. D., Ulloa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+neuroimunomodulation+to+bioelectronic+treatment+of+rheumatoid+arthritis.">From neuroimunomodulation to bioelectronic treatment of rheumatoid arthritis.</a> Bioelectronics in Medicine. 1 (2), 151-165 (2018).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Bianca, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+Natural+Killer+T-Cells+Development.">Unraveling Natural Killer T-Cells Development.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1950 (2018).</li><li>Mitsuo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+CD161+CD8++T+cells+in+the+peripheral+blood+of+patients+suffering+from+rheumatic+diseases.">Decreased CD161+CD8+ T cells in the peripheral blood of patients suffering from rheumatic diseases.</a> Rheumatology. 45 (12), 1477-1484 (2006).</li><li>Miellot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+invariant+NK+T+cells+protects+against+experimental+rheumatoid+arthritis+by+an+IL-10-dependent+pathway.">Activation of invariant NK T cells protects against experimental rheumatoid arthritis by an IL-10-dependent pathway.</a> European Journal of Immunology. 35 (12), 3704-3713 (2005).</li><li>Miellot-Gafsou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+activation+of+invariant+natural+killer+T+cells+in+a+rheumatoid+arthritis+model+and+application+to+disease+treatment.">Early activation of invariant natural killer T cells in a rheumatoid arthritis model and application to disease treatment.</a> Immunology. 130 (2), 296-306 (2010).</li><li>Tudhope, S. J., Delwig, A. V., Falconer, J., Pratt, A., Ng, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profound+invariant+natural+killer+t-cell+deficiency+in+inflammatory+arthritis.">Profound invariant natural killer t-cell deficiency in inflammatory arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 69 (10), 1873-1879 (2010).</li><li>Ming, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+immunoregulation+of+iNKT+cells+in+RA+by+novel+synthetic+immunostimulator+CH1b.">Effects on immunoregulation of iNKT cells in RA by novel synthetic immunostimulator CH1b.</a> Chinese Journal of Immunology. 32 (02), 218-222 (2016).</li><li>Ming, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+correlation+between+the+percentage+of+iNKT+cells+and+the+ratio+of+IFN-&#947;/IL-4+in+patients+with+rheumatoid+arthritis.">Study of the correlation between the percentage of iNKT cells and the ratio of IFN-&#947;/IL-4 in patients with rheumatoid arthritis.</a> Chinese Journal of Microbiology Immunology. 35 (3), 213-218 (2015).</li><li>Sharif, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+natural+killer+T+cells+by+&#945;-galactosylceramide+treatment+prevents+the+onset+and+recurrence+of+autoimmune+Type+1+diabetes.">Activation of natural killer T cells by &#945;-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes.</a> Nature Medicine. 7, 1057-1062 (2010).</li><li>Gapin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+invariant+natural+killer+T+cells.">Development of invariant natural killer T cells.</a> Current Opinion in Immunology. 39, 68-74 (2016).</li><li>Kwon, D. I., Lee, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+Differentiation+Program+of+Invariant+Natural+Killer+T+Cells.">Lineage Differentiation Program of Invariant Natural Killer T Cells.</a> Immune Network. 17 (6), (2017).</li><li>Thapa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differentiation+of+ROR-&#947;t+expressing+iNKT17+cells+is+orchestrated+by+Runx1.">The differentiation of ROR-&#947;t expressing iNKT17 cells is orchestrated by Runx1.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7018 (2017).</li><li>Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-induced+arthritis+as+an+animal+model+for+rheumatoid+arthritis:+focuson+interferon-&#947;.">Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focuson interferon-&#947;.</a> Interferon Cytokine Research. 31 (12), 917-926 (2011).</li><li>Van Haalen, H. G. M., Severens, J. L., Tran-Duy, A., Boonen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cost-effectiveness+A+systematic+review+and+stepwise+approach+for+selecting+a+transferable+health+economic+evaluation+rheumatoid+arthritis.">How cost-effectiveness A systematic review and stepwise approach for selecting a transferable health economic evaluation rheumatoid arthritis.</a> Pharmacoeconomics. 32 (5), 429-442 (2014).</li><li>Schubert, D., Maier, B., Morawietz, L., Krenn, V., Kamradt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+glucose-6-phosphate+isomerase+induces+T+cell-dependent+peripheral+polyarthritis+in+genetically+unaltered+mice.">Immunization with glucose-6-phosphate isomerase induces T cell-dependent peripheral polyarthritis in genetically unaltered mice.</a> Journal of Immunology. 172, 4503-4509 (2004).</li><li>Bockermann, R., Schubert, D., Kamradt, T., Holmdahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+B-cell-dependent+chronic+arthritis+with+glucose-6-phosphate+isomerase.">Induction of a B-cell-dependent chronic arthritis with glucose-6-phosphate isomerase.</a> Arthritis Research, Therapy. 7, 131613-131624 (2005).</li><li>Kamradt, T., Schubert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+and+clinical+implications+of+G6PI+in+experimental+models+of+rheumatoid+arthritis.">The role and clinical implications of G6PI in experimental models of rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Research, Therapy. 7, 20-28 (2005).</li><li>Horikoshi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Invariant+NKT+Cells+with+Glycolipid+Ligand+&#945;-Galactosylceramide+Ameliorates+Glucose-6-Phosphate+Isomerase+Peptide-Induced+Arthritis.">Activation of Invariant NKT Cells with Glycolipid Ligand &#945;-Galactosylceramide Ameliorates Glucose-6-Phosphate Isomerase Peptide-Induced Arthritis.</a> PlosOne. 7 (12), 51215 (2012).</li><li>Zhang, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+mixed+peptides+derived+from+glucose-6-phosphate+isomerase+induces+rheumatoid+arthritis+in+DBA+/1+mice.">Immunization with mixed peptides derived from glucose-6-phosphate isomerase induces rheumatoid arthritis in DBA /1 mice.</a> Chinese Journal of Pathophysiology. 32 (3), 569-576 (2016).</li><li>Motohashi, S., Nakayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cell-based+immunotherapy+for+cancer.">Invariant natural killer T cell-based immunotherapy for cancer.</a> Immunotherapy. 1 (1), 73 (2017).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+of+natural+killer+T-cells+in+tolerogenic+APCs-mediated+suppression+of+collagen-induced+arthritis.">The requirement of natural killer T-cells in tolerogenic APCs-mediated suppression of collagen-induced arthritis.</a> Experimental and Molecular Medicine. 42 (8), 547-554 (2010).</li><li>Luc, V. K., Lan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Potential+of+Invariant+Natural+Killer+T+Cells+in+Autoimmunity.">Therapeutic Potential of Invariant Natural Killer T Cells in Autoimmunity.</a> Frontiers in Immunology. 9, 519-526 (2018).</li><li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+collagen-induced+arthritis+by+natural+killer+T+cell+activation+with+OCH,+a+sphingosine-truncated+analog+of+&#945;-galactosylceramide.">Suppression of collagen-induced arthritis by natural killer T cell activation with OCH, a sphingosine-truncated analog of &#945;-galactosylceramide.</a> Arthritis, Rheumatism. 50 (1), 305-313 (2004).</li><li>Tudhope, S. J., Delwig, A. V., Falconer, J., Pratt, A., Ng, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profound+invariant+natural+killer+t-cell+deficiency+in+inflammatory+arthritis.">Profound invariant natural killer t-cell deficiency in inflammatory arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 69 (10), 1873-1879 (2010).</li><li>Bruns, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+an+immunodominant+self-peptide+derived+from+glucose-6-phosphate+isomerase+induces+arthritis+in+DBA/1+mice.">Immunization with an immunodominant self-peptide derived from glucose-6-phosphate isomerase induces arthritis in DBA/1 mice.</a> Arthritis Research, Therapy. 11 (4), (2009).</li><li>Parietti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rituximab+treatment+overcomes+reduction+of+regulatory+iNKT+cells+in+patients+with+rheumatoid+arthritis.">Rituximab treatment overcomes reduction of regulatory iNKT cells in patients with rheumatoid arthritis.</a> Clinical Immunology. 134 (3), 331-339 (2010).</li><li>Yoshida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+mechanism(s)+of+the+inhibition+of+disease+progression+by+combination+treatment+with+fingolimod+plus+pathogenic+antigen+in+a+glucose-6-phosphate+isomerase+peptide-induced+arthritis+mouse+model.">Functional mechanism(s) of the inhibition of disease progression by combination treatment with fingolimod plus pathogenic antigen in a glucose-6-phosphate isomerase peptide-induced arthritis mouse model.</a> Biological, Pharmaceutical Bulletin. 38 (8), 1120-1125 (2015).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+adoptive+immunotherapy+on+rheumatoid+arthritis+with+Thymus-derived+invariant+natural+killer+T+cells.">Study of the adoptive immunotherapy on rheumatoid arthritis with Thymus-derived invariant natural killer T cells.</a> International Immunopharmacology. 67, 427-440 (2019).</li></ol>

iNKT celler er særlige T-celler, bro medfødte og adaptive immunitet og er hovedsageligt udviklet fra CD4++/ CD8+ thymocytter. iNKT celler har forskellige immunreguleringsfunktioner og interagere med andre immunceller ved direkte kontakt og sekretorer af forskellige cytokiner23, påvirker dendritiske celler (DC' er), makrofager, neutrofiler, B-celler, T-celler, og NK celle differentiering og udvikling24....

Leddegigt (RA) er en autoimmun sygdom karakteriseret ved kronisk, progressiv invasiv med 0,5-1% incidens1,2. Den underliggende patogenese tilskrives den unormale spredning af autoreaktive CD4+ og CD8+ T-celler, manifesteret ved en stigning i andelen af CD4+IFN-γ+ og CD4+IL-17A+ T-celler og det reducerede antal CD4+IL-4+ og CD4+CD25+FoxP3+ T-celler. Derfor øges udskillelse af inflammatoriske cytokiner, og en overdreven inflammatorisk reaktion ødelægger den indfødte balance og tolerancefunktion i kroppens immunsystem. Desuden hjælperen T lymfocyt (Th) 1 celler, der trænger ind i leddet forværre inflammatoriske respons og ledskader. Derfor er hæmningaf overdreven inflammatorisk respons og genskabelse af immuntolerance og immunbalance nøglen til behandling af RA3,4.
INKT-cellerne har både NK-celle- og T-cellefunktioner og -egenskaber. INKT-cellerne har en særskilt, invariant T-cellereceptor (TCR) α-kæde med begrænsede TCR β-kæderepertoirer5 og genkender glycolipidantigenet, der præsenteres af det store histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I molekyle CD1d på overfladen af de antigenpræsenterende celler. Mitsuo et al.6 opdaget et stort antal iNKT celler og funktionelle defekter i mange autoimmune sygdomme, herunder RA. Aurore et al.7 viste, at iNKT-celler har en positiv effekt på opretholdelsen af autoimmun tolerance, og at sygdommen afhjælpes, når antallet og funktionen af iNKT-celler genoprettes. Desuden fandt Miellot-Gafsou et al.8, at iNKT-celler ikke kun ophævede sygdommen, men også øgede sygdommens progression. Disse modstridende resultater tyder på, at iNKT-celler er heterogene T-celler, og funktionen af forskellige undersæt kan vendes. I en klinisk undersøgelse af RA korrelerer hyppigheden af iNKT-celler med scoren for sygdomsaktiviteten9. Resultaterne bekræftede også, at hyppigheden af iNKT blev nedsat hos RA-patienter, antallet af CD4+IFN-γ+ T-celleundersæt steg, og de sekretoiniske niveauer af inflammatoriske cytokiner IFN-γ og TNF-α steg10,11. Desuden undersøgte Sharif et al.12 type 1-diabetes (T1D) og fandt ud af, at selektiv infusion af iNKT-celler opregulerede ekspressionen af den inflammatoriske cytokin IL-4, opretholdt immuntolerance og forhindrede udviklingen af type 1-diabetes. Derfor øger adoptivinfusion af specifikke iNKT-celler eller målrettet aktivering af iNKT-celler niveauet af iNKT-celler hos RA-patienter, hvilket kan være et gennembrud i RA-behandling.
Cellulære immunterapi er i øjeblikket af stor interesse og har været meget udbredt i kræftbehandling. INKT-celler er imidlertid sjældne, heterogene immunregulerende celler (kun 0,3 % af det samlede antal PbMC'er)13, hvilket begrænser potentielle kliniske anvendelser. Disse celler er hovedsageligt opdelt i tre delpopulationer: 1) iNKT1 celler, som har et højt udtryk for promyelocytisk leukæmi zink-finger protein (PLZF) og T-box transskription faktor (T-bet); 2) iNKT2 celler med mellemliggende udtryk for PLZF og GATA bindende protein 3 (GATA3); 3) iNKT17 celler med lavt udtryk for PLZF og retinoid-relaterede forældreløse nukleare receptor (ROR)-γt at udskille IFN-γ, IL-4, og IL-1714. Aktiverede iNKT celler udskiller Th1, Th2, og Th17-lignende cytokiner, som bestemmer de forskellige immunmodulerende virkninger af iNKT celler15. De immunmodulerende og immunoterapeutiske virkninger af specifik aktivering af forskellige delpopulationer af iNKT-celler er forskellige. Derfor kan udvælgelsen af specifikke fænotyper af iNKT-celler (hovedsagelig iNKT2) med antiinflammatoriske funktioner til at regulere kroppens immunrespons korrigere immunubalancen og immunlidelserne hos RA.
Etableringen af en ideel dyremodel er af stor betydning for behandling og undersøgelse af RA patogenese. I øjeblikket, de mest almindeligt anvendte og modne dyremodeller omfatter kollagen-induceret arthritis, adjuverende arthritis, zymosan-induceret arthritis, og polysaccharid-induceret arthritis16–17. Men der er ingen model, der fuldt ud kan simulere alle funktionerne i menneskelige RA. Type II kollagen-induceret arthritis (CIA) er en klassisk arthritis model. CIA er induceret af immunisering af mus med type II kollagen-specifikke monoklonale antistoffer, der afspejler antistof afhængighed af denne sygdom model. Benurs et al. beskrev en model med en systemisk immunrespons på glukose-6-fosfat isomerase (G6PI), som inducerer perifer symmetrisk polyarthritis hos modtagelige musestammer18,19. I denne model, udviklingen af gigt afhænger af T-celler, B-celler, og medfødte immunitet18,19,20. Horikoshi21 fandt, at RA modeller som følge af immunisering af DBA/1 mus med G6PI polypeptid fragmenter ligner mere menneskelige RA i form af CD4+ T celler og cytokiner (dvs. IL-6 og TNF-α) end CIA modeller. For at øge den stimulerende virkning på TCR anerkendelse site, blandet polypeptid fragmenter af G6PI (hGPI325-339 og hGPI469-483) blev brugt til at immunisere DBA/1 mus til at konstruere RA musemodel. Succesraten for denne fremgangsmåde kan høj, fordi hGPI325-339 og hGPI469-483 er immundominerende for I-A q-begrænsede T-cellereaktioner. Derfor kan denne model simulere overproliferation af CD4+ T-celler og iNKT-cellefejl hos RA-patienter22. Grundforskningen i RA immunpatologi lagde grunden til vores videre dybdegående undersøgelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZF</td>
			<td>BD</td>
			<td>563490</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PE MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>MS</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allegra&#174; X-15R</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D12731</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Center</td>
			<td>Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd.</td>
			<td>BMJ-1</td>
			<td>China</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Hamster Anti-Mouse TCR &#946; Chain</td>
			<td>BD</td>
			<td>553170</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#39;s complete adjuvant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F5881</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML)</td>
			<td>Karebay Biochem</td>
			<td>18062202</td>
			<td>China</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT)</td>
			<td>Karebay Biochem</td>
			<td>18062203</td>
			<td>China</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>caliper IVIS lumina II</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin Calcium</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10004974</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRN7000</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-CN2-0013</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD1d Tetramer-PE</td>
			<td>MBL</td>
			<td>TS-MCD-1</td>
			<td>Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse percoll</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P8620</td>
			<td>China</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus-II</td>
			<td>Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-&#978;t</td>
			<td>BD</td>
			<td>562683</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet</td>
			<td>BD</td>
			<td>561316</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertussis toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7208</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol esters</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10008014</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>555899</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-100-1ACS</td>
			<td>Israel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Th1/Th2/Th17 cytokines kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>560485</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica EM UC6</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adoptive immunotherapy of inkt cells in glucose-6-phosphate isomerase (g6pi)-induced ra mice

Leddegigt (RA) er en kompleks kronisk inflammatorisk autoimmun sygdom. Sygdommens patogenese er relateret til invariant naturlige dræber T (iNKT) celler. Patienter med aktiv RA præsentere færre iNKT celler, defekt celle funktion, og overdreven polarisering af Th1. I denne undersøgelse blev der etableret en RA-dyremodel ved hjælp af en blanding af hGPI325-339 og hGPI469-483 peptider. INKT-cellerne blev fremstillet ved in vivo induktion og in vitrorensning efterfulgt af infusion i RA-mus til adoptivimmunterapi. In vivo imaging system (IVIS) sporing viste, at iNKT celler var hovedsageligt fordelt i milten og leveren. På dag 12 efter celleterapi, sygdomsprogression bremset betydeligt, de kliniske symptomer blev lindret, forekomsten af iNKT celler i thymus steget, andelen af iNKT1 i thymus faldt, og niveauet af TNF-α, IFN-γ, og IL-6 i serum faldt. Adoptivimmunterapi af iNKT-celler genoprettede balancen mellem immunceller og korrigerede den overdrevne betændelse i kroppen.

Den arthritis indeks score og pote tykkelse steg efter modellering. Sammenlignet med kontrolgruppen begyndte tæerne i RA-modelgruppen at vise rød hævelse ved 6 dage efter modellering, med gradvis forværring. På 14 dage, den røde hævelse i ankelleddet toppede, efterfulgt af gradvis lindring. Tykkelsen af poten ændret på samme måde (P < 0,05) (Figur 1).
Den inflammatoriske celle infiltration steg betydeligt efter modellering. De patologiske result...

Watch this Scientific Journal Video about Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice at JoVE.com

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

Denne protokol bruger G6PI blandede peptider til at konstruere leddegigt modeller, der er tættere på den menneskelige leddegigt i CD4+ T celler og cytokiner. Høj renhed invariant naturlige dræber T-celler (hovedsagelig iNKT2) med specifikke fænotyper og funktioner blev opnået ved in vivo induktion og in vitro rensning for adoptivimmunterapi.

Adoptivimmunterapi af iNKT-celler i glucose-6-fosfatisomerase (G6PI)-Induceret RA-mus

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

Vores protokol beskriver en metode til at bygge en RA-model. Dens succesrate er over 93 procent og dens patogenese er afhænger af T-celler, B-celler, og medfødte immunitet, som giver forskerne mulighed for bedre at studere patogenesen af RA fra et globalt immunperspektiv. Derefter bruger vi INKT-celler med immunmodulerende effekter til deres behandling.INKT-celler har god effekt på behandlingen ved in vivo introduktion, som giver grundlæggende data støtte til klinisk anvendelse af INKT celler og virkelig eksploderer den kliniske anvendelse værdi af INKT celler. Den største fordel ved denne teknologi er, at det er nemt at betjene og let at kopiere. Demonstration af proceduren vil være Chen Shengde, Gao Xiang, og Zhang Jingnan, kandidat studerende fra mit laboratorium.Til at begynde, vejer 1,75 mg både HGPI325 til 339 og HGPI469 til 483 fragmenter og opløse dem i 5,25 milliliter 4 grader Celsius tredobbelt destilleret vand. Opløs Complete Freund's Adjuvant i et 50 grader Celsius vandbad. 5,25 milliliter trækkes i et andet centrifugerør på 10 milliliter, og det afkøles til brug.Sæt blandingen af HG6PI opløsning og Komplet Freund's Adjuvans løsning i en kunstig emulgering enhed med to glas sprøjter, tilsluttet. I et isbad skubbes sprøjten med en konstant hastighed og frekvens på ti til tyve gange i minuttet for helt at emulgere blandings peptidopløsningen og færdiggøre Freunds Adjuverende opløsning. Derefter holde emulsionsdråber i vandet i ti minutter.Dernæst injiceres 150 mikroliter af de emulgeret HG6PI'er i musens halerod subkutant. Umiddelbart og efter 48 timer, injicere 200 milligram pertussis toksin i musen intraperineally. Nu, injicere normal DBA1 mus intraperineally uden gausser ved dosis af 0.1 milligram pr kg kropsvægt.Tre dage efter modellering, efter bedøvelse, isolere milten af musen. Forbered en enkelt celle suspension ved at skære og slibe milten i en 200 mesh sigte. Vask cellesuspensionen med PBS.Centrifuge ved 200 gange g i fem minutter og kassér supernatanten. Re suspendere cellerne med en milliliter fuldblodsvæv opløsning. Tilføj tre milliliter mus lymfocyt separation medium.Og derefter centrifuge cellerne i 20 minutter ved 300 gange g ved stuetemperatur. For at rense INKT celler, resuspend 10 til de syvende celler med 100 mikroliter af fire grader Celsius PBS, tilføje 10 mikroliter alfa gausser indlæst CD1 tetramer PE og inkubere dem ved 4 grader Celsius i femten minutter i mørke. Cellerne vaskes to gange med PBS, og opslænnes dem i 80 mikroliter PBS.Tilsæt 20 mikroliter af anti-PE mikroperler og inkuber dem ved fire grader Celsius i tyve minutter i mørke. Vask dem to gange med PBS og opslæn opslænt cellerne med 500 mikroliter PBS. Anbring sorteringssøjlen i MACS-sorteringssorterings magnetfelt, og skyl med 500 mikroliter PBS.Tilføj den forberedte cellesuspension til sorteringskolonnen, opsaml flowet igennem, og skyl tre gange med PBS-buffer. Fjern magnetfeltet, og tilsæt en milliliter PBS-buffer til sorteringssøjlen. Skub hurtigt stemplet ved et konstant tryk for at drive de mærkede celler ind i opsamlingsrøret.Og få de rensede INKT celler. Tæl med en automatiseret celletæller. For at identificere INKT celle fænotype, først tage en gange ti til den sjette celler fra de rensede INKT celler og resuspend dem i 50 mikroliter af PBS.Der tilsættes 0,5 mikroliter alfa gausser PE CD1 tetramer eller 10 mikroliter FITC TCR beta i det enkelte positive kontrolrør. Der tilsættes 0,5 mikroliter alfa gausser PE CD1 tetramer, Tilsæt 10 mikroliter FITC TCR beta i prøverøret. Inkuber dem ved fire grader Celsius i 30 minutter i mørke.Derefter vaskes cellerne i PBS, og centrifugeres derefter ved 200 gange g i fem minutter. Kassér supernatanten, og tilsæt en milliliter FoxP3 fikseringsabiliseringsløsning. Og inkuber cellerne i 45 minutter ved fire grader Celsius i mørket.Derefter tilsættes en milliliter 1x permeabilization arbejdsløsning og centrifuge cellerne ved 500 gange g ved stuetemperatur i fem minutter. Kassér supernatanten. Tilføj en mikroliter af AlexaFluor 647 mus anti-PLZF og en microliter af PerCP Cy5.5 mus anti-Tbet og inkubere i tredive minutter ved stuetemperatur i mørke.Dernæst tilsættes to mikroliter af permeabilisering buffer arbejder løsning og centrifuge ved 200 gange g i fem minutter til rengøring. Kassér supernatanten. Resuspend cellerne i 500 mikroliter af PBS og måle ved flow cytometri.I denne undersøgelse, sammenlignet med kontrolgruppen, tæerne i RA modelgruppen begyndte at vise rød hævelse efter modellering med gradvis forværring. På 14 dage, den røde hævelse i ankelleddet toppede efterfulgt af gradvis lindring. De patologiske resultater viser, at infiltration graden af inflammatoriske celler i anklen synovialvæv af RA model mus var anderledes på forskellige stadier.Peak inflammation opstod på dag 14 post modellering. I RA modelgruppen steg serumniveauet af proinflammatoriske cytokiner betydeligt 11 dage og 14 dage efter modellering. Mens anti-inflammatoriske cytokiner faldt betydeligt.Dette tal viser, at blækt2-hastigheden hos normale mus var omkring fem procent. Satsen for INK2 var omkring 82 procent efter in vivo induktion. Hastigheden af INK2 var mere end 92 procent efter MACS rensning.Her viser vi en metode til at emulgere de store polypeptid, vi ser i RA. De emulgeret dråber holdes i vandet i 10 minutter. Resultaterne er ved at sprede sig. Denne protokol er en ny tilføjelse til behandling af RA rejst særlige NKT celler.Som kan anvendes mod celle immunterapi eller andre autoimmune sygdomme og tumorer. Denne model kan stimulere den samlede spredning af CD4 T-celler og NKT celler underskud i RA patienter, som lægger grunden til dybdegående undersøgelse af RA immun veje. I denne protokol injiceres pertussis toksin interperitoneally under modellering.Brug venligst eksperimenterende tøj og engangshandsker. Og bære alle de standarder for operation for at forhindre stiksår en infektion.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Fremstilling af tumorantigen-loaded dendritiske celler til immunterapi

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Accelerated Type 1 Diabetes Induktion i mus ved adoptiv overførsel af diabetogene CD4 + T-celler

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

Intralymfatisk Immunterapi og Vaccination i mus

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Vurdere udviklingen i murine Plasmacytoid dendritiske celler i Peyer&#39;ske Patches Brug adoptiv overførsel af Hematopoietic Progenitorer

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

Generation af CAR T-celler til adoptiv terapi i forbindelse med glioblastom standard for pleje

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induktion af murine tarmbetændelse ved adoptiv overførsel af effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Høj</sup&gt; T celler i immunsvækkede mus

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Induktion af lammelse og visuelle System skade i mus af T celler specifik for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generation af diskriminerende menneskelige monoklonale antistoffer fra sjældne Antigen-specifikke B celler cirkulerer i blodet

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Stereotactic adoptiv overførsel af cytotoksiske immunceller i Murine modeller af Orthotopic menneskelige glioblastom Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...