Name: adoptive immunotherapy of inkt cells in glucose-6-phosphate isomerase (g6pi)-induced ra mice
Uploaded: 2020-01-31T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice at JoVE.com

Il nostro studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (NSFC) (81771755), Colleges e progetto di ricerca chiave di scienza e tecnologia dell'università della provincia di Hebei (D2017009) e l'Animal Lab del Medical Experiment Center, Hebei University. Siamo grati per il loro sostegno.

Tutti i topi sperimentali (150 in totale) erano maschi sani di tipo DBA/1 topi, di 6-8 settimane (20,0 x 1,5 g), allevati in uno specifico ambiente privo di agenti patogeni (SPF). Non esiste un trattamento speciale prima della modellazione. L'esperimento è stato diviso in un gruppo di controllo sano (15 topi), un gruppo di controllo del modello (15 topi) e un gruppo di terapia cellulare (55 topi). Questo studio è stato approvato dall'Animal Welfare and Ethical Committee dell'Università di Hebei.
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	<li>Tob&#243;n, G. J., Youinou, P., Saraux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+environment,+geo-epidemiology,+and+autoimmune+disease:+Rheumatoid+arthritis.">The environment, geo-epidemiology, and autoimmune disease: Rheumatoid arthritis.</a> Autoimmunity Reviews. 35 (1), 0 (2010).</li><li>Cross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+rheumatoid+arthritis:+estimates+from+the+Global+Burden+of+Disease+2010+study.">The global burden of rheumatoid arthritis: estimates from the Global Burden of Disease 2010 study.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1316-1322 (2014).</li><li>Kanashiro, A., Bassi, G. S., Queir&#243;z Cunha, F. 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J., Delwig, A. V., Falconer, J., Pratt, A., Ng, W. 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I., Lee, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+Differentiation+Program+of+Invariant+Natural+Killer+T+Cells.">Lineage Differentiation Program of Invariant Natural Killer T Cells.</a> Immune Network. 17 (6), (2017).</li><li>Thapa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differentiation+of+ROR-&#947;t+expressing+iNKT17+cells+is+orchestrated+by+Runx1.">The differentiation of ROR-&#947;t expressing iNKT17 cells is orchestrated by Runx1.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7018 (2017).</li><li>Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-induced+arthritis+as+an+animal+model+for+rheumatoid+arthritis:+focuson+interferon-&#947;.">Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focuson interferon-&#947;.</a> Interferon Cytokine Research. 31 (12), 917-926 (2011).</li><li>Van Haalen, H. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+mixed+peptides+derived+from+glucose-6-phosphate+isomerase+induces+rheumatoid+arthritis+in+DBA+/1+mice.">Immunization with mixed peptides derived from glucose-6-phosphate isomerase induces rheumatoid arthritis in DBA /1 mice.</a> Chinese Journal of Pathophysiology. 32 (3), 569-576 (2016).</li><li>Motohashi, S., Nakayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cell-based+immunotherapy+for+cancer.">Invariant natural killer T cell-based immunotherapy for cancer.</a> Immunotherapy. 1 (1), 73 (2017).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+of+natural+killer+T-cells+in+tolerogenic+APCs-mediated+suppression+of+collagen-induced+arthritis.">The requirement of natural killer T-cells in tolerogenic APCs-mediated suppression of collagen-induced arthritis.</a> Experimental and Molecular Medicine. 42 (8), 547-554 (2010).</li><li>Luc, V. K., Lan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Potential+of+Invariant+Natural+Killer+T+Cells+in+Autoimmunity.">Therapeutic Potential of Invariant Natural Killer T Cells in Autoimmunity.</a> Frontiers in Immunology. 9, 519-526 (2018).</li><li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+collagen-induced+arthritis+by+natural+killer+T+cell+activation+with+OCH,+a+sphingosine-truncated+analog+of+&#945;-galactosylceramide.">Suppression of collagen-induced arthritis by natural killer T cell activation with OCH, a sphingosine-truncated analog of &#945;-galactosylceramide.</a> Arthritis, Rheumatism. 50 (1), 305-313 (2004).</li><li>Tudhope, S. J., Delwig, A. V., Falconer, J., Pratt, A., Ng, W. 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Le cellule iNKT sono cellule T speciali che colmano l'immunità innata e adattiva e sono sviluppate principalmente a partire daCD4/CD8e timociti. Le cellule iNKT hanno diverse funzioni immunoregolatorie e interagiscono con altre cellule immunitarie per contatto diretto e secrezione di diverse citochine23, che interessano le cellule dendritiche (DC), macrofagi, neutrofili, cellule B, cellule T e differenziazione e sviluppo delle cellule NK<sup class="xr...

L'artrite reumatoide (RA) è una malattia autoimmune caratterizzata da invasività cronica e progressiva con incidenza dello 0,5-1%1,2. La patogenesi di fondo è attribuita alla proliferazione anomala di celluleCD4 autoattive e CD8, manifestata da un aumento della proporzione di celluleT cd4, IFN-eCD4, IL-17A, e al numero ridotto di cellule TCD4- IL-4e CD4- CD25 - FoxP3 . Pertanto, la secrezione di citochine infiammatorie è aumentata e una reazione infiammatoria eccessiva distrugge l'equilibrio nativo e la funzione di tolleranza del sistema immunitario del corpo. Inoltre, le cellule helper del linfocito T (Th) 1 che penetrano nell'articolazione aggravano la risposta infiammatoria e i danni articolari. Pertanto, l'inibizione dell'eccessiva risposta infiammatoria e il ripristino della tolleranza immunitaria e dell'equilibrio immunitario sono fondamentali per il trattamento dell'RA3,4.
Le celle iNKT hanno funzioni e caratteristiche sia della cellula NK che di cellule T. Le cellule iNKT ospitano una catena di z distinta e invarianti con repertori a catena TCRlimitati 5 e riconoscono l'antigene glicolipido presentato dalla principale molecola CD1d del complesso di istocompatibilità (MHC) sulla superficie delle cellule che presentano l'antigene. Mitsuo et al.6 ha rilevato un gran numero di cellule iNKT e difetti funzionali in molte malattie autoimmuni, tra cui ra. Aurore et al.7 ha dimostrato che le cellule iNKT hanno un effetto positivo sul mantenimento della tolleranza autoimmune e che quando il numero e la funzione delle cellule iNKT vengono ripristinate, la malattia viene alleviata. Inoltre, Miellot-Gafsou et al.8 ha scoperto che le cellule iNKT non solo abrogavano la malattia, ma aumentavano anche la progressione della malattia. Questi risultati contraddittori suggeriscono che le cellule iNKT sono cellule T eterogenee e la funzione di diversi sottoinsiemi può essere invertita. In uno studio clinico di RA, la frequenza delle cellule iNKT è correlata al punteggio dell'attività della malattia9. I risultati hanno anche confermato che la frequenza di iNKT è stata diminuita nei pazienti affetti da rappare, il numero di sottoinsiemi di cellule TCD4- IFN-z-s è aumentato, e i livelli secretorici di citochine infiammatorie IFN-e TNF-aumentati di10,11. Inoltre, Sharif et al.12 ha studiato il diabete di tipo 1 (T1D) e ha scoperto che l'infusione selettiva di cellule iNKT regolava l'espressione della citochina infiammatoria IL-4, manteneva la tolleranza immunitaria e impediva lo sviluppo del diabete di tipo 1. Pertanto, l'infusione adottiva di specifiche cellule iNKT o l'attivazione mirata di cellule iNKT aumenta il livello delle cellule iNKT nei pazienti affetti da RA, che può essere una svolta nel trattamento dell'AR.
L'immunoterapia cellulare è attualmente di grande interesse ed è stata ampiamente utilizzata nella terapia del cancro. Tuttavia, le cellule iNKT sono cellule immunoregolatorie rare ed eterogenee (solo lo 0,3% del numero totale di PBMC)13, il che limita le potenziali applicazioni cliniche. Queste cellule sono principalmente suddivise in tre sottopopolazioni: 1) cellule iNKT1, che hanno un'alta espressione di proteina leucemia promielocitica zinco-dita (PL-F) e fattore di trascrizione T-box (T-bet); 2) cellule iNKT2 con espressione intermedia della proteina legante PL-F e GATA 3 (GATA3); 3) cellule iNKT17 con bassa espressione di PL-F e recettore orfano legato ai retinoidi (ROR) - che secernono IFN-z, IL-4, e IL-1714. Le cellule iNKT attivate secernono Th1, Th2 e Th17-come citochine, che determinano i diversi effetti immunomodulatori delle cellule iNKT15. Gli effetti immunomodulatori e immunoterapeutici dell'attivazione specifica di varie sottopopolazioni di cellule iNKT sono diversi. Pertanto, la selezione di fenotipi specifici delle cellule iNKT (principalmente iNKT2) con funzioni antinfiammatorie per regolare la risposta immunitaria del corpo può correggere lo squilibrio immunitario e i disturbi immunitari nell'AR.
L'istituzione di un modello animale ideale è di grande importanza per il trattamento e lo studio della patogenesi ra. Attualmente, i modelli animali più comunemente utilizzati e maturi includono artrite indotta dal collagene, artrite adiuvante, artrite indotta da zymiosan e artrite indotta dal polisaccoro16–17. Tuttavia, non esiste un modello in grado di simulare completamente tutte le caratteristiche dell'AR umana. L'artrite indotta dal collagene di tipo II (CIA) è un modello classico di artrite. La CIA è indotta dall'immunizzazione dei topi con anticorpi monoclonali specifici del collagene di tipo II, che riflettono la dipendenza da anticorpi di questo modello di malattia. Benurs et al. ha descritto un modello con una risposta immunitaria sistemica all'isomerassia del glucosio-6-fosfato (G6PI), che induce la poliartrite simmetrica periferica nei ceppi di topo sensibili18,19. In questo modello, lo sviluppo dell'artrite dipende dalle cellule T, cellule B e dall'immunità innata18,19,20. Horikoshi21 ha scoperto che i modelli RA risultanti dall'immunizzazione dei topi DBA/1 con frammenti di polipeptide G6PI sono più simili all'AR umana in termini di CD4- cellule T e citochine (cioè IL-6 e TNF-z) rispetto ai modelli della CIA. Al fine di aumentare l'effetto stimolante sul sito di riconoscimento TCR, i frammenti misti di polipeptide di G6PI (hGPI325-339 e hGPI469-483) sono stati utilizzati per immunizzare i topi DBA/1 per costruire il modello murino RA. Il tasso di successo di questo approccio può essere elevato perché hGPI325-339 e hGPI469-483 sono immunodominanti per le risposte delle cellule T con restrizioni I-A q. Pertanto, questo modello può simulare la proliferazione di CD4- cellule T e difetti cellulari iNKT nei pazienti RA22. La ricerca di base dell'immunopatologia dell'AR ha gettato le basi per la nostra ulteriore indagine approfondita.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZF</td>
			<td>BD</td>
			<td>563490</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PE MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>MS</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allegra&#174; X-15R</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D12731</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Center</td>
			<td>Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd.</td>
			<td>BMJ-1</td>
			<td>China</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Hamster Anti-Mouse TCR &#946; Chain</td>
			<td>BD</td>
			<td>553170</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#39;s complete adjuvant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F5881</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML)</td>
			<td>Karebay Biochem</td>
			<td>18062202</td>
			<td>China</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT)</td>
			<td>Karebay Biochem</td>
			<td>18062203</td>
			<td>China</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>caliper IVIS lumina II</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin Calcium</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10004974</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRN7000</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-CN2-0013</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD1d Tetramer-PE</td>
			<td>MBL</td>
			<td>TS-MCD-1</td>
			<td>Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse percoll</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P8620</td>
			<td>China</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus-II</td>
			<td>Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-&#978;t</td>
			<td>BD</td>
			<td>562683</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet</td>
			<td>BD</td>
			<td>561316</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertussis toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7208</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol esters</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10008014</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>555899</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-100-1ACS</td>
			<td>Israel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Th1/Th2/Th17 cytokines kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>560485</td>
			<td>America</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica EM UC6</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
	</tbody>
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adoptive immunotherapy of inkt cells in glucose-6-phosphate isomerase (g6pi)-induced ra mice

L'artrite reumatoide (RA) è una malattia autoimmune infiammatoria cronica complessa. La patogenesi della malattia è correlata alle cellule T (iNKT) killer naturali invarianti. I pazienti con RA attiva presentano meno cellule iNKT, funzione cellulare difettosa e polarizzazione eccessiva di Th1. In questo studio, è stato stabilito un modello animale RA utilizzando una miscela di peptidi hGPI325-339 e hGPI469-483. Le cellule iNKT sono state ottenute mediante induzione e purificazione in vitro, seguite da infusione nei topi RA per immunoterapia adottiva. Il monitoraggio del sistema di imaging in vivo (IVIS) ha rivelato che le cellule iNKT sono state distribuite principalmente nella milza e nel fegato. Il giorno 12 dopo la terapia cellulare, la progressione della malattia ha rallentato in modo significativo, i sintomi clinici sono stati alleviati, l'abbondanza di cellule iNKT nel timo è aumentata, la proporzione di iNKT1 nel timo è diminuita e i livelli di TNF-z, IFN-e IL-6 in il siero è diminuito. L'immunoterapia adottiva delle cellule iNKT ha ripristinato l'equilibrio delle cellule immunitarie e corretto l'eccessiva infiammazione del corpo.

Il punteggio dell'indice di artrite e lo spessore della zampa sono aumentati dopo la modellazione. Rispetto al gruppo di controllo, le dite del gruppo di modelli RA hanno cominciato a mostrare gonfiore rosso a 6 giorni dopo la modellazione, con graduale aggravamento. A 14 giorni, il gonfiore rosso nell'articolazione della caviglia ha raggiunto il picco, seguito da un graduale sollievo. Lo spessore della zampa è cambiato in modo analogo (P < 0,05) (Figura 1).
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Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

Questo protocollo utilizza peptidi misti G6PI per costruire modelli di artrite reumatoide che sono più vicini a quello dell'artrite reumatoide umana in CD4- cellule T e citochine. Cellule T killer naturali ad alta purezza (principalmente iNKT2) con fenotipi e funzioni specifiche sono state ottenute mediante induzione e purificazione in vitro per l'immunoterapia adottiva.

Immunoterapia adottiva delle cellule iNKT in isomerasi indotta da glucosio (G6PI)

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

Il nostro protocollo descrive un metodo per creare un modello RA. Il suo tasso di successo è superiore al 93% e la sua patogenesi dipende dalle cellule T, dalle cellule B e dall'immunità innata, che consente ai ricercatori di studiare meglio la patogenesi di RA da una prospettiva immunitaria globale. Quindi usiamo cellule INKT con effetti immunomodulatori per il loro trattamento.Le cellule INKT hanno un buon effetto sul trattamento con introduzione in vivo che forniscono supporto di base ai dati per l'applicazione clinica delle cellule INKT ed esplodono davvero il valore di applicazione clinica delle cellule INKT. Il più grande vantaggio di questa tecnologia è che è semplice da usare e facile da copiare. A dimostrare la procedura saranno Chen Shengde, Gao Xiang e Zhang Jingnan, studente laureato del mio laboratorio.Per iniziare, pesare da 1,75 milligrammi di frammenti da HGPI325 a 339 e da HGPI469 a 483 e scioglierli in 5,25 millilitri di acqua tripla distillata da 4 gradi Celsius. Sciogliere l'adiuvante di Freund completo in un bagno d'acqua di 50 gradi Celsius. Disegnare 5,25 millilitri in un altro tubo di centrifuga da 10 millilitri e raffreddarlo per l'uso.Mettere la miscela della soluzione HG6PI e della soluzione Adjuvant di Complete Freund in un'unità di emulsione artificiale con due siringhe di vetro, collegate. In un bagno di ghiaccio, spingere la siringa a una velocità e una frequenza costanti da dieci a venti volte al minuto per emulsionare completamente la soluzione peptidica della miscela e completare la soluzione adiuvante di Freund. Quindi, tenere le goccioline di emulsione nell'acqua per dieci minuti.Successivamente, iniettare 150 microlitri degli HG6PI emulsionati nella radice della coda del mouse per via sottocutanea. Immediatamente e dopo 48 ore, iniettare 200 milligrammi di tossina pertosse nel topo per via intraperineale. Ora, iniettare il normale topo DBA1 per via intraperineale senza il gausser al dosaggio di 0,1 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo.Tre giorni dopo la modellazione, dopo l'anestesia, isolare la milza del mouse. Preparare una sospensione a cella singola tagliando e macinando la milza in un setaccio a rete 200. Lavare le sospensioni cellulari con PBS.Centrifugare a 200 volte g per cinque minuti e scartare il supernatante. Sospendere di nuovo le cellule con un millilitro di soluzione di tessuto sanguigno intero. Aggiungere tre millilitri di mezzo di separazione dei linfociti di topo.E poi centrifugare le cellule per 20 minuti a 300 volte g a temperatura ambiente. Per purificare le cellule INKT, resuspend 10 alla settima cellule con 100 microlitri di quattro gradi Celsius PBS, aggiungere 10 microlitri di tetramero CD1 caricato da alpha gausser PE e incubarli a 4 gradi Celsius per quindici minuti al buio. Lavare le cellule due volte con PBS e riprenotarle in 80 microlitri di PBS.Aggiungere 20 microlitri di microperline anti-PE e incubarli a quattro gradi Celsius per venti minuti al buio. Lavarli due volte con PBS e rimorsi le cellule con 500 microlitri di PBS. Posizionare la colonna di smistamento nel campo magnetico dello smistatore MACS e risciacquare con 500 microlitri di PBS.Aggiungere la sospensione cellulare preparata alla colonna di ordinamento, raccogliere il flusso e risciacquare tre volte con il buffer PBS. Rimuovere il campo magnetico e aggiungere un millilitro di buffer PBS alla colonna di ordinamento. Spingere rapidamente lo stantuffo a una pressione costante per guidare le celle etichettate nel tubo di raccolta.E ottenere le cellule INKT purificate. Contare con un contatore di celle automatico. Per identificare il fenotipo della cellula INKT, in primo luogo, prendere una per dieci alla sesta cella dalle cellule INKT purificate e ripreposirle in 50 microlitri di PBS.Aggiungere 0,5 microlitri di tetramero ALFA GAUSSER PE CD1 o 10 microlitri di FITC TCR beta nel singolo tubo di controllo positivo. Aggiungere 0,5 microlitri di tetramero ALFA GAUSSER PE CD1, Aggiungere 10 microlitri di FITC TCR beta nel tubo campione. Incubarli a quattro gradi Celsius per trenta minuti al buio.Successivamente, lavare le cellule in PBS e quindi centrifugare a 200 volte g per cinque minuti. Scartare il supernatante e aggiungere un millilitro della soluzione di lavoro di permeabilità alla fissazione FoxP3. E incubare le cellule per 45 minuti a quattro gradi Celsius al buio.Quindi, aggiungere un millilitro di 1 soluzione di lavoro permeabilizzazione e centrifugare le cellule a 500 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti. Scartare il supernatante. Aggiungere un microlitro di AlexaFluor 647 mouse anti-PLZF e un microlitro di PerCP Cy5.5 mouse anti-Tbet e incubare per trenta minuti a temperatura ambiente al buio.Successivamente, aggiungere due microlitri di soluzione di lavoro tampone di permeabilizzazione e centrifugare a 200 volte g per cinque minuti per la pulizia. Scartare il supernatante. Rimospendare le cellule in 500 microlitri di PBS e misurare per citometria del flusso.In questo studio, rispetto al gruppo di controllo, le dita dei piedi del gruppo di modelli RA hanno iniziato a mostrare gonfiore rosso dopo la modellazione con aggravamento graduale. A 14 giorni, il gonfiore rosso nell'articolazione della caviglia ha raggiunto il picco seguito da un graduale sollievo. I risultati patologici mostrano che il grado di infiltrazione delle cellule infiammatorie nel tessuto sinoviale della caviglia dei topi modello RA era diverso in diversi stadi.L'infiammazione di picco si è verificata il giorno 14 dopo la modellazione. Nel gruppo di modelli RA, i livelli sieri delle citochine pro-infiammatorie sono aumentati significativamente 11 giorni e 14 giorni dopo la modellazione. Mentre le citochine antinfiammatorie sono diminuite significativamente.Questa cifra mostra che il tasso di INKT2 nei topi normali era di circa il cinque per cento. Il tasso di INK2 era di circa l'82% dopo l'induzione in vivo. Il tasso di INK2 è stato superiore al 92% dopo la purificazione MACS.Qui mostriamo un metodo per emulsionare il polipeptide maggiore che vediamo in RA. Le goccioline emulsionate vengono conservate in acqua per 10 minuti. I risultati si disperdono. Questo protocollo è un nuovo componente aggiuntivo per il trattamento delle cellule NKT speciali allevati ra.Che può essere applicato verso l'immunoterapia cellulare o altre malattie autoimmuni e tumori. Questo modello può stimolare la proliferazione complessiva delle cellule T CD4 e dei deficit delle cellule NKT nei pazienti con RA, che pone le basi per uno studio approfondito delle vie immunitarie RA. In questo protocollo, la tossina pertosse viene iniettata per via interperitoneale durante la modellazione.Si prega di indossare abiti sperimentali e guanti monouso. E portare tutti gli standard di funzionamento in modo da prevenire la pugnalata ferita un'infezione.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Metastasi sperimentale e CTL adottivi Immunoterapia modello di trasferimento del mouse

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

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While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Accelerated diabete di tipo 1 nei topi induzione trasferimento adottivo di cellule CD4 + T Cells diabetogenici

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

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Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Valutare lo sviluppo delle cellule murine plasmocitoidi dendritiche in placche del Peyer Utilizzando trasferimento adottivo di ematopoietiche Progenitori

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

Generazione di cellule CAR T per adottiva terapia nel contesto di Glioblastoma standard di cura

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Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induzione di Murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alto</sup&gt; T Cells in topi immunodeficienti

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Induzione di paralisi e di lesioni del sistema visivo in topi da specifiche cellule T per neuromielite ottica Autoantigen acquaporina-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generazione di anticorpi monoclonali umani discriminante da rari B antigene-specifiche cellule circolanti nel sangue

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Trasferimento adottivo stereotactic di citotossici cellule immunitarie nei modelli murini di xenotrapianti Multiforme di Glioblastoma umano ortotopico

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...