Name: dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration
Uploaded: 2019-10-03T14:00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration at JoVE.com

Мы благодарны Отделу биологических услуг Королевского колледжа Лондона, особенно Тиффани Джарвис и Линси Кашнелла за их постоянную поддержку. Мы благодарим Дерека Стэмтемпа, Мамору Исии и Роберта Макссона за советы и помощь с реагентами во время первоначального создания этого протокола. Мы благодарим Dheraj Taheem за помощь в гамма-облучении клеток STO. Мы благодарим лаборатории Лю и Краузе, особенно Томми Паллетт, за большую поддержку. Эта работа финансировалась за счет грантов от BBSRC (BB/R015953/1 для KJL/MK), студентов из MRC Докторская программа обучения (LD), Ньюленд Педли фонд (ALM) и KRIPIS II, Генеральный секретариат исследований и технологий (GSRT), Министерство образования и религии Дела, Греция и Фонд Санте (в SGGM).

<ol>
	<li>Duband, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+the+molecular+and+cellular+strategies+of+epithelium-to-mesenchyme+transitions:+Insights+from+the+neural+crest.">Diversity in the molecular and cellular strategies of epithelium-to-mesenchyme transitions: Insights from the neural crest.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 4, 458-482 (2010).</li><li>Mayor, R., Carmona-Fontaine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+in+touch+with+contact+inhibition+of+locomotion.">Keeping in touch with contact inhibition of locomotion.</a> Trends in Cell Biology. 20, 319-328 (2010).</li><li>Le Douarin, N., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The neural crest. 2nd edn. , (1999).</li><li>Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Crest Cells : Evolution, Development, and Disease. , (2014).</li><li>Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+upper+lip:+morphogenetic+and+molecular+mechanisms.">Development of the upper lip: morphogenetic and molecular mechanisms.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 235, 1152-1166 (2006).</li><li>Ahola, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+incidence+of+Hirschsprung's+disease+in+patients+with+hypoplastic+left+heart+syndrome--a+common+neural+crest-derived+etiology?.">Increased incidence of Hirschsprung's disease in patients with hypoplastic left heart syndrome--a common neural crest-derived etiology?.</a> Journal of Pediatric Surgery. 44, 1396-1400 (2009).</li><li>Bajpai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHD7+cooperates+with+PBAF+to+control+multipotent+neural+crest+formation.">CHD7 cooperates with PBAF to control multipotent neural crest formation.</a> Nature. 463, 958-962 (2010).</li><li>Inoue, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+hypomyelinating+neuropathy,+central+dysmyelination,+and+Waardenburg-Hirschsprung+disease:+phenotypes+linked+by+SOX10+mutation.">Congenital hypomyelinating neuropathy, central dysmyelination, and Waardenburg-Hirschsprung disease: phenotypes linked by SOX10 mutation.</a> Annals of Neurology. 52, 836-842 (2002).</li><li>Kim, H., Kang, K., Ekram, M. B., Roh, T. Y., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aebp2+as+an+epigenetic+regulator+for+neural+crest+cells.">Aebp2 as an epigenetic regulator for neural crest cells.</a> PloS one. 6, e25174 (2011).</li><li>Barriga, E. H., Trainor, P. A., Bronner, M., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+studying+neural+crest+development:+is+the+mouse+different?.">Animal models for studying neural crest development: is the mouse different?.</a> Development. 142, 1555-1560 (2015).</li><li>Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evolution+of+the+neural+crest:+an+overview.">Development and evolution of the neural crest: an overview.</a> Developmental Biology. 366, 2-9 (2012).</li><li>De Calisto, J., Araya, C., Marchant, L., Riaz, C. F., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+non-canonical+Wnt+signalling+in+neural+crest+migration.">Essential role of non-canonical Wnt signalling in neural crest migration.</a> Development. 132, 2587-2597 (2005).</li><li>Carmona-Fontaine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+inhibition+of+locomotion+in+vivo+controls+neural+crest+directional+migration.">Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration.</a> Nature. 456, 957-961 (2008).</li><li>Matthews, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+migration+of+neural+crest+cells+in+vivo+is+regulated+by+Syndecan-4/Rac1+and+non-canonical+Wnt+signaling/RhoA.">Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA.</a> Development. 135, 1771-1780 (2008).</li><li>Banerjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+MuSK+and+non-canonical+Wnt+signaling+during+segmental+neural+crest+cell+migration.">A novel role for MuSK and non-canonical Wnt signaling during segmental neural crest cell migration.</a> Development. 138, 3287-3296 (2011).</li><li>Pryor, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vangl-dependent+planar+cell+polarity+signalling+is+not+required+for+neural+crest+migration+in+mammals.">Vangl-dependent planar cell polarity signalling is not required for neural crest migration in mammals.</a> Development. 141, 3153-3158 (2014).</li><li>Serbedzija, G. N., Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+dye+analysis+of+cranial+neural+crest+cell+migration+in+the+mouse+embryo.">Vital dye analysis of cranial neural crest cell migration in the mouse embryo.</a> Development. 116, 297-307 (1992).</li><li>Kawakami, M., Umeda, M., Nakagata, N., Takeo, T., Yamamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+migrating+mouse+neural+crest+cell+assay+system+utilizing+P0-Cre/EGFP+fluorescent+time-lapse+imaging.">Novel migrating mouse neural crest cell assay system utilizing P0-Cre/EGFP fluorescent time-lapse imaging.</a> BMC Developmental Biology. 11, 68 (2011).</li><li>Stemple, D. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+stem+cell+for+neurons+and+glia+from+the+mammalian+neural+crest.">Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest.</a> Cell. 71, 973-985 (1992).</li><li>Etchevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+chick,+mouse+or+human+neural+crest+cells.">Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells.</a> Nature protocols. 6, 1568-1577 (2011).</li><li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+cranial+neural+crest+cell+line+from+mouse.">A stable cranial neural crest cell line from mouse.</a> Stem Cells and Development. 21, 3069-3080 (2012).</li><li>Gonzalez Malagon, S. G., Liu, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALK+and+GSK3:+Shared+Features+of+Neuroblastoma+and+Neural+Crest+Cells.">ALK and GSK3: Shared Features of Neuroblastoma and Neural Crest Cells.</a> Journal of Experimental Neuroscience. 12, 1179069518792499 (2018).</li><li>Gonzalez Malagon, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase+3+controls+migration+of+the+neural+crest+lineage+in+mouse+and+Xenopus.">Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus.</a> Nature Communications. 9, 1126 (2018).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology : CB. 8, 1323-1326 (1998).</li><li>Laranjeira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+in+the+mouse+enteric+nervous+system+can+undergo+neurogenesis+in+response+to+injury.">Glial cells in the mouse enteric nervous system can undergo neurogenesis in response to injury.</a> Journal of Clinical Investigation. 121, 3412-3424 (2011).</li><li>Pfaltzgraff, E. R., Mundell, N. A., Labosky, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+neural+crest+cells+from+embryonic+murine+neural+tube.">Isolation and culture of neural crest cells from embryonic murine neural tube.</a> Journal Of Visualized Experiments : JoVE. , e4134 (2012).</li><li>Sternberg, J., Kimber, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+emerging+neural+crest+cells+and+basement+membranes+in+the+trunk+of+the+mouse+embryo:+a+TEM+and+immunocytochemical+study.">The relationship between emerging neural crest cells and basement membranes in the trunk of the mouse embryo: a TEM and immunocytochemical study.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 98, 251-268 (1986).</li><li>Sternberg, J., Kimber, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+fibronectin,+laminin+and+entactin+in+the+environment+of+migrating+neural+crest+cells+in+early+mouse+embryos.">Distribution of fibronectin, laminin and entactin in the environment of migrating neural crest cells in early mouse embryos.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 91, 267-282 (1986).</li><li>George, E. L., Georges-Labouesse, E. N., Patel-King, R. S., Rayburn, H., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+mesoderm,+neural+tube+and+vascular+development+in+mouse+embryos+lacking+fibronectin.">Defects in mesoderm, neural tube and vascular development in mouse embryos lacking fibronectin.</a> Development. 119, 1079-1091 (1993).</li><li>Henderson, D. J., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+extracellular+matrix+in+neural+crest+cell+migration.">Role of the extracellular matrix in neural crest cell migration.</a> Journal of Anatomy. 191 (Pt 4), 507-515 (1997).</li><li>Thomas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+crest+cells+display+molecular+and+phenotypic+hallmarks+of+stem+cells.">Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells.</a> Human Molecular Genetics. 17 (21), 3411-3425 (2008).</li><li>Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Hewitt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+collagen+and+fibronectin+in+neural+crest+cell+adhesion+and+migration.">Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration.</a> Developmental Biology. 87 (2), 259-266 (1981).</li><li>Leung, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNT/&#946;-catenin+signaling+mediates+human+neural+crest+induction+via+a+pre-neural+border+intermediate.">WNT/&#946;-catenin signaling mediates human neural crest induction via a pre-neural border intermediate.</a> Development. 143 (3), 398-410 (2016).</li><li>Zhu, Q., Lu, Q., Gao, R., Cao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospect+of+Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Neural+Crest+Stem+Cells+in+Clinical+Application.">Prospect of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Crest Stem Cells in Clinical Application.</a> Stem Cells International. 2016, 7695836 (2016).</li></ol>

У авторов нет конфликта интересов.

Изучение клеток нервного гребня млекопитающих было проблемой для ученых из-за внутриутробного характера развития млекопитающих. In vivo исследования трудно настроить, как эмбрион должен манипулировать в условиях, которые имитируют жизнь в матке. На практике, это почти невозможно воспроцировать культуры этих (E8 ) эмбрионов дольше, чем 24 ч, особенно для живой визуализации. Кроме того, индукция и миграция нервного гребня происходят одновременно с закрытием нервной трубки и эмбриональным поворотом в мыши; это критическое и стрессовое морфогенетическое событие, которое часто терпит неудачу, когда эмбрионы культивируются экс-утробы. Таким образом, уровень успеха подходов к экс-утробе, как правило, низок. Использование увековеченных NC-клеток21 является полезным инструментом для сокращения использования животных и может обеспечить лучший источник нейронных клеток гребня для долгосрочного анализа, трансфекции и обогащения исследований. Тем не менее, существует явно необходимость надежной культуры первичных нейронных клеток гребня. Наш метод применим к мышиным нокаутом или условным генетическим моделям. Сопоставимый метод с нашим был описан для других нейронных популяций гребня20; однако, наш метод тщательно описывает пошаговую изоляцию моринальных черепных клеток NC. Мы также подробно описываем использование различных матриц, а также процедуру анализа миграции.
Для достижения последовательных результатов, мы обнаружили, что особое внимание уделяется постановке во время отбора эмбрионов. Неудивительно, что количество сомитов коррелирует с различными этапами развития черепной NC. Поэтому знание анатомии эмбриона очень важно перед получением каких-либо экспериментальных данных. Этот подход может быть адаптирован к изоляции отдельных популяций нервных клеток гребня, в зависимости от биологического вопроса и целевых клеток.
После того, как эмбрионы выбраны и вскрыты, мезодермальные клетки могут быть легко различимы и должны быть удалены, чтобы лучше визуализации и уменьшить загрязнение. Для более долгосрочных культур, нейронная ткань пластины могут быть удалены на 24 ч покрытия для того, чтобы предотвратить загрязнение нервных тканей. Более последующее уточнение смогло быть пользой флуоресцентной маркировки линии (например, используя Wnt1::cre или Sox10::creERT водители совмещенные с люминесцентными репортерами24,25) для того чтобы различить нервные клетки гребня от другие ткани, как показано на рисунке 2C.
Предыдущие доклады подчеркнули потенциал покрытия мыши NC explant культур на различных матрицах, чаще всего на коммерческих гидрогелей ECM, фибронектин и коллаген I20,21,26. В наших руках мышь черепных NC explant культур успешно выращивается на всех трех матрицах, в концентрациях, указанных в первоначальных отчетах (данные не показаны). Первоначальный изысканный подход, который мы адаптировали для наших культур ЭКСплантирования NC, использовал коммерческий гидрогель в качестве матрицы выбора, которая в основном состояла из ламинина и коллагенов21(Рисунок 3A-B). Однако состав этого гидрогеля четко не определен, с неизвестным фактором роста и содержанием белка. Таким образом, мы с тех пор изменили наш подход к покрытию мыши NC explant культур на фибронектин (Рисунок 3C-D). Фибронектин хорошо определен и высоко выражен в ECM и подвальных мембранах, вдоль которых мигрируют nc-клеткиin vivo28,29,30. Для оптимизации фибронектина матрицы, которая лучше всего реплицирует нейронных гребня клеток миграции и морфологии, как видно с помощью гидрогеля, мы сравнили NC клеточных поведения выставлены на гидрогель против титрования 0,25-30 мкг /мл фибронектин, и определены 1 мкг /мл фибронектин, как предоставление идеальных свойств (данные не показаны). Мы считаем, что эта предварительная работа может помочь создать основу для систематического сравнения матриц, таких как фибронектин, с ранее описанными, а именно коллагеном и ламинином32,33,34. Было бы особенно интересно сравнить мышь NC клеток мигрирующих потенциала на фибронектин по сравнению с коллагеном I, учитывая, что коллаген-IA1 эндогенно выделяется мыши, птичьего и человека NC клеток28,30,31,32. Коллаген I поэтому так же актуален, как фибронектин при рассмотрении выбора матрицы. Также стоит признать, что биодоступность факторов роста в средствах массовой информации может быть изменена различными матричных компонентами, особенно с учетом высокого содержания в сыворотке наших носителях. Чтобы преодолеть это, мы в настоящее время работаем над созданием безсыворотки определенных условий культуры. Эти определенные носители успешно используются в протоколах индукции нервного гребня в плюрипотентном поле стволовых клеток, но требуют дальнейшей оптимизации для нашей системы культуры NC explant33,34. Наша работа может также служить отправной точкой для уточнения условий для других типов NC клеток, таких как сердечный и ствол NC, а также для последующих исследований ДИфференциации NC. Самое главное, этот протокол позволяет изоляции черепных клеток NC для различных приложений. Мы представляем исследования по направленной миграции, трех-D миграции и вторжения. Клетки, изолированные таким образом, можно лечитьin vitroдля проведения ряда анализов. Например, клетки можно легко лечить с помощью различных малых молекул для целевой конкретных белков, они могут рассматриваться в определенных точках времени, и вымывание эксперименты могут быть разработаны для определения восстановления поведения клеток (Рисунок 4). Возможна более долгосрочная культура для трансфекции и дифференциации анализов, а также прохождения клеток (данные не показаны). Однако жизнеспособность, способность к обновлению клеток и многофункциональность должны быть проверены после прохождения. Клетки, покрытые стеклянными крышками, также могут быть использованы в иммунофлуоресцентных протоколах окрашивания, после живой визуализации. Наконец, этот подход представляет собой чрезвычайно мощную систему для изучения миграции NC из генетических моделей мыши22,23,24,25.

Нейронный гребень (NC) линия является переходной, многопотентной и мигрирующей популяции клеток, которая появляется исключительно у позвоночных во время раннего эмбрионального развития1,2. Нейронные производные гребня чрезвычайно разнообразны, и включают глию, гладкую мышцу, меланоциты, нейроны и черепно-мозговые кости и хрящи3,4. Поскольку нервный гребень способствует функционированию многих систем органов, эта линия имеет важное значение для эмбриогенеза человека. Аномальное развитие NC вовлечено в широкий спектр наиболее распространенных врожденных дефектов человека (т.е. расщелина губы и неба)5, а также расстройства, такие как болезнь Гиршпрунга (HSCR), синдром Варченсбурга (WS), синдром CHARGE и синдром Уильямса6 ,7,8,9.
Разработка NC была исследована в ряде немлекопитающих модельных систем, включая модели Xenopus,chick и zebrafish. У млекопитающих, работа в моделях мыши определила некоторые из ключевых генетических событий, лежащих в основе развития нервного гребня; однако, было труднее следовать клеточной биологии нейронной миграции гребня, из-за недоступности эмбриона мыши (рассмотрено в другом месте10,11). Кроме того, в то время как исследования в цыпленок, Xenopus и зебрафиш создали ген регулятивной сети для NC, потеря функциональных исследований в этих животных моделей иногда не проявляют сопоставимый фенотип в мыши. Например, в Xenopus, зебрафиш и цыпленок, неканонические Wnt сигнализации является одним из клеточных механизмов, что позволяет NC приобрести свою миграционную мощность12,13,14,15 . Однако, в мыши, потеря неканонического Сигналирования Wnt, кажется, не влияет на миграцию16. Поскольку миграцию in vivo NC было трудно отследить в течение длительных периодов времени в мыши, неясно, отражают ли эти видовые различия различные способы миграции или различия в молекулярной регуляции.
Как уже отмечалось, NC исследования в мыши были очень сложными, потому что бывшая утробная культура эмбрионов является трудоемким. Кроме того, NC постоянно находится в тесном контакте с соседними тканями, такими как мезодерм и невректодерм. Недавнее использование нейронных гребня конкретных Cre драйверов или экзогенных красителей позволило нам флуоресцентно этикетки мигрирующих NC; однако эти подходы по-прежнему ограничены. Несмотря на многочисленные отчеты, описывающие различные методы визуализации миграции NC17,18, было трудно решить эти методы в простой и обычной процедуры.
Ясно, что существует необходимость в методах, которые позволяют обработки и характеристики млекопитающих NC. Мы сосредоточили наши усилия на мыши черепных NC, как это основная модель для изучения человеческого черепно-мозгового развития и нейрокристопатий. Мы уточнили наш подход на основе нескольких интересных докладов, описывающих первичную культуру NC-клеток19,20,21. Здесь мы подробно описываем оптимальные методы культуры для экспонирования первичных клеток NC. Мы демонстрируем метод визуализации живых клеток и оптимальное использование различных матриц, чтобы покрыть культурные пластины. Наш протокол описывает, как захватить миграцию живых клеток NC с помощью перевернутого микроскопа, который предназначен в качестве ориентира для использования с другими микроскопами, а также подробное резюме наших клеточных анализов.
Ожидаемым результатом экспланта должно быть красиво выложенное распределение клеток, которые четко различаются под микроскопом, где можно увидеть три различные популяции клеток, которые представляют (i) нейронную пластину, (ii) премьера, и ,iii) мигрирующих нервных гребня клеток. Мы демонстрируем, как анализировать поведение клеток на границе предварительной популяции клеток во время эпителино-мезенхимального перехода. Мы также сосредоточили наши усилия на изучении полностью мигрирующих клеток для скорости клеток, расстояния и морфологии клеток.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td>25cm2 culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (4500 mg/L glucose)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (dPBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>E/0650DF/C17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TFS AA 10-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (ES Cell FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079/16141-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from bovine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottomed, multi-well 24-well tissue culture plate</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>82406</td>
			<td>Glass-bottomed, No 1.5, 24-well tissue culture dish with black sides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell migration analysis tool</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>v2.0</td>
			<td>Manuals for this software can be found at: https://ibidi.com/manual-image-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circularity Plug-in</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>v1.29 or later</td>
			<td>The circularity plug-in is an extended version of ImageJ/Fiji&#8217;s Measure command, designed by Rasband, W., (2000) (wsr@nih.gov).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td>ESGRO by Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Cell Tracking Plug-in</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>v1.34k or later</td>
			<td>ref Cordelieres F. Institut Curie, Orsay (France) 2005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Image Analysis Software</td>
			<td>Universal Imaging Corporation</td>
			<td>6.3r7</td>
			<td>MetaMorph Software Series 6.3r7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential aminoacids 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (ECM-based Hydrogel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1X81</td>
			<td>Olympus 1X81 inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>512B</td>
			<td>Photometrics Cascadell 512B camera (4x UPlanFL N, 10x UPlanFL N, 20x UPlanFL N, 40x UPlanFL N objectives)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope controller</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1X2-UCB</td>
			<td>Olympus 1X2-UCB microscope controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope temperature controller</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>RS232</td>
			<td>Maintained at 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistics software</td>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>v7.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STO feeder cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY microscope stage controller</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>MS-4400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration

За последние несколько десятилетий наблюдается увеличение доступности генетически модифицированных моделей мыши, используемых для имитации патологий человека. Тем не менее, способность изучать движения клеток и дифференциации in vivo по-прежнему очень трудно. Нейрокристопатии, или расстройства нейронной линии гребня, особенно сложно изучать из-за отсутствия доступности ключевых эмбриональных этапов и трудности в отделении из нервного гребня мезенхим от соседних мезодермальных мезенхим. Здесь мы намеревались создать четко определенный, рутинный протокол для культуры первичных черепных нейронных клеток гребня. В нашем подходе мы вскрываем границу нейронной пластины мыши на начальном этапе индукции нервного гребня. Область границы нервной пластины эксплуатирована и культивируется. Нейронные клетки гребня образуются в эпителиальном листе, окружающем границу нервной пластины, и к 24 ч после эксплантирования, начинают разделиваться, подвергаясь эпителиально-мезенхимному переходу (EMT), чтобы стать полностью подвижной нейронной клетки гребня. Благодаря нашему двумерному подходу к культивирования, различные популяции тканей (нейронная пластина против премьера и мигрирующих нейронных гребня) могут быть легко различимы. Используя живые подходы к визуализации, мы можем определить изменения в индукции нервного гребня, EMT и миграционного поведения. Сочетание этой техники с генетическими мутантами будет очень мощным подходом для понимания нормальной и патологической нейронной биологии клеток гребня.

Используя продемонстрированные здесь процедуры, эмбрионы мышей были расчленены из матки, а экстраэмбриональные ткани были удалены(рисунок 1A-D). Эмбрионы были сомит поставил (с использованием только эмбрионов на 5-8 сомитов (ss), Рисунок 1E,F). Затем черепная нервная пластина была расчленена, а нейроэпителий был выделен. Мезодермальные клетки, идентифицированные как свободные, круглые, мезенхимальные клетки, были мягко отмахнулись(рисунок 1G-L). Передняя нейронная пластина может быть высажена целиком, и в этом случае нервная ткань гребня появится боково и расширится радиально вокруг экспланта, или каждая граница нервной пластины (справа и слева) может быть высажена отдельно. Это особенно полезно при вытеснении из генетических мутантов.
В течение 24 ч, область premigratory (эпителиальный) черепного нервного гребня можно четко увидеть окружающие нервной пластины explant(рисунок 2B). Кроме того, субпопуляция нервных клеток гребня претерпели эпителии к мезенхимальным перехода и появляются полностью мезенхимальной(Рисунок 2). Таким образом, у нас есть несколько концентрических колец различных клеток, с нервной пластины (NP) в центре, premigratory нейронный гребень (PNC) в промежуточном круге, и популяция мигрирующих нейронных гребень (mNC) во внешнем кольце (Рисунок 2B). Для того, чтобы проследить NC клетки, можно использовать генетически модифицированные модели мыши, как мы показываем на рисунке 2C. В этом случае мы использовали нейронный гребень специфический Wnt1::Cre; РозаmTmG, которая приводит к NC клетки помечены зеленым цветом. У этих мышей, клетки выражают мембраны помидор (mT, в красном цвете), если они не выражают Cre рекомбиназы. Рекомбинация приводит к клеткам, выражающим мембранный зеленый флуоресцентный белок (GFP, зеленым цветом). Красные клетки, показанные в центре экспланта, являются нейронными клетками пластин. Некоторые клетки донецкой нервной пластины также выражают GFP; для долгосрочной культуры, мы бы акциз все клетки в центре. Для наших целей, чистота explant достаточно для того чтобы отслеживать различные нервные популяции клеток гребня. Там, где необходима более высокая чистота нервного гребня, эта стратегия генетической маркировки может быть объединена с флуоресцентной активированной сортировкой клеток (FACS) для обеспечения чистоты популяции. Кроме того, можно исправить explants и определить NC населения с антитела маркировки.
Кроме того, 24 ч было очевидно, что характерные концентрические кольца premigratory и полностью мигрирующих NC клеток explant культур не зависит и не регулируется матричным выбором (Рисунок 3). Экспланткультуры, покрытые как на основе ECM гидрогеля и фибронектина формируется сопоставимых структур эксплант, состоящий из трех популяций клеток, NP, PNC и MNC(Рисунок 3A,C). Нейронная морфология клеток гребня была также сопоставима между теми, покрытые на основе ECM гидрогеля и фибронектина(рисунок 3B,D). Тем не менее, explants покрытием на фибронектин производится клеток с более заметнымла ламеллиподия на переднем краю клетки, казалось бы, более поляризованы в направлении миграции (Рисунок 3B,D).
После того, как популяция мигрирующих нейронных клеток гребня очевидна, живой визуализации клеток может быть завершена. Микроскопия замедленного времени установлена до 10-кратного увеличения (18 ч, 1 рамка/5 мин) для последующего анализа миграции клеток NC(рисунок 4A). ImageJ Ручной отслеживания плагин генерирует XY координаты отдельных ячеек на всех кадрах замедленного фильмов(рисунок 4B). Эти координаты могут быть обработаны с помощью программного обеспечения миграции. Это программное обеспечение позволяет визуализировать отдельные клеточные треки с течением времени(рисунок 4B)и может быть использован для количественной оценки накопленного и евклидного расстояния, а также скорости ячейки.
Данные визуализации по времени также предоставляют огромное количество информации о морфологии клеток во время миграции черепных нервных клеток гребня(рисунок 4C). Путем изложения отдельных клеточных мембран, области клеток и измерения периметра могут быть рассчитаны из всех кадров фильмов(рисунок 4C). Эти измерения позволяют последующую количественную оценку области клеток и круговостью(рисунок 4D). На рисунке 4C показан анализ изменений формы клеток в течение 18 ч. Обратите внимание, что по мере того, как клетки мигрируют от экспланта, область клеток значительно увеличивается, в то время как круговая способность клеток остается относительно постоянной (односторонний тест ANOVA, тест нескольких сравнений Туки) ( Рисунок 4E,F). Это говорит о том, что по мере того, как клетки отходят от эпителиального края и теряют контакты клеток, они показывают увеличение площади распространения клеток. Показатели круговой связи не изменились с течением времени; однако краткосрочные изменения в круговоротах могут быть видны, если будет количественно определено увеличение числа временных точек. Измерения круговой связи клеток могут также предоставлять интересные данные о динамике формы клеток в присутствии химиотаксического сигнала или в ограниченных условиях.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60051/60051fig1.jpg"> Рисунок 1: Изоляция черепного нервного гребня эксплантов от эмбриона e8.5. Изображения — это кадры из видео, документирующего технику микрорастчедризации. (A-C) Рассечение эмбриона из матки. (B-C) Используя две острые щипточки, аккуратно разогнай мышечный слой. Панель (D) показывает эмбрион внутри висцерального желтого мешка (желтая линия). Извлеките зародыш из висцерального желткового мешка. (E) Боковые виды эмбриона на стадии 8.5 боковой. (F) Дорсальный вид эмбриона на стадии 8.5. Граф somites (ss) для определения возраста эмбрионов; обычно 5-8 ss (желтые круги в F). (G) Закрыть взгляд на черепной области эмбриона. Удалить экстраэмбриональные мембраны из черепной области; сомиты отмечены желтой линией. (H) Рассеичения передней нервной пластины выполняются под первой ветвянной аркой (желтая линия). (I) Боковой вид вскрытия передней нервной пластины. Нейронные складки, где нейронные клетки гребня возникают, отмечены желтой линией. (J-L) Удалить мезодермальной ткани (пушистые мезенхимальные клетки) основные передние нервные складки как можно больше, прежде чем наклеить NP на подготовленные блюда культуры. Фильм был сделан с помощью стерео-микроскопа с широкоугольным апохроматическим объективом при 3.0X зум (см. таблицу материалов). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60051/60051fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60051/60051fig2.jpg"> Рисунок 2: Murine черепного нервного гребня explant. (A) Схематическое представление вдомного вида эмбриона мыши e8.5. Область черепа эмбриона разрезается на линии. Нейронная граница пластины (выделенная красным цветом) изолирована от окружающей мезодермовой ткани и культивируется в течение 24 ч, чтобы позволить черепному нервному гребню эмигрировать. Схема адаптирована от22,23. (B) Слева: Представитель яркое поле изображение черепного нервного гребня explant 24 часов после покрытия. Наблюдаются три популяции клеток, которые также схематизированы справа. NP - нервная пластина, PNC - предмиграционный нервный гребень и мигрирующие нейронные гребни. Шкала бар 250 мкм. (C) Более высокое увеличение изображения explant от генетически маркированной мыши (Wnt1::cre; РозаmTmG). Клетки без драйвера Cre выражают мембранный помидор (mT) в красном цвете. Выражение Cre под контролем нейрогреба специфического промоутера Wnt1 приводит к иссечению кассеты mT и экспрессии мембраны GFP (mG) в зеленом цвете. Ядра окрашены Hoescht (в синий цвет). Шкала бар 200 мкм. (D-D') Высшие изображения увеличения мигрирующих клеток, выражающих мембраны GFP (D). (D') ДНК помечена Hoescht (синий). (D') Слияние D и D'. Шкала бар 20 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60051/60051fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60051/60051fig3.jpg"> Рисунок 3: Выслаживание, культивируется на разных субстратах. (A-B) Фазовые контрастные изображения экс-растений, культивированные на коммерческом ECM-гидрогеле. (C-D) Выделяемые растения культивировались на 1 мкг/мл фибронектина. Нейронную пластину (NP), премигранные (pNC) и мигрирующие (mNC) нейронные клетки гребня можно отличить по их различным клеточным морфологиям. Шкала бар 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60051/60051fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60051/60051fig4.jpg"> Рисунок 4: Количественная оценка миграции клеток черепного нервного гребня и динамики клеточной формы. (A) Фазовые контрастные кадры из замедленного изображения экзат-культур, наложенных на один нейронный крест клеток треков, используя ImageJ / Фиджи Ручной сотовый слежения плагин. Десять представительных mNC ячейки были вручную отслеживаются в течение 18 ч (217 кадров) и XY координаты были экспортированы. Данные представлены как точка наложения и линейные участки. Клетки были покрыты на 1 мкг/мл фибронектин. Шкала бар 200 мкм. (B) Представитель траектории участка 10 mNC ячейки, созданные с помощью программного обеспечения миграции. (C) Фазово-контрастные кадры, взятые из замедленного анализа культур эксплантатора. Dashed линии наметить 8 представительных мигрирующих нервных клеток гребня проанализированы для динамики формы клетки, когда покрывало на 1 мкг /мЛ фибронектин. Шкала бар 200 мкм. (D) Схематическое представление расчетов, используемых для количественной оценки области клеток и круговой связи. Клеточная морфология схемы является то, что из клетки выделены синим (C). Областьпикселей px, Npx - пиксельное число, площадь А, P и периметр (1 пиксель no 1.60772 мкм2). (E-F) Количественная оценка площади клеток и измерения круговой связи клеток с течением времени. Данные представляют собой среднее и среднего значения SEM. Каждая точка представляет собой одну ячейку (n no 60), взятую из 3 независимых экспериментов, и анализируемую на 0 ч, 6 ч, 12 ч и 18 ч (нс незначительный, й стр.т;0,05, п.л.; 0,0001 одностороннее ANOVA, тест нескольких сравнений Туки). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60051/60051fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration at JoVE.com

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Этот протокол описывает вскрытие и культуру черепных нейронных клеток гребня из моделей мыши, в первую очередь для изучения миграции клеток. Мы описываем используемые методы живой визуализации и анализ изменений скорости и формы клеток.

Рассечение, культура и анализ первичных черепных нейронных клеток от мыши для изучения нейронных клеток Креста Delamination и миграции

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Этот четко определенный протокол рассматривает первичную миграцию нервного гребня у млекопитающих. Мы используем первичную миграцию нервного гребня для изучения врожденных дефектов, влияющих на нервный гребень. Такой подход позволяет нам более внимательно взглянуть на нервные клетки гребня, как они выходят из нервной пластины.Тестирование на клеточное поведение в тканях, несущих очарование мутантных генов или после фармацевтического лечения, позволяет скрининг на последствия лечения наркотиков или изменения окружающей среды во время эмбрионального развития. Аналогичный подход может быть использован для изучения нервных клеток гребня, которые мигрируют в сердце или кишечник или для изучения метастатических опухолевых клеток. Угадывать анатомию права зародыша сложно.Его ткани очень быстро меняются во время раннего развития. Мы предлагаем практиковать микродиссекцию перед проведением большого эксперимента. Поскольку эмбрионы живы и трехмерны, скорость и точность имеют решающее значение.В эмбриональный день 8.5, использовать стерильные инструменты и растворы для сбора матки в контейнер ледяной PBS. Вырежьте мезометрию, чтобы отделить каждый эмбрион. Рассекают матку тщательно, отделяя каждый решающий отек.Сбор эмбриона на правильной стадии развития имеет решающее значение для снижения изменчивости и увеличения успеха в прижении экспланта к матрице, а также миграции клеток. Сдвиньте миппы между мышечным слоем и решающей тканью эмбриона и используйте вторую пару типсов для удаления мышечного слоя. Используйте типсы, чтобы пробить decidua по краям мезометриальной тянуть и использовать вторую пару типсов разорвать ткани открыты перпендикулярно тянуть.Очистите решающую ткань с помощью типсов, чтобы визуализировать мембрану рикартов, прежде чем тщательно удалить мембрану. Висцеральный желток сак станет видимым и эмбрион будет наблюдаться внутри. Удалите висцеральный желток сак и анион, и положение эмбриона, чтобы визуализация головы раза.Вырежьте складку головы над сердцем и соскребли лежащий в основе мезодерм, чтобы получить чистую нервную пластину. Затем границы нервной пластины должны быть вскрыты. Используя стеклянную пипетку Pasteur, перенесите вскрытую нейронную пластину на гидрогель покрытием блюдо, наполненное условным нервным гребнем среды и осторожно вихрем блюдо позиционировать нервной пластины в середине хорошо.Затем инкубировать нейронную пластину при 37 градусах Цельсия и 5%углекислого газа для соответствующего экспериментального периода времени. В течение 24 часов после explanting, место ткани культуры блюдо в образец держателя лица контрастного микроскопа, и ленты вниз крышкой пластины и двуокиси углерода иглы для предотвращения встряхивания во время нескольких хорошо приобретения. Затем сосредоточьтесь на черепных нервных клетках гребня при 10-м увеличении с соответствующим фазовым кольцом в выбранном конденсаторе.Для количественной оценки миграционной способности нервных гребней, установите микроскоп, чтобы приобрести один кадр каждые пять минут в 10 раз больше. Для количественной оценки морфологии клеток установите микроскоп для получения одного кадра в минуту при увеличении в 40 раз. Для количественной оценки динамики ламеллиподии установите микроскоп для получения одного кадра каждые 10 секунд в течение 10 минут при 40-м увеличении.Для мульти-хорошо изображения, установить механическую стадию для перемещения между выбранными X, Y позиции, представляющие интерес, и подтвердить, что черепные нервные клетки гребня находятся в фокусе, и что положение сцены являются правильными. Затем нажмите приобрести, чтобы начать промежуток времени изображения. Для отслеживания одной ячейки, открытого изображения J и импортировать данные в качестве файлов tiff стек.Измените ориентацию и яркость и уровни контрастности и нажмите анализ и установите шкалу для калибровки точечных файлов stk в пиксельных микрометрах в соответствии с настройками микроскопа. Нажмите плагины, отслеживания и ручного отслеживания, чтобы открыть изображение J ручной плагин отслеживания ячейки и выбрать добавить трек, чтобы начать отслеживание ячейки. Затем отслеживайте ячейки через все кадры фильмов замедленного действия, используя ядро в качестве точки отсчета.Чтобы оценить миграционную способность нейронного гребня, откройте подходящую программу анализа миграции и нажмите на вкладку данных импорта, чтобы импортировать данные отслеживания ячеек в качестве файла dot txt. При наборе данных и инициализации выберите количество срезов или кадров для анализа и установите калибровку X Y и интервал времени между кадрами. Выберите настройки применения для сохранения настроек.Затем выберите символ данных участка для формирования участков траектории и выберите символ статистики для количественной оценки расстояния и скорости. Для количественной оценки области нейронных клеток гребня и круговорота, открытого изображения J и под анализом и набором измерений, нажмите, чтобы выбрать параметры формы клетки, область клетки, периметр и дескриптор формы. Используйте инструмент свободного выбора руки, чтобы вручную нарисовать контур вокруг каждой клетки, используя границы клеточной мембраны в качестве руководства.Клавиши управления прессом на клавиатуре для поддержания наложения контура ячейки на изображение и повторения для каждой ячейки в течение каждого промежутка времени. Нажмите на наложение изображения и для достижения интереса менеджера и выберите ячейки, представляющие интерес. Затем нажмите меру, чтобы получить значения для выбранных параметров формы ячейки интерес.В течение 24 часов после экспланта и культуры, область до мигрирующих эпителиальных черепных нервный гребень можно четко наблюдать окружающих нервной пластины explant. Кроме того, субпопуляция нервных клеток гребня будет претерпела эпителиальный мезенхимальный переход и появляются полностью мезенхимальные. Эксплантные культуры, помытые либо внеклеточным матричным гидрогелем, либо фибронектином, образуют аналогичные структуры эксплантов, состоящие из нервной пластины премьериграторного нервного гребня и мигрирующих популяций нервных гребней.Однако explants потроханные на фибронектине производят клетки с более видно lamellipodia на крае клетки leading seemingly более поляризованном в направлении переселения. Микроскопия промежуток времени позволяет отслеживать X, Y координаты отдельных клеток и анализ миграции нервных гребневых клеток и анализ морфологии клеток черепа нервного гребня с течением времени. Путем конспектирования отдельных клеточных мембран, площадь клеток и измерения периметра могут быть рассчитаны из всех кадров фильмов, чтобы позволить последующую количественную оценку области клетки и круговорота отдельных и групп клеток.Обратите внимание, что, как клетки мигрируют от explant, площадь клетки значительно увеличивается в то время как круговые клетки остается относительно постоянным, предполагая, что, как клетки отходят от эпителиального края и теряют клетки к контакту клеток, они показывают увеличение области распространения клеток. Обратите особое внимание на выскабливание лежащего в основе мезодерма, чтобы получить чистую нейронную пластину, так как это способствует миграции нервных клеток гребня от ткани. Многие другие методы, такие как иммуностеинирование, RTPCR, или анализ одноклеточных может быть выполнена для анализа различных белков или генов, представляющих интерес среди различных популяций клеток культуры.Мы заинтересованы в развитии рулонов некоторых ключевых генов нейробластомы, которые могут быть вовлечены в миграцию нервных клеток гребня и в использовании этого подхода для изучения генов заболеваний человека.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Двойная маркировка нервных клеток Креста и кровеносных сосудов в куриных эмбрионах сиспользованием Чик GFP нейронной трубки прививки и карбоцианина красителя DiI инъекции

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Дифференциация нейронных эмбриональных стволовых клеток мыши в бессывороточной монослоя культуры

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Культивирование Человеческий плюрипотентных и нервные стволовые клетки в замкнутой системе клеточной культуре фундаментальных и доклинических исследований

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Мульти Фотон время Замедленная съемка изображений для визуализации в режиме реального времени разработки: Визуализация миграции клеток нервной гребень в Zebrafish эмбриона

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Быстрое обнаружение фенотипов исходам в клетках человека нейронных прекурсоров (НПС)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Зика вирусной инфекции культурный человеческий мозг плода нервных стволовых клеток для иммуноцитохимическое анализа

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Поколение индуцированных нейронных стволовых клеток из периферических моноядерных клеток и дифференциация к дофаминергическим нейронным прекурсорам для трансплантационных исследований

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Эффективная нейронная дифференциация с использованием одноклеточной культуры эмбриональных стволовых клеток человека

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Изоляция, Культура и адипогенная индукция нейронных Креста Оригинальные жировые стволовые клетки из периаортных жировой ткани

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Дифференцировка и характеристика нейронных предшественников и нейронов из эмбриональных стволовых клеток мышей

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...