Name: dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration
Uploaded: 2019-10-03T14:00:00
Duration: 9 min 33 s
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हम राजा कॉलेज लंदन जैविक सेवा इकाई के लिए आभारी हैं, विशेष रूप से टिफ़नी जार्विस और Lynsey Cashnella उनके निरंतर समर्थन के लिए. हम सलाह और इस प्रोटोकॉल के प्रारंभिक स्थापना के दौरान अभिकर्मकों के साथ मदद के लिए डेरेक Stemple, Mamoru Ishii और रॉबर्ट Maxson धन्यवाद. हम STO कोशिकाओं के गामा विकिरण के साथ मदद के लिए धेराज ताहीम धन्यवाद. हम महान समर्थन के लिए लियू और Krause प्रयोगशालाओं, विशेष रूप से टॉमी Pallett, धन्यवाद. इस कार्य को बीबीएसआरसी (BB/R015953/1 से KJL/MK), एमआरसी डॉक्टरेट प्रशिक्षण कार्यक्रम (एलडी), न्यूलैंड पेडले फंड (एएलएम) और केआरआईपीआईएस द्वितीय, अनुसंधान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (जीएसआरटी), शिक्षा और धार्मिक मंत्रालय से एक छात्र के लिए अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। मामलों, ग्रीस और Fondation सेंट (SGGM करने के लिए).

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लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है.

स्तनधारी तंत्रिका शिखर कोशिकाओं का अध्ययन स्तनधारी विकास के utero प्रकृति की वजह से वैज्ञानिकों के लिए एक चुनौती रहा है. विवो अध्ययन में स्थापित करने के लिए मुश्किल है, के रूप में भ्रूण शर्तों है कि गर्भाशय में जीवन की नकल के तहत हेरफेर किया जाना चाहिए. व्यवहार में, यह reproducibly संस्कृति इन (E8+) भ्रूण 24 एच से अधिक समय के लिए, विशेष रूप से लाइव इमेजिंग के लिए लगभग असंभव है. इसके अलावा, तंत्रिका शिखर प्रेरण और प्रवास एक साथ तंत्रिका ट्यूब बंद करने और माउस में भ्रूण मोड़ के साथ होते हैं; यह एक महत्वपूर्ण और तनावपूर्ण morphogenetic घटना है, जो अक्सर विफल रहता है जब भ्रूण सुसंस्कृत पूर्व uteroहैं. इस प्रकार, पूर्व utero दृष्टिकोण की सफलता दर आम तौर पर कम है. अमर नेकां कोशिकाओं का उपयोग21 पशु उपयोग को कम करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है और यह लंबी अवधि के विश्लेषण, transfection, और संवर्धन अध्ययन के लिए तंत्रिका शिखर कोशिकाओं का एक बेहतर स्रोत प्रदान कर सकते हैं. हालांकि, वहाँ स्पष्ट रूप से मज़बूती से प्राथमिक तंत्रिका शिखर कोशिकाओं संस्कृति की जरूरत है. हमारी विधि माउस नॉक आउट या सशर्त आनुवंशिक मॉडल के लिए लागू है. हमारे लिए एक तुलनीय विधि अन्य तंत्रिका शिखर आबादी20के लिए वर्णित किया गया है ; हालांकि, हमारी विधि अच्छी तरह से murine कपाल नेकां कोशिकाओं के कदम दर कदम अलगाव का वर्णन करता है. हम विभिन्न मैट्रिक्स के उपयोग के साथ-साथ विस्तार से माइग्रेशन विश्लेषण प्रक्रिया का भी वर्णन करते हैं।
लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए, हमने पाया कि भ्रूण के चयन के दौरान मंचन की दिशा में विशेष ध्यान दिया. आश्चर्य नहीं कि सोमियों की संख्या कपाल नेकां के विकास में विभिन्न चरणों से संबंधित है। इसलिए, भ्रूण शरीर रचना विज्ञान का ज्ञान किसी भी प्रयोगात्मक डेटा प्राप्त करने से पहले बहुत महत्वपूर्ण है. इस दृष्टिकोण तो तंत्रिका शिखर कोशिकाओं के असतत आबादी अलग करने की दिशा में अनुकूलित किया जा सकता है, जैविक सवाल और लक्ष्य कोशिकाओं पर निर्भर करता है.
एक बार भ्रूण का चयन किया और विच्छेदन कर रहे हैं, mesodermal कोशिकाओं को आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है और बेहतर दृश्य की अनुमति देने के लिए और संदूषण को कम करने के लिए हटाया जाना चाहिए. लंबी अवधि की संस्कृतियों के लिए, तंत्रिका प्लेट ऊतक तंत्रिका ऊतकों द्वारा संदूषण को रोकने के क्रम में चढ़ाना के 24 एच पर हटाया जा सकता है। एक और शोधन फ्लोरोसेंट वंश लेबलिंग का उपयोग हो सकता है (उदाहरण के लिए, एक Wnt1 का उपयोग कर::cre या Sox10::creERT ड्राइवरों फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ संयुक्त24,25) तंत्रिका शिखर कोशिकाओं से भेद करने के लिए चित्र 2Cमें दर्शाए अनुसार अन्य ऊतक।
पिछली रिपोर्ट विभिन्न matrices पर माउस नेकां explant संस्कृतियों चढ़ाना की क्षमता पर प्रकाश डाला है, सबसे अधिक वाणिज्यिक ECM hydrogels पर, fibronectin और कोलेजन मैं20,21,26. हमारे हाथों में, माउस कपाल नेकां explant संस्कृतियों सफलतापूर्वक सभी तीन matrices पर बड़े हो रहे हैं, मूल रिपोर्ट में निर्दिष्ट सांद्रता पर (डेटा नहीं दिखाया). प्रारंभिक परिष्कृत दृष्टिकोण हम अपने नेकां explant संस्कृतियों के लिए अनुकूलित पसंद के मैट्रिक्स के रूप में एक वाणिज्यिक hydrogel इस्तेमाल किया, जो मुख्य रूप से लेमिन और कोलेजन से मिलकर21(चित्र 3ए-बी). हालांकि, इस hydrogel की संरचना स्पष्ट रूप से परिभाषित नहीं है, अज्ञात विकास कारक और प्रोटीन सामग्री के साथ. जैसे, हम के बाद से फाइब्रोनेक्टिन पर माउस नेकां explant संस्कृतियों चढ़ाना करने के लिए हमारे दृष्टिकोण स्थानांतरित कर दिया है (चित्र 3सी-डी). फाइब्रोनेक्टिन अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है और अत्यधिक ईसीएम और तहखाने झिल्ली में व्यक्त किया जाता है जिसके साथ नेकां कोशिकाएं माइग्रेट करती हैंin vivo28,29,30. एक फाइब्रोनेक्टिन मैट्रिक्स का अनुकूलन करने के लिए जो सबसे अच्छा न्यूरल शिखर सेल प्रवास और आकृति विज्ञान को प्रतिरूपक बनाता है जैसा कि हाइड्रोजेल का उपयोग करते हुए देखा गया है, हमने नेकां सेल व्यवहार की तुलना हाइड्रोजेल पर 0.25-30 ग्राम/एमएल फाइब्रोनेक्टिन के लिए किया गया है, और परिभाषित 1 g/ आदर्श गुण प्रदान (डेटा नहीं दिखाया गया). हमें विश्वास है कि इस प्रारंभिक काम में मदद मिल सकती है matrices की व्यवस्थित तुलना के लिए एक रूपरेखा स्थापित, ऐसे fibronectin के रूप में, उन पहले से वर्णित के खिलाफ, अर्थात् कोलेजन और laminin32,33,34. यह विशेष रूप से फाइब्रोनेक्टिन बनाम कोलेजन मैं पर माउस नेकां सेल प्रवासी क्षमता की तुलना करने के लिए दिलचस्प होगा, यह देखते हुए कि कोलेजन-IA1 अंतर्जात माउस, एवियन और मानव नेकां कोशिकाओं द्वारा स्रावित होता है28,30,31,32. कोलेजन मैं इसलिए मैट्रिक्स पसंद के विचार में fibronectin के रूप में के रूप में प्रासंगिक है. यह भी स्वीकार करने योग्य है कि मीडिया में विकास कारकों की जैव उपलब्धता विभिन्न मैट्रिक्स घटकों द्वारा बदला जा सकता है, विशेष रूप से हमारे मीडिया के उच्च सीरम सामग्री दी. इस पर काबू पाने के लिए, हम वर्तमान में सीरम मुक्त परिभाषित संस्कृति की स्थिति का उत्पादन काम कर रहे हैं. इन परिभाषित मीडिया सफलतापूर्वक pluripotent स्टेम सेल क्षेत्र में तंत्रिका शिखर प्रेरण प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है, लेकिन हमारे नेकां explant संस्कृति प्रणाली के लिए आगे अनुकूलन की आवश्यकता33,34. हमारा काम हृदय और ट्रंक नेकां जैसे अन्य प्रकार की नेकां कोशिकाओं के लिए स्थिति को परिष्कृत करने के लिए और नेकां भेदभाव के बाद के अध्ययनों के लिए भी एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में काम कर सकता है। सबसे महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए कपाल नेकां कोशिकाओं के अलगाव की अनुमति देता है. हम निर्देशित प्रवास, 3-डी प्रवास और आक्रमण पर अध्ययन की कल्पना करते हैं। इस तरीके से अलग कोशिकाओं का इलाज किया जा सकता हैin vitroविश्लेषण के एक नंबर के लिए. उदाहरण के लिए, कोशिकाओं को आसानी से विशिष्ट प्रोटीन को लक्षित करने के लिए विभिन्न छोटे अणुओं का उपयोग कर इलाज किया जा सकता है, वे निर्धारित समय बिंदुओं पर इलाज किया जा सकता है, और washout प्रयोगों सेल व्यवहार की वसूली निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है (चित्र 4). transfection और भेदभाव परख के लिए लंबी अवधि की संस्कृति संभव है, साथ ही कोशिकाओं के पारित होने (डेटा नहीं दिखाया). तथापि, व्यवहार्यता, सेल नवीकरण और multipotency की क्षमता passaging के बाद मान्य किया जाना चाहिए. ग्लास कवरलिप्स पर चढ़ाया कोशिकाओं को भी लाइव इमेजिंग के बाद, इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, इस दृष्टिकोण आनुवंशिक माउस मॉडल से नेकां के प्रवास का अध्ययन करने के लिए एक काफी शक्तिशाली प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है22,23,24,25.

तंत्रिका शिखर (एनसी) वंश कोशिकाओं की एक क्षणिक, बहुशक्ति और प्रवासी आबादी है जो प्रारंभिक भ्रूण विकास1,2के दौरान विशेष रूप से कशेरुकियों में दिखाई देती है . तंत्रिका शिखर डेरिवेटिव अत्यंत विविध होते हैं, और ग्लिया, चिकनी मांसपेशियों, मेलेनोसाइट्स, न्यूरॉन्स और craniofacial हड्डी और उपास्थि3,4शामिल हैं। क्योंकि तंत्रिका शिखर कई अंग प्रणालियों के समारोह में योगदान देता है, इस वंश मानव भ्रूणजनन के लिए आवश्यक है. Aberrant नेकां विकास सबसे आम मानव जन्म दोष की एक विस्तृत श्रृंखला में फंसा या नहीं है (यानी, फांक होंठ और तालू)5, और भी इस तरह के Hirschsprung रोग (HSCR), वार्डनबर्ग सिंड्रोम (WS), CHARGE सिंड्रोम और विलियम्स सिंड्रोम 6 के रूप में विकारों ,7,8,9.
नेकां विकास Xenopus,लड़की और ज़ेब्राफ़िश मॉडल सहित गैर-मलेरियन मॉडल प्रणालियों की एक संख्या में पता लगाया गया है। स्तनधारियों में, माउस मॉडल में काम तंत्रिका शिखर विकास अंतर्निहित प्रमुख आनुवंशिक घटनाओं में से कुछ की पहचान की है; हालांकि, यह अधिक कठिन हो गया है तंत्रिका शिखर प्रवास की कोशिका जीव विज्ञान का पालन करें, माउस भ्रूण की अगम्यता के कारण (कहीं और10,11की समीक्षा की). इसके अलावा, जबकि लड़की में अध्ययन, Xenopus और ज़ेब्राफ़िश नेकां के लिए एक जीन नियामक नेटवर्क की स्थापना की है, इन पशु मॉडल में समारोह के अध्ययन के नुकसान कभी कभी माउस में एक तुलनीय phenotype प्रदर्शन नहीं करते. उदाहरण के लिए, Xenopuएस, ज़ेब्राफ़िश और लड़की में, गैर-कैनोनिकल Wnt संकेतन सेलुलर तंत्र है कि नेकां अपनी प्रवासी क्षमता प्राप्त करने की अनुमति देता है में से एक है12,13,14,15 . हालांकि, माउस में, गैर-कैनोनिकल Wnt संकेतन की हानि प्रवास16को प्रभावित करने के लिए प्रतीत नहीं होता है। विवो नेकां प्रवास में के रूप में माउस में लंबी अवधि के लिए ट्रैक करने के लिए मुश्किल हो गया है, यह स्पष्ट नहीं है कि क्या इन प्रजातियों मतभेद प्रवास के भिन्न तरीकों को प्रतिबिंबित, या आणविक विनियमन में मतभेद.
के रूप में उल्लेख किया, माउस में नेकां अध्ययन बहुत चुनौतीपूर्ण है क्योंकि भ्रूण के पूर्व utero संस्कृति कठिन है. इसके अलावा, नेकां लगातार मध्यजर्म और न्यूरेक्टोडरम जैसे आसन्न ऊतकों के साथ अंतरंग संपर्क में है। तंत्रिका शिखर-विशिष्ट क्रे ड्राइवरों या exogenous रंगों के हाल ही में उपयोग हमें फ्लोरोसेंट प्रवासी नेकां लेबल करने के लिए अनुमति दी गई है; हालांकि, इन दृष्टिकोण अभी भी सीमित हैं. नेकां प्रवास17,18की कल्पना करने के लिए विभिन्न तकनीकों का वर्णन करने वाली अनेक रिपोर्टों के बावजूद इन तकनीकों को एक सरल और नियमित प्रक्रिया में हल करना कठिन रहा है .
यह स्पष्ट है कि वहाँ तकनीक है कि हैंडलिंग और स्तनधारी नेकां की विशेषता की अनुमति के लिए एक की जरूरत है. हम माउस कपाल नेकां पर हमारे प्रयासों ध्यान केंद्रित के रूप में यह मानव craniofacial विकास और neurocristopathies के अध्ययन के लिए प्राथमिक मॉडल है. हमने नेकां कोशिकाओंकीप्राथमिक संस्कृति का वर्णन करने वाली अनेक रोचक रिपोर्टों के आधार पर अपने दृष्टिकोण को परिष्कृतकिया. यहाँ, हम अच्छी तरह से प्राथमिक नेकां कोशिकाओं explanting के लिए इष्टतम संस्कृति तकनीकों का वर्णन. हम लाइव सेल इमेजिंग विधि और संस्कृति प्लेटों कोट करने के लिए विभिन्न matrices के इष्टतम उपयोग का प्रदर्शन. हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक उल्टे माइक्रोस्कोप, जो अन्य माइक्रोस्कोप के साथ उपयोग के लिए एक दिशानिर्देश के रूप में करना है, साथ ही हमारे सेलुलर विश्लेषण का एक विस्तृत सारांश का उपयोग कर रहते नेकां कोशिकाओं के प्रवास पर कब्जा करने के लिए.
एक्सप्लांट से अपेक्षित परिणाम उन कोशिकाओं का एक खूबसूरती से निर्धारित वितरण होना चाहिए जो सूक्ष्मदर्शी के नीचे स्पष्ट रूप से प्रतिष्ठित हैं, जहां एक कोशिकाओं की तीन अलग-अलग आबादी को देख सकता है जो (i) तंत्रिका प्लेट का प्रतिनिधित्व करते हैं, (ii) पूर्वप्रवास, और, (पप) प्रवासी तंत्रिका शिखर कोशिकाओं. हम उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण के दौरान कोशिकाओं की premigratory आबादी की सीमा पर सेल व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए कैसे प्रदर्शित करते हैं। हम भी सेल गति, दूरी और कोशिका आकारिकी के लिए पूरी तरह से प्रवासी कोशिकाओं का अध्ययन करने पर हमारे प्रयास ध्यान केंद्रित किया.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td>25cm2 culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (4500 mg/L glucose)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (dPBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>E/0650DF/C17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TFS AA 10-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (ES Cell FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079/16141-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from bovine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottomed, multi-well 24-well tissue culture plate</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>82406</td>
			<td>Glass-bottomed, No 1.5, 24-well tissue culture dish with black sides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell migration analysis tool</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>v2.0</td>
			<td>Manuals for this software can be found at: https://ibidi.com/manual-image-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circularity Plug-in</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>v1.29 or later</td>
			<td>The circularity plug-in is an extended version of ImageJ/Fiji&#8217;s Measure command, designed by Rasband, W., (2000) (wsr@nih.gov).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td>ESGRO by Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Cell Tracking Plug-in</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>v1.34k or later</td>
			<td>ref Cordelieres F. Institut Curie, Orsay (France) 2005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Image Analysis Software</td>
			<td>Universal Imaging Corporation</td>
			<td>6.3r7</td>
			<td>MetaMorph Software Series 6.3r7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential aminoacids 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (ECM-based Hydrogel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1X81</td>
			<td>Olympus 1X81 inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>512B</td>
			<td>Photometrics Cascadell 512B camera (4x UPlanFL N, 10x UPlanFL N, 20x UPlanFL N, 40x UPlanFL N objectives)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope controller</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1X2-UCB</td>
			<td>Olympus 1X2-UCB microscope controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope temperature controller</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>RS232</td>
			<td>Maintained at 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistics software</td>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>v7.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STO feeder cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY microscope stage controller</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>MS-4400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration

पिछले कई दशकों में मानव रोगों की नकल करने के लिए इस्तेमाल आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल की उपलब्धता में वृद्धि हुई है। हालांकि, कोशिका आंदोलनों और विवो में भेदभाव का अध्ययन करने की क्षमता अभी भी बहुत मुश्किल है. न्यूरोक्रिस्टोपैथीज, या तंत्रिका शिखर वंश के विकार, विशेष रूप से प्रमुख भ्रूण चरणों की पहुंच की कमी और आसन्न मेसोडरमल मेसेन्काइम से तंत्रिका शिखर मेसेन्काइम को अलग करने में कठिनाइयों के कारण अध्ययन करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं। यहाँ, हम प्राथमिक कपाल तंत्रिका शिखर कोशिकाओं की संस्कृति के लिए एक अच्छी तरह से परिभाषित, नियमित प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए बाहर सेट. हमारे दृष्टिकोण में हम प्रारंभिक तंत्रिका शिखर प्रेरण चरण के दौरान माउस तंत्रिका प्लेट सीमा बाहर विच्छेदन. तंत्रिका प्लेट सीमा क्षेत्र explanted और सुसंस्कृत है. तंत्रिका शिखर कोशिकाओं तंत्रिका प्लेट सीमा के आसपास एक उपकला शीट में फार्म, और द्वारा 24 एच explant के बाद, delaminate करने के लिए शुरू, एक उपकला-मेसेन्काइमल संक्रमण (EMT) के दौर से गुजर पूरी तरह से गतिशील तंत्रिका शिखर कोशिकाओं बनने के लिए. हमारे दो आयामी culturing दृष्टिकोण के कारण, अलग ऊतक आबादी (न्यूरल प्लेट बनाम premigratory और प्रवासी तंत्रिका शिखर) आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. लाइव इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम तो तंत्रिका शिखर प्रेरण, EMT और प्रवासी व्यवहार में परिवर्तन की पहचान कर सकते हैं. आनुवंशिक उत्परिवर्ती के साथ इस तकनीक का संयोजन सामान्य और रोग तंत्रिका शिखर कोशिका जीव विज्ञान को समझने के लिए एक बहुत शक्तिशाली दृष्टिकोण होगा.

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Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

इस प्रोटोकॉल विच्छेदन और माउस मॉडल से कपाल तंत्रिका शिखर कोशिकाओं की संस्कृति का वर्णन, मुख्य रूप से सेल प्रवास के अध्ययन के लिए. हम लाइव इमेजिंग तकनीकका इस्तेमाल किया और गति और सेल आकार परिवर्तन के विश्लेषण का वर्णन.

तंत्रिका क्रेस्ट सेल Delamination और प्रवास के अध्ययन के लिए माउस से प्राथमिक कपाल तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं का विच्छेदन, संस्कृति और विश्लेषण

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

यह अच्छी तरह से परिभाषित प्रोटोकॉल स्तनधारियों में प्राथमिक तंत्रिका क्रेस्ट माइग्रेशन को देखता है। हम जन्म दोषों का अध्ययन करने के लिए प्राथमिक तंत्रिका क्रेस्ट माइग्रेशन का उपयोग करते हैं जो तंत्रिका शिखा को प्रभावित करते हैं। यह दृष्टिकोण हमें तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं को करीब से देखने की अनुमति देता है क्योंकि वे तंत्रिका प्लेट से बाहर निकलते हैं।उत्परिवर्ती जीन लुभाना या दवा उपचार के बाद ले जाने के ऊतकों में सेल व्यवहार के लिए परीक्षण, भ्रूण के विकास के दौरान दवा उपचार या पर्यावरण परिवर्तन के प्रभाव के लिए स्वास्थ्य स्क्रीनिंग की अनुमति देता है । इसी तरह के दृष्टिकोण का उपयोग तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जो दिल या आंत में स्थानांतरित होते हैं या मेटास्टैटिक ट्यूमर कोशिकाओं का अध्ययन करते हैं। भ्रूण सही की शारीरिक रचना अनुमान लगाना चुनौतीपूर्ण है ।प्रारंभिक विकास के दौरान इसके ऊतक बहुत तेजी से बदलते हैं। हम एक बड़ा प्रयोग करने से पहले माइक्रोडिसेक्शन का अभ्यास करने का सुझाव देते हैं। क्योंकि भ्रूण जीवित है और तीन आयामी, गति और परिशुद्धता महत्वपूर्ण हैं ।भ्रूणीय दिन 8.5 पर, बर्फ ठंडे PBS के एक कंटेनर में गर्भाशय फसल के लिए बाँझ उपकरण और समाधान का उपयोग करें। प्रत्येक भ्रूण को अलग करने के लिए मेसोमट्रियम काटें। प्रत्येक दशकीय सूजन को अलग करते हुए, गर्भाशय को सावधानी से विच्छेदन करें।सही विकास के चरण में भ्रूण की कटाई परिवर्तनशीलता को कम करने और मैट्रिक्स के साथ-साथ सेल माइग्रेशन के लिए एक्सप्लांट के आसंजन में सफलता बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है। मांसपेशी परत और भ्रूण के डिकिडुअल ऊतक के बीच स्लाइड संदंश और मांसपेशियों की परत को हटाने के लिए संदंश की एक दूसरी जोड़ी का उपयोग करें। मेकुछीय पुल के किनारों पर डेसिडुआ को छेदने के लिए संदंश का उपयोग करें और ऊतक को खींचने के लिए लंबवत रूप से फाड़ने के लिए संदंश की दूसरी जोड़ी का उपयोग करें।झिल्ली को ध्यान से हटाने से पहले रिकार्ट झिल्ली की कल्पना करने के लिए संदंश के साथ डिकिडुअल ऊतक को वापस छीलें। आंत की जर्दी साक दिखाई देगा और भ्रूण अंदर देखा जाएगा। आंत जर्दी साक और एनियन को हटा दें, और भ्रूण को सिर के गुना के दृश्य की अनुमति देने के लिए स्थिति दें।दिल के ऊपर सिर गुना काटें और एक साफ तंत्रिका प्लेट प्राप्त करने के लिए अंतर्निहित मेसोडर्म को दूर करें। तंत्रिका प्लेट सीमाओं तो विच्छेदित किया जाना चाहिए । एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, विच्छेदित तंत्रिका प्लेट को वातानुकूलित तंत्रिका क्रेस्ट माध्यम से भरे हाइड्रोजेल लेपित पकवान पर स्थानांतरित करें और धीरे-धीरे कुएं के बीच में तंत्रिका प्लेट को स्थिति में रखने के लिए पकवान को घूमता है।फिर उचित प्रायोगिक समय अवधि के लिए तंत्रिका प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेट करें। 24 घंटे के बाद explanting, एक चेहरा विपरीत माइक्रोस्कोप के नमूना धारक में ऊतक संस्कृति पकवान जगह है, और थाली ढक्कन और कार्बन डाइऑक्साइड सुई नीचे टेप बहु अच्छी तरह से अधिग्रहण के दौरान मिलाते हुए रोकने के लिए । फिर चयनित कंडेनसर में मिलान चरण की अंगूठी के साथ 10 गुना आवर्धन पर कपाल तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करें।तंत्रिका क्रेस्ट सेल प्रवासी क्षमता की मात्रा निर्धारित करने के लिए, माइक्रोस्कोप सेट करने के लिए एक 10 बार आवर्धन पर हर पांच मिनट में एक फ्रेम प्राप्त करने के लिए । सेल आकृति विज्ञान की मात्रा निर्धारित करने के लिए, माइक्रोस्कोप को 40 गुना आवर्धन पर प्रति मिनट एक फ्रेम प्राप्त करने के लिए सेट करें। लैमेलिपोडिया गतिशीलता की मात्रा निर्धारित करने के लिए, माइक्रोस्कोप को 40 गुना आवर्धन पर 10 मिनट के लिए हर 10 सेकंड में एक फ्रेम प्राप्त करने के लिए सेट करें।बहु-अच्छी इमेजिंग के लिए, चयनित एक्स, ब्याज की वाई पदों के बीच स्थानांतरित करने के लिए यांत्रिक चरण निर्धारित करें, और पुष्टि करें कि कपाल तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाएं ध्यान में हैं और चरण की स्थिति सही है। फिर समय चूक इमेजिंग शुरू करने के लिए अधिग्रहण पर क्लिक करें। सिंगल सेल ट्रैकिंग के लिए इमेज जे खोलें और टिफ स्टैक फाइल्स के रूप में डेटा इम्पोर्ट करें।ओरिएंटेशन और ब्राइटनेस और कंट्रास्ट लेवल को बदलें और माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के मुताबिक पिक्सल माइक्रोमीटर में डॉट एसटीके फाइल्स को कैलिब्रेट करने के लिए एनालिसिस और सेट स्केल पर क्लिक करें । इमेज जे मैनुअल सेल ट्रैकिंग प्लगइन खोलने के लिए प्लग-इन, ट्रैकिंग और मैनुअल ट्रैकिंग पर क्लिक करें और सेल ट्रैकिंग शुरू करने के लिए ऐड ट्रैक का चयन करें। फिर एक संदर्भ बिंदु के रूप में नाभिक का उपयोग कर समय चूक फिल्मों के सभी फ्रेम के माध्यम से कोशिकाओं को ट्रैक।तंत्रिका क्रेस्ट प्रवासी क्षमता का आकलन करने के लिए, एक उपयुक्त माइग्रेशन विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम खोलें और एक डॉट टीएक्सटी फाइल के रूप में सेल ट्रैकिंग डेटा आयात करने के लिए आयात डेटा टैब पर क्लिक करें। डेटा सेट और आरंभीकरण के तहत, विश्लेषण किए जाने वाले स्लाइस या फ्रेम की संख्या का चयन करें और फ्रेम के बीच एक्स वाई अंशांकन और समय अंतराल सेट करें। सेटिंग को सेव करने के लिए अप्लाई सेटिंग ्स का चयन करें।फिर प्रक्षेपवक्र भूखंड बनाने के लिए भूखंड डेटा प्रतीक का चयन करें और दूरी और गति उपायों की मात्रा निर्धारित करने के लिए सांख्यिकीय प्रतीक का चयन करें। तंत्रिका क्रेस्ट सेल क्षेत्र और परिपत्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए, छवि जम्मू खोलें और विश्लेषण और माप सेट के तहत, सेल आकार मापदंडों, सेल क्षेत्र, परिधि और आकार वर्णनकर्ता का चयन करने के लिए क्लिक करें। गाइड के रूप में सेल झिल्ली सीमाओं का उपयोग करके प्रत्येक सेल के चारों ओर मैन्युअल रूप से एक रूपरेखा आकर्षित करने के लिए मुक्त हाथ चयन उपकरण का उपयोग करें।कीबोर्ड पर प्रेस कंट्रोल + बी कुंजी छवि पर सेल रूपरेखा ओवरले बनाए रखने और प्रत्येक समय चूक सीमा पर प्रत्येक सेल के लिए दोहराने के लिए । इमेज ओवरले पर क्लिक करें और इंटरेस्ट मैनेजर तक पहुंचने और ब्याज की कोशिकाओं का चयन करें। फिर ब्याज के चयनित सेल आकार मापदंडों के लिए मूल्यों को प्राप्त करने के लिए उपाय पर क्लिक करें।एक्सप्लांट और संस्कृति के 24 घंटे के भीतर, पूर्व प्रवासी एपिथेलियल कपाल तंत्रिका शिखा का एक क्षेत्र स्पष्ट रूप से तंत्रिका प्लेट एक्सप्लांट के आसपास देखा जा सकता है। इसके अलावा, तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं की एक उप-आबादी मेसेंकिमल संक्रमण के लिए एपिथेलियल से गुजरी होगी और पूरी तरह से मेसेंकिमल दिखाई देगी। एक्सप्लांट संस्कृतियों को या तो एक अतिरिक्त मैट्रिक्स आधारित हाइड्रोजेल या फाइब्रोनेक्टिन पर चढ़ाया जाता है, इसी तरह की एक्सप्लांट संरचनाएं बनाती हैं जिनमें तंत्रिका प्लेट प्रीमिग्रेटरी न्यूरल क्रेस्ट और प्रवासी तंत्रिका क्रेस्ट सेल आबादी शामिल हैं।हालांकि फाइब्रोनेक्टिन पर चढ़ाया गया एक्सप्लांट सेल लीडिंग एज में अधिक प्रमुख लैमेलिपोडिया के साथ कोशिकाओं का उत्पादन करता है जो माइग्रेशन की दिशा में अधिक ध्रुवीकृत होता है। समय चूक माइक्रोस्कोपी एक्स की ट्रैकिंग, वाई व्यक्तिगत कोशिकाओं के निर्देशांक और तंत्रिका क्रेस्ट सेल माइग्रेशन के विश्लेषण और समय के साथ कपाल तंत्रिका क्रेस्ट सेल आकृति विज्ञान गतिशीलता के विश्लेषण की अनुमति देता है। व्यक्तिगत कोशिका झिल्ली को रेखांकित करके, सेल क्षेत्र और परिधि माप की गणना फिल्मों के सभी फ्रेम से की जा सकती है ताकि कोशिका क्षेत्र के बाद के मात्राकरण और व्यक्तिगत और कोशिकाओं के समूहों की गोलाकारता की अनुमति दी जा सके।ध्यान दें कि जैसे ही कोशिकाएं एक्सप्लांट से दूर चली जाती हैं, कोशिका क्षेत्र काफी बढ़ जाता है जबकि कोशिकाओं की परिपत्रता अपेक्षाकृत स्थिर रहती है, यह सुझाव देते हुए कि कोशिकाएं एपिथेलियल किनारे से विदा होती हैं और सेल संपर्कों को सेल खो देती हैं, वे सेल स्प्रेड एरिया को बढ़ाते हुए दिखाती हैं। एक साफ तंत्रिका प्लेट प्राप्त करने के लिए अंतर्निहित मेसोडर्म को दूर करने पर विशेष ध्यान दें, क्योंकि यह ऊतक से दूर तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं के प्रवास को बढ़ावा देता है। संस्कृति कोशिकाओं की विभिन्न आबादी के बीच विभिन्न प्रोटीन या रुचि के जीन का विश्लेषण करने के लिए इम्यूनोस्टेपिंग, आरटीपीसीआर या एकल कोशिका विश्लेषण जैसी कई अन्य तकनीकों का प्रदर्शन किया जा सकता है।हम कुछ प्रमुख न्यूरोब्लास्टोमा जीन है कि तंत्रिका शिखा सेल प्रवास में शामिल किया जा सकता है और मानव रोग जीन का अध्ययन करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करने में विकास के रोल में रुचि रखते हैं ।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

चिकजीएफपी न्यूरल ट्यूब ग्राफ्टिंग और कार्बोसाइन डाई डीआईआई इंजेक्शन का उपयोग करके चिकन भ्रूण के भीतर तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं और रक्त वाहिकाओं की दोहरी लेबलिंग

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

सीरम मुक्त Monolayer संस्कृति में माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं के तंत्रिका भेदभाव

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

बेसिक और preclinical अनुसंधान के लिए एक संलग्न सेल संस्कृति प्रणाली में मानव pluripotent और तंत्रिका स्टेम सेल संवर्धन

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

विकास में रीयल-टाइम कल्पना करने के लिए बहु फोटॉन समय चूक इमेजिंग: Zebrafish भ्रूण में न्यूरल क्रेस्ट कोशिकाओं पलायन का दृश्य

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

मानव तंत्रिका प्रणेता कोशिकाओं में Neurodevelopmental Phenotypes का तेजी से पता लगाने (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Immunocytochemical विश्लेषण के लिए प्रसंस्कृत मानव भ्रूण मस्तिष्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के Zika वायरस संक्रमण

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

परिधीय मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से प्रेरित तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का उत्पादन और प्रत्यारोपण अध्ययन के लिए डोपामाइनर्जिक न्यूरोन Precursors की ओर भेदभाव

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

मानव भ्रूण स्टेम सेल के एकल सेल संस्कृति का उपयोग कर कुशल तंत्रिका भेदभाव

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

पेरियाऑर्टिक एडीपोज ऊतक से न्यूरल क्रेस्ट मूल आदिपोज-व्युत्पन्न स्टेम सेल का अलगाव, संस्कृति और एडिपोजेनिक प्रेरण

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

माउस भ्रूणस्टेम कोशिकाओं से तंत्रिका जनक और न्यूरॉन्स का भेदभाव और लक्षण वर्णन

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...