Name: improving small rna-seq: less bias and better detection of 2'-o-methyl rnas
Uploaded: 2019-09-16T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af det nationale center for videnskabelig forskning (CNRS), den franske alternative energier og Atomenergikommissionen (CEA) og Paris-Sud Universitet. Alle Biblioteks forberedelser, Illumina sekvensering og bioinformatik analyser for denne undersøgelse blev udført på I2BC Next-generations sekventering (NGS) facilitet. Medlemmerne af I2BC NGS-faciliteten er anerkendt til kritisk læsning af manuskriptet og nyttige forslag.

1. isolering af små RNAs
<ol><li>Uddrag total RNA ved hjælp af phenol-baserede reagenser eller enhver anden metode. Kontroller, om RNA er af god kvalitet.</li>
	<li>Pre-Run en 15% TBE-urea gel (Se tabel over materialer) for 15 min ved 200 V.</li>
	<li>Mens gelen er pre-Running, bland 5-20 μg total RNA i en 5-15 μl volumen med et tilsvarende volumen af formamid loading Dye (Se tabel over materialer; 95% deioniseret formamid, 0,025% bromphenolblåt blå, 0,025% xylen cyanol, 5 mm EDT...

<ol>
	<li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+silencing+RNAs:+an+expanding+universe.">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).</li><li>Chang, T. C., Mendell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNAs+in+vertebrate+physiology+and+human+disease.">microRNAs in vertebrate physiology and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).</li><li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+expression+profiling+by+high-throughput+sequencing:+implications+of+enzymatic+manipulation.">Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation.</a> Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).</li><li>van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library+preparation+methods+for+next-generation+sequencing:+tone+down+the+bias.">Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias.</a> Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).</li><li>Munafo, D. B., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+enzymatic+reaction+conditions+for+generating+representative+pools+of+cDNA+from+small+RNA.">Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA.</a> RNA. 16, 2537-2552 (2010).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries.">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17, 1697-1712 (2011).</li><li>Sorefan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+ligation+bias+of+small+RNAs+in+libraries+for+next+generation+sequencing.">Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing.</a> Silence. 3, 4 (2012).</li><li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bias-reducing+strategy+in+profiling+small+RNAs+using+Solexa.">A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa.</a> RNA. 17, 2256-2262 (2011).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).</li><li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+bias+in+T4+RNA+ligase-mediated+3'-adapter+ligation.">Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation.</a> Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).</li><li>Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bias+in+ligation-based+small+RNA+sequencing+library+construction+is+determined+by+adaptor+and+RNA+structure.">Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure.</a> PLoS One. 10, 0126049 (2015).</li><li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing.">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19, 118 (2018).</li><li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing.">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6, 26969 (2011).</li><li>Harrison, B., Zimmerman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-stimulated+ligation:+enhanced+ligation+of+oligo-+and+polynucleotides+by+T4+RNA+ligase+in+polymer+solutions.">Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions.</a> Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).</li><li>Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+ligation+dependent+artifacts+in+T4+RNA+ligase+to+achieve+high+efficiency+and+low+bias+microRNA+capture.">Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture.</a> PLoS One. 9, 94619 (2014).</li><li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing.">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14, 109 (2013).</li><li>Barberan-Soler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreasing+miRNA+sequencing+bias+using+a+single+adapter+and+circularization+approach.">Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach.</a> Genome Biology. 19, 105 (2018).</li><li>Chen, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cost-effective+method+for+Illumina+small+RNA-Seq+library+preparation+using+T4+RNA+ligase+1+adenylated+adapters.">A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters.</a> Plant Methods. 8, 41 (2012).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. , (2011).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10, 25 (2009).</li><li>Shore, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+Library+Preparation+Method+for+Next-Generation+Sequencing+Using+Chemical+Modifications+to+Prevent+Adapter+Dimer+Formation.">Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation.</a> PLoS One. 11, 0167009 (2016).</li></ol>

Lille RNA-bibliotek forberedelse forbliver udfordrende på grund af bias, primært introduceret under adapter ligering trin. RNAs med en 2 '-OMe modifikation på deres 3 ' ende, såsom plante miRNAs, piRNA i insekter, nematoder og pattedyr, og små interfererende RNAs (siRNA) i insekter og planter er særligt vanskeligt at studere, fordi 2 '-OMe modifikation hæmmer 3 ' adapter ligation. En række løsninger er blevet foreslået i litteraturen til at forbedre sRNA bibliotek forberedelse protokoller, men de fleste kommerc...

Små RNAs (sRNAs) er involveret i kontrollen af en mangfoldighed af biologiske processer1. Eukaryotic Regulatory sRNAs er typisk mellem 20 og 30 NT i størrelse; de tre hovedtyper er microRNAs (miRNA), Piwi-interagerende RNAs (piRNA) og små forstyrrende RNAs (siRNA). Afvigende miRNA udtryk niveauer har været impliceret i en række forskellige sygdomme2. Dette understreger betydningen af miRNAs i sundhed og sygdom og kravet om nøjagtige, kvantitative forskningsværktøjer til at opdage sRNAs i almindelighed.
Next-Generation sekventering (NGS) er en meget anvendt metode til at studere srnas. De vigtigste fordele ved NGS sammenlignet med andre tilgange, såsom kvantitative PCR-eller microarray-teknikker (qPCR), er, at det ikke har brug for en priori-viden om sRNA-sekvenser og derfor kan bruges til at opdage nye RNAs, og at det desuden lider mindre baggrunds signal og mætningseffekter. Yderligere, det kan detektere enkelt nukleotid forskelle og har en højere gennemløb end mikroarrays. Men NGS har også nogle ulemper; omkostningerne ved en sekvens kørsel er fortsat relativt høje, og den Step-proces, der kræves for at konvertere en prøve til et bibliotek til sekvensering, kan introducere bias. I en typisk sRNA-Biblioteks forberedelsesproces er en 3 ' adapter først ligeret til sRNA (ofte gel-renset fra Total RNA) ved hjælp af en afkortet version af RNA-ubiquitinligase 2 (RNL2) og en præadenyleret 3 ' adapter (figur 1) i fravær af ATP. Dette øger effektiviteten af Srna-adapter ligering og reducerer dannelsen af sidereaktioner såsom Srna cirkularisering eller koncatemerisering. Efterfølgende, en 5 ' adapter er ligeret af RNA ubiquitinligase 1 (RNL1), efterfulgt af reverse transkriptionen (RT) og PCR amplifikation. Alle disse trin kan indføre bias3,4. Læse numrene afspejler derfor muligvis ikke de faktiske sRNA-udtryks niveauer, hvilket fører til kunstige, metode afhængige udtryks mønstre. Specifikke sRNAs kan være enten over-eller underrepræsenteret i et bibliotek, og stærkt underrepræsenterede sRNAs kan undslippe afsløring. Situationen er særlig kompliceret med plante miRNAs, siRNAs i insekter og planter, og piRNAs i insekter, nematoder og pattedyr, hvor 3 ' Terminal nucleotid har en 2 '-O-methyl (2 '-OMe) modifikation1. Denne ændring hæmmer kraftigt 3 ' adapter ligering5, hvilket gør biblioteket forberedelse til disse typer af RNA en vanskelig opgave.
Tidligere arbejde viste, at adapter ligering introducerer alvorlig bias, på grund af RNA sekvens/struktureffekter6,7,8,9,10,11. Trin nedstrøms for adapter ligering såsom reverse transkription og PCR bidrager ikke signifikant til bias6,11,12. Ligering bias er sandsynligvis på grund af det faktum, at adapter molekyler med en given sekvens vil interagere med Srna molekyler i reaktionsblandingen til dannelse af co-folder, der kan enten føre til gunstige eller ugunstige konfigurationer for ligering (figur 2). Data fra Sorefan et al7 antyder, at RNL1 foretrækker en enkelt strandede sammenhæng, mens RNL2 foretrækker en dobbelt streng til ligation. Det forhold, at adapter/sRNA Co-fold strukturer er bestemt af den specifikke adapter og sRNA sekvenser forklarer, hvorfor specifikke sRNA er over-eller underrepræsenteret med en given adapter sæt. Det er også vigtigt at bemærke, at der inden for en række sRNA biblioteker, der skal sammenlignes, de samme adapter sekvenser bør anvendes. Faktisk er det tidligere blevet bemærket, at skiftende adaptere ved indførelsen af forskellige stregkode sekvenser ændrer Mirna profiler i sekvensering biblioteker9,13.
Randomisering af adapter sekvenser i nærheden af ligationskrydset reducerer sandsynligvis disse skævheder. Sorefan og kolleger7 brugte adaptere med 4 tilfældige nukleotider på deres ekstremiteter, udpegede "high definition" (HD) adaptere, og viste, at brugen af disse adaptere fører til biblioteker, der bedre afspejler sande Srna ekspressionsniveauer. Nyere arbejde bekræftet disse observationer og afslørede, at den randomiserede region ikke behøver at være støder op til ligering Junction11. Denne nye type adaptere blev "MidRand"-adaptere. Tilsammen viser disse resultater, at forbedret adapter design kan reducere bias.
I stedet for at ændre adapterne kan bias undertrykkes gennem optimering af reaktions forholdene. Polyethylenglycol (peg), et makromolekyle-fortrængning-middel, der vides at øge ligations effektiviteten14, har vist sig at reducere bias15,16betydeligt. Baseret på disse resultater, flere "Low bias" kits dukkede op på markedet. Disse omfatter kits, der bruger PEG i ligations reaktionerne, enten i kombination med klassiske adaptere eller HD-adaptere. Andre kits undgå ligering helt, og brug 3 ' polyadenylering og skabelon Skift til 3 ' og 5 ' adapter addition, henholdsvis12. I endnu en strategi, 3 ' adapter ligering efterfulgt af en cirkularisering skridt, og dermed udelade 5 ' adapter ligering17.
I en tidligere undersøgelse, vi søgte efter en sRNA bibliotek forberedelse protokol med de lavest mulige niveauer af bias og den bedste påvisning af 2 '-OMe RNAs12. Vi testede nogle af de ovennævnte ' low bias ' kits, som havde en bedre påvisning af 2 '-OMe RNAs end standardprotokollen (TS). Overraskende dog, efter modifikation (brug af randomiserede adaptere, PEG i ligations reaktioner og fjernelse af overskydende 3 ' adapter ved rensning) sidstnævnte udkonkurreret de andre protokoller til påvisning af 2 '-OMe RNAs. Her beskriver vi i detaljer en protokol baseret på TS-protokollen, ' TS5 ', som havde den bedste samlede opdagelse af 2 '-OMe RNAs. Protokollen kan følges ved hjælp af reagenser fra TS kit og en reagens fra ' NF ' kit eller, for at spare penge, ved hjælp af hjemmelavede reagenser, med samme ydeevne. Vi leverer også en detaljeret protokol til rensning af sRNA fra Total RNA og fremstilling af præadenyleret 3 ' adapter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:873px;" width="874">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">2100 Bioanalyzer Instrument&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">G2939BA</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td style="width:159px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:169px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Bioanalyzer Small RNA Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">5067-1548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS8162-96EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Dark Reader transilluminator</td>
			<td style="width:159px;">various suppiers</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">HotStart PCR Kit, with dNTPs</td>
			<td style="width:159px;">Kapa Biosystems</td>
			<td>KK2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">NEXTflex small RNA-seq V3 kit</td>
			<td style="width:159px;">BIOO Scientific</td>
			<td style="width:169px;">NOVA-5132-05</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Novex TBE gels 6%</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Novex TBE Urea gels 15%</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EC6885BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td style="width:159px;">Qiagen&#160;</td>
			<td style="width:169px;">28304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Qubit 4 Quantitation Starter Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">Q33227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Qubit ssDNA Assay Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:374px;">RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">RNase Inhibitor, Murine&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">18090200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:28px;width:374px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">T4 RNA Ligase 2, truncated</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrackIt 50 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">10488043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">TruSeq Small RNA Library Prep Kit</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td>RS-200-0012/24/36/48</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Glycogen</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>10814010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">ZR small RNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:169px;">R1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td>the last two numbers correspond to the set of indexes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving small rna-seq: less bias and better detection of 2'-o-methyl rnas

Studiet af små RNAs (sRNAs) ved næste generations sekvensering (NGS) udfordres af bias-problemer under biblioteks forberedelsen. Flere typer sRNA såsom plante microRNAs (miRNAs) bære en 2 '-O-methyl (2 '-OMe) modifikation på deres 3 ' Terminal nucleotid. Denne modifikation tilføjer en anden vanskelighed, da det hæmmer 3 ' adapter ligation. Vi har tidligere demonstreret, at modificerede versioner af ' TruSeq (TS) ' protokollen har mindre bias og en forbedret påvisning af 2 '-OMe RNAs. Her beskriver vi i detaljer protokol ' TS5 ', som viste den bedste samlede præstation. TS5 kan følges enten ved hjælp af hjemmelavede reagenser eller reagenser fra TS kit, med samme ydeevne.

Kritiske trin er isoleringen af den lille RNA-fraktion af det første totale RNA-materiale (figur 3) og det ønskede endelige Biblioteks produkt (figur 4). Begge trin involverer polyacrylamid gel rensning; lille RNA er isoleret fra 15% TBE urea gels, mens de endelige biblioteker er isoleret fra 6% indfødte TBE gels. Lille RNA isoleret fra gel kan analyseres på en lille RNA kapillar elektroforese chip (tabel over materialer; <strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs at JoVE.com

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

Vi præsenterer en detaljeret lille RNA bibliotek reparation protokol med mindre bias end standardmetoder og en øget følsomhed for 2 '-O-methyl RNAs. Denne protokol kan følges ved hjælp af hjemmelavede reagenser for at spare omkostninger eller bruge kits til bekvemmelighed.

Forbedring af små RNA-SEQ: mindre bias og bedre påvisning af 2 '-O-methyl-RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

Små RNA regulerer mange biologiske processer. Det er derfor vigtigt at udvikle følsomme og upartiske metoder til at opdage dem. Vores protokol protokol giver skridt fremad mod dette mål.Vores protokol lider af færre bias spørgsmål, end klassisk lille RNA bibliotek bevilling metoder, og vigtigere det giver mulighed for en mere følsomme opdagelser af to gren eller meso-RNAs. Såsom plante mikro-RNA'er. Efter udpakning total RNA i henhold til standardprotokoller.Pre køre en 15% TBE urea gel i femten minutter ved 200 volt. Og bland fem til tyve mikrogram af det samlede RNA i et volumen på fem til femten mikroliter med et tilsvarende volumen af formamidbelastningsfarve i et 200 mikroliterrør. Efter fem minutter ved 65 grader Celsius, i en termocymand med et opvarmet låg, straks placere rørene på is og indlæse sidstnævnte og prøve på gelen med mindst én vognbane mellem dem.Kør derefter gelen ved 200 volt, indtil bromophenol har migreret omkring to tredjedele af længden af gelen. For at indlæse RNA, først punktere bunden af en nuklease fri 0,5 milliliter mikro centrifuge rør, med en 21 gauge nål, og placere punkterede rør i en nuklease fri runde bunden to milliliter mikro centrifuge rør. Dernæst inkuberes gelen ved stuetemperatur med nukleinsyregelplet i vand i ti til femten minutter, før du ser gelen på en transilluminator.Skær prøven RNA mellem 17 og 29 nukleotid stigen bands, og overføre gelen stykke i punkteret rør. Drej gelen ned i en mikrocentrifuge ved maksimal hastighed i to minutter, og fjern 0,5 milliliterrøret, som nu skulle være tomt. Der tilsættes 300 mikroliter nukleasefri 0,3 kindtænder natriumchlorid til den knuste gel, og røret anbringes på en rotator i mindst to timer ved stuetemperatur.Ved slutningen af inkubationens afslutning overføres suspensionen af knuste gelstykker til en centrifugering og centrifugeres i to minutter ved maksimal hastighed i mikrocentrifugen. For ikke-dedikeret tre prime adapter elimination, grundigt blande ti mikroliters nuklease frit vand med den ekstraherede RNA prøve, og tilsæt seks mikroliter af tre molars natriumacetat med blanding. Der tilsættes 40 mikroliter magnetiske rensningsperler og 60 mikroliter isopropanol til prøven med grundig blanding.Og inkuber suspensionen i fem minutter ved stuetemperatur. Ved inkubationens afslutning anbringes prøven på et magnetisk stativ, indtil opløsningen bliver klar. Fjern den klare supernatant, og tilsæt 180 mikroliter frisklavet 80% ethanol til perlerne.Efter 30 sekunder fjernes ethanolen, og røret drejes kort. Resterende væske, der kan have opsamlet i bunden af røret, fjernes, og perlerne tørres i to minutter, før prøven suspenderes igen i 22 mikroliter på 10 millimolartri. Efter to minutter magnetisere prøven, indtil opløsningen ser klar.Dernæst blandes 20 mikroliter af klar supernatant med seks mikroliter af tre molar natriumacetat i et nyt rør, og tilsæt 40 mikroliter af magnetiske perler og 60 mikroliter af 100% isopropanol. Efter fem minutter ved stuetemperatur magnetiseres prøven, indtil opløsningen ser klar ud, før supernatanten fjernes. Prøven behandles med 180 mikroliter frisklavet 80 %ethanol i 30 sekunder, før ethanolen snurrer ned i prøven, og eventuel restvæske, der er akkumuleret i bunden af røret, fjernes.Efter at perlerne er tørret i to minutter, skal de igen suspenderes i 10 mikroliter nukleasefrit vand i to minutter, før prøven magnetiseres, indtil opløsningen bliver klar. Derefter overføres ni mikroliter supernatant til et nyt rør og tilsæt en mikroliter T4 RNA ligase buffer og en micrcoliter af vand til prøven. For gel rensning, køre fem, ti, og tyve mikroliter af PCR produkt på en indfødt 6% TBE gel for omkring en time.Inkuber den færdige gel med nukleinsyre gel plet i vand i ti til femten minutter, og se gelen på en transilluminator at tillade udvinding af 150 base par bibliotek band. Da det er svært at isolere de 150 base par band, der repræsenterer dem, disse er vores bibliotek, på grund af tilstedeværelsen af tæt migrerende side produkter, du bliver nødt til at skære gelen meget omhyggeligt. Isoler derefter RNA'et som netop påvist.Ved ændring af rå sekvensfiler skal du hente de fastq-sekvensfiler, der genereres under sekvenskørslen, og præforme demultiplexing med bcl2fastq2 efter behov. Fjern adaptersekvenser ved hjælp af cutodapt, og brug kommandoen som vist. Brug seqtk som angivet til at fjerne terminalen tilfældige nukleotider i sekvenser læser.Brug derefter awk-kommandoen som angivet til at kassere sekvenserne kortere end 10 nukleotider. Hvis du vil tilknytte de trimmede sekvenser, skal du åbne miRBase og hente den modne fa-fil. Brug kommandoen som angivet til at erstatte U-restkoncentrationer med T-rester for at give en fuldstændig liste over alle mikro-RNA'er i databasen, der stammer fra en række forskellige organismer.Vælg mikro RNA sekvenser af organismen af interesse, med kommandoen som angivet, og kort læser til filen ved hjælp af butterfly2, så ingen uoverensstemmelser. Brug værktøjet til at justere sekvenserne læser til databasen, hvilket kræver, at en læsning knytter sig helt til et mikro-RNA i databasen, uden eventuelle uoverensstemmelser som angivet. Brug derefter kommandoen til at kassere de læsninger, der ikke justerede.Efter lastning stigende mængder af en PCR forstærket bibliotek på en gel som påvist, kan de produkter, der svarer til den forventede størrelse udvindes. Efter elution kan det rensede bibliotek kontrolleres på en kapillær gelelektrophorsischip. Ud over de forventede 150 basisparprodukt og en stigende andel af en 130 basisparart, der svarer til adapterdæmpere, observeres typisk, da stigende mængde PCR-produkt indlæses.Lignende resultater opnås, når biblioteker fra en blanding af syntetiske små RNA'er fremstilles ved hjælp af reagenser fra kits eller andre forsyninger. Til sammenligning vises tidligere offentliggjorte resultater for det samme lille RNA-mix. Her vises en sammenligning for protokol TS5's ydeevne med TS-standardprotokollen til påvisning af human umodificeret og to primære O-methal modificerede plant micro RNA'er.Påvisning af to prime O-methal modificerede piRNA'er i humane prøver blev også testet. Som observeret TS5 præfabrikerede betydeligt bedre end TS til påvisning af to prime O-methal RNAs, men ikke for uændrede RNA'er. Forbered replikere biblioteker for hvert eksempel på forskellige datoer.Normalt er der lidt variation mellem replikater foretaget samtidig, eller der kan være betydelig variation blandt biblioteker udarbejdet på forskellige datoer.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning af Copy Number Ændringer Brug Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Sekvens-specifikke og selektiv anerkendelse af dobbelt-strenget RNA'er over enkeltstrenget RNA'er af kemisk modificerede peptid nukleinsyrer

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Metaboliske mærkning og profilering af overførsel RNA'er ved hjælp af Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-medieret reorganisering af kromatin løkke struktur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Sjælden begivenhed registrering ved hjælp af fejl-korrigeret DNA og RNA sekventering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metoder til nøjagtig detektering af mitokondrie-DNA methylering

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Enkelt dråbe Digital Polymerase Chain Reaction for omfattende og samtidige påvisning af mutationer i Hotspot regioner

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Celle baseret Assays af SINEUP ikke-kodende RNA'er, der specifikt kan forbedre mRNA Oversættelse

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Ved hjælp af in Vitro og i celler form at undersøge lille molekyle induceret Pre-mRNA strukturelle ændringer

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Overekspression længe Noncoding RNA'er ved hjælp af gen-aktivering CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...