Name: improving small rna-seq: less bias and better detection of 2'-o-methyl rnas
Uploaded: 2019-09-16T14:45:00
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Ces travaux ont été soutenus par le Centre national de la recherche scientifique (CNRS), la Commission Français des énergies alternatives et de l'énergie atomique (CEA) et l'Université Paris-Sud. Toutes les analyses de préparation de la bibliothèque, de séquençage de l'illumine et de bioinformatique pour cette étude ont été effectuées à l'installation de séquençage de nouvelle génération (NGS) de l'I2BC. Les membres de l'installation I2BC NGS sont reconnus pour la lecture critique du manuscrit et des suggestions utiles.

1. Isolement des petits ARN
<ol><li>Extraire l'ARN total à l'aide de réactifs à base de phénol ou de toute autre méthode. Vérifier si l'ARN est de bonne qualité.</li>
	<li>Pré-exécuter un gel TBE-urée de 15 % (voir Tableau des matériaux) pendant 15 min à 200 V.</li>
	<li>Pendant que le gel est pré-fonctionnement, mélangez 5-20 g d'ARN total dans un volume de 5-15 L avec un volume égal de colorant de chargement de formamide (voir Tableau des matériaux; formamide déionis...

<ol>
	<li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+silencing+RNAs:+an+expanding+universe.">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).</li><li>Chang, T. C., Mendell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNAs+in+vertebrate+physiology+and+human+disease.">microRNAs in vertebrate physiology and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).</li><li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+expression+profiling+by+high-throughput+sequencing:+implications+of+enzymatic+manipulation.">Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation.</a> Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).</li><li>van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library+preparation+methods+for+next-generation+sequencing:+tone+down+the+bias.">Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias.</a> Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).</li><li>Munafo, D. B., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+enzymatic+reaction+conditions+for+generating+representative+pools+of+cDNA+from+small+RNA.">Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA.</a> RNA. 16, 2537-2552 (2010).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries.">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17, 1697-1712 (2011).</li><li>Sorefan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+ligation+bias+of+small+RNAs+in+libraries+for+next+generation+sequencing.">Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing.</a> Silence. 3, 4 (2012).</li><li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bias-reducing+strategy+in+profiling+small+RNAs+using+Solexa.">A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa.</a> RNA. 17, 2256-2262 (2011).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).</li><li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+bias+in+T4+RNA+ligase-mediated+3'-adapter+ligation.">Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation.</a> Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).</li><li>Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bias+in+ligation-based+small+RNA+sequencing+library+construction+is+determined+by+adaptor+and+RNA+structure.">Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure.</a> PLoS One. 10, 0126049 (2015).</li><li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing.">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19, 118 (2018).</li><li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing.">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6, 26969 (2011).</li><li>Harrison, B., Zimmerman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-stimulated+ligation:+enhanced+ligation+of+oligo-+and+polynucleotides+by+T4+RNA+ligase+in+polymer+solutions.">Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions.</a> Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).</li><li>Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+ligation+dependent+artifacts+in+T4+RNA+ligase+to+achieve+high+efficiency+and+low+bias+microRNA+capture.">Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture.</a> PLoS One. 9, 94619 (2014).</li><li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing.">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14, 109 (2013).</li><li>Barberan-Soler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreasing+miRNA+sequencing+bias+using+a+single+adapter+and+circularization+approach.">Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach.</a> Genome Biology. 19, 105 (2018).</li><li>Chen, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cost-effective+method+for+Illumina+small+RNA-Seq+library+preparation+using+T4+RNA+ligase+1+adenylated+adapters.">A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters.</a> Plant Methods. 8, 41 (2012).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. , (2011).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10, 25 (2009).</li><li>Shore, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+Library+Preparation+Method+for+Next-Generation+Sequencing+Using+Chemical+Modifications+to+Prevent+Adapter+Dimer+Formation.">Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation.</a> PLoS One. 11, 0167009 (2016).</li></ol>

La préparation de la petite bibliothèque d'ARN demeure difficile en raison du biais, principalement introduit pendant les étapes de ligature d'adaptateur. Les ARN avec une modification de 2'-OMe à leur extrémité de 3' tels que les miARN de plante, le piRNA dans les insectes, les nématodes et les mammifères, et les petits ARN interférant (siRNA) dans les insectes et les usines sont particulièrement difficiles à étudier parce que la modification de 2'-OMe inhibe la ligature d'adaptateur de 3' Un certain nombre ...

Les petits ARN (ARN) sont impliqués dans le contrôle d'une diversité de processus biologiques1. Les ARS réglementaires eucaryotes ont généralement entre 20 et 30 nt de taille; les trois principaux types sont les microARN (miRNA), les ARN piwi-interacting (piRNA) et les petits ARN interférant (siRNA). Les niveaux aberrants d'expression de miRNA ont été impliqués dans une série de maladies2. Cela souligne l'importance des miARN dans les domaines de la santé et des maladies et l'exigence d'outils de recherche précis et quantitatifs pour détecter les ARS en général.
Le séquençage de nouvelle génération (NGS) est une méthode largement utilisée pour étudier les ARN. Principaux avantages de NGS par rapport à d'autres approches, telles que les techniques quantitatives PCR ou microarray (qPCR), sont qu'il n'a pas besoin d'une connaissance priori des séquences d'ARNs et peut donc être utilisé pour découvrir de nouvelles ARN, et en outre il souffre moins de signaux de fond et effets de saturation. En outre, il peut détecter les différences de nucléotide unique et a un débit plus élevé que les microréseaux. Cependant, NGS a également quelques inconvénients; le coût d'une exécution de séquençage reste relativement élevé et le processus en plusieurs étapes requis pour convertir un échantillon en bibliothèque pour le séquençage peut introduire des biais. Dans un processus typique de préparation de la bibliothèque sRNA, un adaptateur de 3' est d'abord ligaté à l'ARNs (souvent gel-purifié à partir de l'ARN total) en utilisant une version tronquée de ligase d'ARN 2 (RNL2) et un adaptateur préadenyé 3 ' (Figure 1) en l'absence d'ATP. Cela augmente l'efficacité de la ligature sRNA-adaptateur et réduit la formation de réactions latérales telles que la circularisation de sRNA ou la concatemerization. Par la suite, un adaptateur de 5' est ligated par la ligase 1 d'ARN (RNL1), suivi de la transcription inverse (RT) et de l'amplification de PCR. Toutes ces étapes peuvent introduire un biais3,4. Par conséquent, les nombres de lecture peuvent ne pas refléter les niveaux réels d'expression de l'ARNde conduisant à des modèles d'expression artificiels et dépendants de la méthode. Les ARS spécifiques peuvent être surreprésentées ou sous-représentées dans une bibliothèque, et les ARS fortement sous-représentés peuvent échapper à la détection. La situation est particulièrement compliquée avec les miARN végétaux, les siRNAs chez les insectes et les plantes, et les piARN chez les insectes, les nématodes et les mammifères, dans lesquels le nucléotide terminal de 3' a une modification de 2'-O-méthyle (2'-OMe)1. Cette modification inhibe fortement la ligature adaptatrice de 3'5, ce qui rend la préparation de la bibliothèque pour ces types d'ARN une tâche difficile.
Les travaux antérieurs ont démontré que la ligature adaptateur introduit un biais sérieux, en raison de la séquence d'ARN / effets de structure6,7,8,9,10,11. Les étapes en aval de la ligature adaptateur tels que la transcription inversée et PCR ne contribuent pas de manière significative au biais6,11,12. Le biais de ligation est probablement dû au fait que les molécules adaptatrices avec une séquence donnée interagiront avec les molécules d'ARS dans le mélange de réaction pour former des co-plis, qui peuvent conduire à des configurations favorables ou défavorables pour la ligature (Figure 2). Les données de Sorefan etcoll. 7 suggèrent que RNL1 préfère un seul contexte échoué, tandis que RNL2 préfère un double brin pour la ligature. Le fait que les structures de co-pliage adaptateur/sRNA soient déterminées par l'adaptateur spécifique et les séquences sRNA explique pourquoi l'ARNs spécifique est surreprésenté ou sous-représenté avec un ensemble d'adaptateurs donné. Il est également important de noter que dans une série de bibliothèques sRNA à comparer, les mêmes séquences d'adaptateur doivent être utilisées. En effet, il a déjà été observé que le changement des adaptateurs par l'introduction de différentes séquences de codes à barres modifie les profils miRNA dans les bibliothèques de séquençage9,13.
La randomisation des séquences d'adaptateur près de la jonction de ligature réduit probablement ces biais. Sorefan et ses collègues7 ont utilisé des adaptateurs avec 4 nucléotides aléatoires à leurs extrémités, désignés adaptateurs « Haute Définition » (HD) et ont montré que l'utilisation de ces adaptateurs conduit à des bibliothèques qui reflètent mieux les niveaux d'expression de l'ARNs véritable. Des travaux plus récents ont confirmé ces observations et révélé que la région randomisée n'a pas besoin d'être adjacente à la jonction de ligature11. Ce nouveau type d'adaptateurs a été nommé "MidRand" adaptateurs. Ensemble, ces résultats démontrent qu'une meilleure conception de l'adaptateur peut réduire les biais.
Au lieu de modifier les adaptateurs, le biais peut être supprimé par l'optimisation des conditions de réaction. Polyéthylène glycol (PEG), un agent de crowding macromoléculaire connu pour augmenter l'efficacité de ligature14, a été montré pour réduire de manière significative le biais15,16. Sur la base de ces résultats, plusieurs kits « faible biais » sont apparus sur le marché. Il s'agit notamment de kits qui utilisent PEG dans les réactions de ligature, soit en combinaison avec des adaptateurs classiques ou adaptateurs HD. D'autres kits évitent la ligature tout à fait, et utilisent 3' polyadenylation et la commutation de modèle pour 3' et 5' adaptateur d'ajout, respectivement12. Dans une autre stratégie, la ligature de l'adaptateur 3' est suivie d'une étape de circularisation, omettant ainsi la ligation de l'adaptateur5' 17.
Dans une étude précédente, nous avons cherché un protocole de préparation de bibliothèque d'ARND avec les niveaux les plus bas possibles de biais et la meilleure détection de 2'-OMe RNAs12. Nous avons testé quelques-uns des kits « faible biais » mentionnés ci-dessus, qui avaient une meilleure détection des ARN 2'-OMe que le protocole standard (TS). Étonnamment cependant, lors de la modification (l'utilisation d'adaptateurs randomisés, PEG dans les réactions de ligature et la suppression de l'excès 3' adaptateur par purification) ce dernier a surpassé les autres protocoles pour la détection de 2'-OMe RNAs. Ici, nous décrivons en détail un protocole basé sur le protocole TS, 'TS5', qui avait la meilleure détection globale de 2'-OMe RNAs. Le protocole peut être suivi à l'aide de réactifs du kit TS et d'un réactif du kit 'Nf' ou, pour économiser de l'argent, en utilisant des réactifs faits maison, avec des performances égales. Nous fournissons également un protocole détaillé pour la purification de l'ARNs à partir de l'ARN total et la préparation de l'adaptateur préadenyé de 3'.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:873px;" width="874">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">2100 Bioanalyzer Instrument&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">G2939BA</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td style="width:159px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:169px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Bioanalyzer Small RNA Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">5067-1548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS8162-96EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Dark Reader transilluminator</td>
			<td style="width:159px;">various suppiers</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">HotStart PCR Kit, with dNTPs</td>
			<td style="width:159px;">Kapa Biosystems</td>
			<td>KK2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">NEXTflex small RNA-seq V3 kit</td>
			<td style="width:159px;">BIOO Scientific</td>
			<td style="width:169px;">NOVA-5132-05</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Novex TBE gels 6%</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Novex TBE Urea gels 15%</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EC6885BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td style="width:159px;">Qiagen&#160;</td>
			<td style="width:169px;">28304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Qubit 4 Quantitation Starter Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">Q33227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Qubit ssDNA Assay Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:374px;">RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">RNase Inhibitor, Murine&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">18090200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:28px;width:374px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">T4 RNA Ligase 2, truncated</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrackIt 50 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">10488043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">TruSeq Small RNA Library Prep Kit</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td>RS-200-0012/24/36/48</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Glycogen</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>10814010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">ZR small RNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:169px;">R1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td>the last two numbers correspond to the set of indexes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving small rna-seq: less bias and better detection of 2'-o-methyl rnas

L'étude des petits ARN (ARN) par séquençage de la prochaine génération (NGS) est remise en question par des problèmes de partialité pendant la préparation de la bibliothèque. Plusieurs types d'ARNde tels que les microARN végétaux (miARN) portent une modification de 2'-O-méthyle (2'-OMe) à leur nucléotide terminal de 3'. Cette modification ajoute une autre difficulté car elle inhibe la ligature de l'adaptateur de 3'. Nous avons déjà démontré que les versions modifiées du protocole 'TruSeq (TS)' ont moins de biais et une meilleure détection des ARN 2'-OMe. Ici, nous décrivons en détail le protocole 'TS5', qui a montré la meilleure performance globale. TS5 peut être suivi soit à l'aide de réactifs faits maison ou de réactifs du kit TS, avec des performances égales.

Les étapes critiques sont l'isolement de la petite fraction d'ARN du matériel d'ARN total de départ (figure 3) et le produit final de la bibliothèque souhaité (figure 4). Les deux étapes impliquent la purification de gel de polyacrylamide ; le petit ARN est isolé des gels d'urée de TBE de 15%, tandis que les bibliothèques finales sont isolées des gels tBE indigènes de 6%. Le petit ARN isolé du gel peut être analysé sur une petite puce d'électropho...

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Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

Nous présentons un protocole détaillé de réparation de petite bibliothèque d'ARN avec moins de biais que les méthodes standard et une sensibilité accrue pour les ARN 2'-O-méthyle. Ce protocole peut être suivi à l'aide de réactifs faits maison pour économiser des coûts ou en utilisant des kits pour plus de commodité.

Améliorer l'ARN-seq : moins de biais et une meilleure détection des ARN 2'-O-Methyl

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

Les petits ARN régulent de nombreux processus biologiques. Il est donc important de développer des méthodes sensibles et impartiales pour les détecter. Notre protocole prévoit des avancées vers cet objectif.Notre protocole souffre de moins de problèmes de biais, que les méthodes classiques d’appropriation des petites bibliothèques d’ARN, et surtout il permet une détection plus sensible de deux dents ou méso-ARN. Comme les micro-ARN végétaux. Après avoir extrait l’ARN total selon les protocoles standard.Pré-exécuter un gel d’urée 15%TBE pendant quinze minutes à 200 volts. Et mélanger cinq à vingt microgrammes d’ARN total, dans un volume de cinq à quinze microlitres, avec un volume égal de colorant de chargement de formamide dans un tube de 200 microlitres. Après cinq minutes à 65 degrés Celsius, dans un thermocycler avec couvercle chauffant, placez immédiatement les tubes sur la glace et chargez ce dernier et échantillonner sur le gel avec au moins une voie entre eux.Ensuite, faire fonctionner le gel à 200 volts jusqu’à ce que le bromophénol a migré environ les deux tiers de la longueur du gel. Pour charger l’ARN, perforez d’abord le fond d’un tube de micro centrifugeuse sans nucléase de 0,5 millilitre, avec une aiguille de calibre 21, et placez le tube perforé dans un tube de micro centrifugeuse de deux millilitres sans nucléase. Ensuite, incuber le gel à température ambiante avec des taches de gel d’acide nucléique dans l’eau pendant dix à quinze minutes, avant de regarder le gel sur un transilluminateur.Découpez l’ARN échantillon entre 17 et 29 bandes d’échelle de nucléotide, et transférez le morceau de gel dans le tube perforé. Faites tourner le gel dans une micro centrifugeuse à vitesse maximale pendant deux minutes et retirez le tube de 0,5 millilitre qui doit maintenant être vide. Ajouter 300 microlitres de chlorure de sodium sans nucléase 0,3 molaire au gel concassé et placer le tube sur un rotateur pendant au moins deux heures à température ambiante.À la fin de l’incubation, transférer la suspension des morceaux de gel concassé dans une colonne de spin et la centrifugeuse pendant deux minutes à vitesse maximale dans la micro centrifugeuse. Pour l’élimination non admissible de trois adaptateurs principaux, mélangez soigneusement dix microlitres d’eau sans nucléase avec l’échantillon extrait d’ARN, et ajoutez six microlitres de trois molaires d’acétate de sodium avec mélange. Ajouter 40 microlitres de perles de purification magnétique, et 60 microlitres d’isopropanol à l’échantillon avec un mélange complet.Et incuber la suspension pendant cinq minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, placez l’échantillon sur un support magnétique, jusqu’à ce que la solution devienne claire. Retirer le supernatant clair et ajouter 180 microlitres d’éthanol fraîchement préparé à 80 % aux perles.Après 30 secondes, retirer l’éthanol et faire tourner brièvement le tube. Retirer tout liquide résiduel qui aurait pu être recueilli au fond du tube et laisser sécher les perles pendant deux minutes avant de suspendre à nouveau l’échantillon dans 22 microlitres de Tris de 10 millimolaires. Après deux minutes magnétiser l’échantillon jusqu’à ce que la solution semble claire.Ensuite, mélangez 20 microlitres de supernatant clair avec six microlitres de trois acétate de sodium molaire dans un nouveau tube, et ajoutez 40 microlitres de perles magnétiques et 60 microlitres de 100% isopropanol. Après cinq minutes à température ambiante, magnétiser l’échantillon jusqu’à ce que la solution semble claire, avant d’enlever le surnatant. Traitez l’échantillon avec 180 microlitres d’éthanol fraîchement préparé à 80 % pendant 30 secondes avant d’enlever l’éthanol qui tourne sur l’échantillon et d’éliminer tout liquide résiduel qui s’est accumulé au fond du tube.Après avoir laissé sécher les perles pendant deux minutes, suspendez-les en 10 microlitres d’eau libre de nucléase, pendant deux minutes, avant de magnétiser l’échantillon jusqu’à ce que la solution devienne claire. Ensuite, transférez neuf microlitres de supernatant dans un nouveau tube et ajoutez un microlitre de tampon ligase d’ARN T4, et un micrcoliter d’eau à l’échantillon. Pour la purification du gel, exécutez cinq, dix et vingt microlitres de produit PCR sur un gel natif 6%TBE pendant environ une heure.Incuber le gel complété avec de la tache de gel acide nucléique dans l’eau pendant dix à quinze minutes, et voir le gel sur un transilluminateur pour permettre l’extraction de la bande de bibliothèque de 150 paires de base. Comme il est difficile d’isoler la bande de 150 paires de base qui les représente, il s’agit de notre bibliothèque, en raison de la présence de produits secondaires à migration étroite, vous devrez couper le gel très soigneusement. Puis isoler l’ARN comme vient de le démontrer.Pour la modification brute du fichier séquence, téléchargez les fichiers de séquence fastq générés pendant l’exécution de séquençage, et préformez le démultiplexing avec bcl2fastq2 au besoin. Supprimez les séquences d’adaptateur à l’aide de cutodapt et utilisez la commande comme démontré. Utilisez seqtk comme indiqué pour supprimer les nucléotides aléatoires terminaux dans les séquences lues.Ensuite, utilisez la commande awk comme indiqué, pour jeter les séquences de moins de 10 nucléotides. Pour cartographier les séquences parées, ouvrez miRBase et téléchargez le fichier fa mature. Utilisez la commande comme indiqué pour remplacer les résidus de U par des résidus de T, pour donner une liste complète de tous les micro ARN dans la base de données, provenant d’une variété d’organismes.Sélectionnez les séquences de micro ARN de l’organisme d’intérêt, avec la commande indiquée, et cartographiez les lectures du fichier à l’aide du nœud papillon2, ne permettant aucun décalage. Utilisez l’outil pour aligner les séquences lues à la base de données, exigeant qu’une lecture des cartes entièrement à un micro ARN de la base de données, avec toutes les inadéquations comme indiqué. Ensuite, utilisez la commande pour jeter les lectures qui ne s’alignent pas.Après avoir chargé des quantités croissantes d’une bibliothèque amplifiée pcr sur un gel comme démontré, les produits correspondant à la taille prévue peuvent être extraits. Après l’éution, la bibliothèque purifiée peut être vérifiée sur une puce d’électrophoresis de gel capillaire. En plus des 150 paires de base prévues, et la proportion croissante d’une paire de 130 espèces correspondant à des dimers adaptateurs, sont généralement observés à mesure que la quantité croissante de produits PCR est chargée.Des résultats similaires sont obtenus lorsque les bibliothèques d’un mélange de petits ARN synthétiques sont préparées à l’aide de réapprovisionnements provenant de kits ou d’autres fournitures. À titre de comparaison, les résultats précédemment publiés pour le même petit mélange d’ARN sont affichés. Ici, une comparaison pour l’exécution du protocole TS5 avec le protocole TS standard pour la détection de l’homme non modifié et deux principaux O-methal modifiés plantes micro ARN est montré.La détection de deux piARN modifiés O-methal dans des échantillons humains a également été testée. Comme on l’a observé TS5 préformé significativement mieux que TS pour la détection de deux ARN O-methal premier, mais pas pour les ARN non modifiés. Préparez des bibliothèques de reproduction pour chaque échantillon à des dates différentes.Habituellement, il y a peu de variation entre les répliques faites simultanément, ou il peut y avoir des variations substantielles entre les bibliothèques préparées à des dates différentes.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Détection de Copy Number Transformations Utilisation unique cellule de séquençage

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Recherche

Génétique

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Reconnaissance de séquence-spécifique et sélective d’ARN Double-brin sur ARN monocaténaire par chimiquement modifiées acides nucléiques peptidiques

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Marquage métabolique et profilage des ARN de transfert à l’aide de macroréseaux

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR induite par la réorganisation de la Structure de la chromatine boucle

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