Name: improving small rna-seq: less bias and better detection of 2'-o-methyl rnas
Uploaded: 2019-09-16T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom National Center for Scientific Research (CNRS), der Französischen Kommission für alternative Energien und Atomenergie (CEA) und der Universität Paris-Sud unterstützt. Alle Bibliotheksvorbereitungs-, Illumina-Sequenzierungs- und Bioinformatik-Analysen für diese Studie wurden in der I2BC Next-Generation Sequencing (NGS)-Anlage durchgeführt. Die Mitglieder der I2BC NGS-Einrichtung werden für die kritische Lektüre des Manuskripts und hilfreiche Vorschläge gewürdigt.

1. Isolierung kleiner RNAs
<ol><li>Extrahieren Sie die gesamte RNA mit phenolbasierten Reagenzien oder einer anderen Methode. Überprüfen Sie, ob die RNA von guter Qualität ist.</li>
	<li>Führen Sie ein 15% TBE-Harnstoffgel (siehe Materialtabelle) 15 min bei 200 V vor.</li>
	<li>Während das Gel vorlaufend ist, mischen Sie 5-20 g Gesamt-RNA in einem Volumen von 5-15 l mit einem gleichen Volumen von Formamid-Ladefarbstoff (siehe Tabelle der Materialien;95% deionisiertes Formamid, 0,0...

<ol>
	<li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+silencing+RNAs:+an+expanding+universe.">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).</li><li>Chang, T. C., Mendell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNAs+in+vertebrate+physiology+and+human+disease.">microRNAs in vertebrate physiology and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).</li><li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+expression+profiling+by+high-throughput+sequencing:+implications+of+enzymatic+manipulation.">Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation.</a> Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).</li><li>van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library+preparation+methods+for+next-generation+sequencing:+tone+down+the+bias.">Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias.</a> Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).</li><li>Munafo, D. B., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+enzymatic+reaction+conditions+for+generating+representative+pools+of+cDNA+from+small+RNA.">Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA.</a> RNA. 16, 2537-2552 (2010).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries.">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17, 1697-1712 (2011).</li><li>Sorefan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+ligation+bias+of+small+RNAs+in+libraries+for+next+generation+sequencing.">Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing.</a> Silence. 3, 4 (2012).</li><li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bias-reducing+strategy+in+profiling+small+RNAs+using+Solexa.">A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa.</a> RNA. 17, 2256-2262 (2011).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).</li><li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+bias+in+T4+RNA+ligase-mediated+3'-adapter+ligation.">Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation.</a> Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).</li><li>Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bias+in+ligation-based+small+RNA+sequencing+library+construction+is+determined+by+adaptor+and+RNA+structure.">Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure.</a> PLoS One. 10, 0126049 (2015).</li><li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing.">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19, 118 (2018).</li><li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing.">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6, 26969 (2011).</li><li>Harrison, B., Zimmerman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-stimulated+ligation:+enhanced+ligation+of+oligo-+and+polynucleotides+by+T4+RNA+ligase+in+polymer+solutions.">Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions.</a> Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).</li><li>Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+ligation+dependent+artifacts+in+T4+RNA+ligase+to+achieve+high+efficiency+and+low+bias+microRNA+capture.">Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture.</a> PLoS One. 9, 94619 (2014).</li><li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing.">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14, 109 (2013).</li><li>Barberan-Soler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreasing+miRNA+sequencing+bias+using+a+single+adapter+and+circularization+approach.">Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach.</a> Genome Biology. 19, 105 (2018).</li><li>Chen, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cost-effective+method+for+Illumina+small+RNA-Seq+library+preparation+using+T4+RNA+ligase+1+adenylated+adapters.">A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters.</a> Plant Methods. 8, 41 (2012).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. , (2011).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10, 25 (2009).</li><li>Shore, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+Library+Preparation+Method+for+Next-Generation+Sequencing+Using+Chemical+Modifications+to+Prevent+Adapter+Dimer+Formation.">Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation.</a> PLoS One. 11, 0167009 (2016).</li></ol>

Die Vorbereitung der kleinen RNA-Bibliothek bleibt aufgrund von Verzerrungen schwierig, die hauptsächlich während der Adapterligationsschritte eingeführt werden. RNAs mit einer 2'-OMe-Modifikation an ihrem 3'-Ende wie pflanzliche miRNAs, piRNA bei Insekten, Nematoden und Säugetieren und kleine störende RNAs (siRNA) in Insekten und Pflanzen sind besonders schwer zu untersuchen, da die 2'-OMe-Modifikation 3' Adapterligation hemmt. Eine Reihe von Lösungen wurden in der Literatur vorgeschlagen, um sRNA-Bibliotheksvorbe...

Kleine RNAs (sRNAs) sind an der Kontrolle einer Vielfalt biologischer Prozesse beteiligt1. Eukaryotische regulatorische sRNAs sind in der Regel zwischen 20 und 30 nt groß; Die drei Haupttypen sind microRNAs (miRNA), piwi-interagierende RNAs (piRNA) und kleine störende RNAs (siRNA). Aberrante miRNA-Expressionsniveaus wurden in eine Vielzahl von Krankheiten verwickelt2. Dies unterstreicht die Bedeutung von miRNAs in Gesundheit und Krankheit und die Forderung nach genauen, quantitativen Forschungsinstrumenten zum Nachweis von sRNAs im Allgemeinen.
Die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) ist eine weit verbreitete Methode zum Untersuchen von sRNAs. Die Hauptvorteile von NGS im Vergleich zu anderen Ansätzen, wie quantitativepcR- oder Mikroarray-Techniken (qPCR), bestehen darin, dass es keine a priori-Kenntnisse der sRNA-Sequenzen benötigt und daher verwendet werden kann, um neuartige RNAs zu entdecken, und darüber hinaus leidet es weniger unter Hintergrundsignal- und Sättigungseffekte. Darüber hinaus kann es einzelne Nukleotidunterschiede erkennen und hat einen höheren Durchsatz als Mikroarrays. NGS hat jedoch auch einige Nachteile; Die Kosten für einen Sequenzierungslauf bleiben relativ hoch, und der mehrstufige Prozess, der zum Konvertieren einer Stichprobe in eine Bibliothek für die Sequenzierung erforderlich ist, kann zu Verzerrungen führen. In einem typischen sRNA-Bibliotheksvorbereitungsprozess wird ein 3'-Adapter zunächst mit einer abgeschnittenen Version von RNA Ligase 2 (RNL2) und einem vorgefertigten 3'-Adapter(Abbildung 1) in Abwesenheit von ATP an die sRNA (oft gelgereinigt von der Gesamt-RNA) gebunden. Dies erhöht die Effizienz der sRNA-Adapterligation und reduziert die Bildung von Seitenreaktionen wie sRNA-Zirkularisation oder Konthespirierung. Anschließend wird ein 5'-Adapter durch RNA Ligase 1 (RNL1) ligiert, gefolgt von Reverse Transkription (RT) und PCR-Verstärkung. Alle diese Schritte können Voreingenommenheit3,4einführen. Folglich spiegeln Lesezahlen möglicherweise nicht die tatsächlichen sRNA-Expressionsniveaus wider, die zu künstlichen, methodenabhängigen Expressionsmustern führen. Bestimmte sRNAs können in einer Bibliothek entweder über- oder unterrepräsentiert sein, und stark unterrepräsentierte sRNAs können der Erkennung entgehen. Besonders kompliziert ist die Situation bei pflanzlichen miRNAs, siRNAs in Insekten und Pflanzen und piRNAs bei Insekten, Nematoden und Säugetieren, bei denen das 3' Terminalnukleotid eine 2'-O-Methyl(2'-OMe)-Modifikationhat 1. Diese Modifikation hemmt die 3' Adapterligation5stark, was die Bibliotheksvorbereitung für diese Arten von RNA zu einer schwierigen Aufgabe macht.
Frühere Arbeiten zeigten, dass Adapterligation aufgrund von RNA-Sequenz-/Struktureffekten6,7,8,9,10,11eine schwerwiegende Verzerrung einführt. Schritte nach der Adapterligation wie Reverse Transkription und PCR tragen nicht wesentlich zur Verzerrung6,11,12bei. Ligationsverzerrung ist wahrscheinlich aufgrund der Tatsache, dass Adaptermoleküle mit einer bestimmten Sequenz mit sRNA-Molekülen in der Reaktionsmischung interagieren, um Co-Folds zu bilden, die entweder zu günstigen oder ungünstigen Konfigurationen für Ligation führen können (Abbildung 2). Daten von Sorefan et al7 deuten darauf hin, dass RNL1 einen einzelnen gestrandeten Kontext bevorzugt, während RNL2 einen Doppelstrang für Ligation bevorzugt. Die Tatsache, dass die Adapter/sRNA-Ko-Faltstrukturen durch die spezifischen Adapter- und sRNA-Sequenzen bestimmt werden, erklärt, warum bestimmte sRNA mit einem gegebenen Adaptersatz über- oder unterrepräsentiert sind. Es ist auch wichtig zu beachten, dass innerhalb einer Reihe von sRNA-Bibliotheken verglichen werden sollten, die gleichen Adaptersequenzen verwendet werden sollten. In der Tat wurde bisher beobachtet, dass das Ändern von Adaptern durch die Einführung verschiedener Barcodesequenzen miRNA-Profile in Sequenzierungsbibliotheken9,13verändert.
Die Randomisierung von Adaptersequenzen in der Nähe des Ligationsknotens reduziert diese Verzerrungen wahrscheinlich. Sorefan und Kollegen7 verwendeten Adapter mit 4 zufälligen Nukleotiden an ihren Extremitäten, die als "High Definition" (HD) Adapter bezeichnet wurden, und zeigten, dass die Verwendung dieser Adapter zu Bibliotheken führt, die echte sRNA-Expressionsniveaus besser widerspiegeln. Neuere Arbeiten bestätigten diese Beobachtungen und zeigten, dass die randomisierte Region nicht an die Ligationskreuzung11angrenzen muss. Diese neuartige Art von Adaptern wurde "MidRand" Adapter genannt. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass ein verbessertes Adapterdesign Verzerrungen reduzieren kann.
Anstatt die Adapter zu modifizieren, kann Die Verzerrung durch die Optimierung der Reaktionsbedingungen unterdrückt werden. Polyethylenglykol (PEG), ein makromolekulares Crowding-Mittel, das bekanntermaßen die Ligationseffizienz14erhöht, hat gezeigt, dass es die Verzerrung15,16signifikant reduziert. Basierend auf diesen Ergebnissen erschienen mehrere "Low Bias"-Kits auf dem Markt. Dazu gehören Kits, die PEG in den Ligationsreaktionen verwenden, entweder in Kombination mit klassischen Adaptern oder HD-Adaptern. Andere Kits vermeiden Ligation ganz, und verwenden 3' Polyadenylierung und Template-Switching für 3' und 5' Adapter Addition, bzw.12. In einer weiteren Strategie folgt 3' Adapterligation durch einen Zirkularisierungsschritt, wodurch 5' Adapterligation17weggelassen wird.
In einer früheren Studie haben wir nach einem sRNA-Bibliotheksvorbereitungsprotokoll mit den geringstmöglichen Voreingenommenheitsgraden und der besten Detektion von 2'-OMe RNAs12gesucht. Wir haben einige der oben genannten "Low Bias"-Kits getestet, die eine bessere Erkennung von 2'-OMe RNAs als das Standardprotokoll (Standard Protocol, TS) hatten. Überraschenderweise jedoch bei der Modifikation (die Verwendung von randomisierten Adaptern, PEG in den Ligationsreaktionen und Entfernung von überschüssigen 3' Adapter durch Reinigung) übertraf letztere die anderen Protokolle für die Erkennung von 2'-OMe RNAs. Hier beschreiben wir detailliert ein Protokoll, das auf dem TS-Protokoll 'TS5' basiert und die beste Gesamterkennung von 2'-OMe RNAs hatte. Das Protokoll kann mit Reagenzien aus dem TS-Kit und einem Reagenz aus dem "Nf"-Kit oder, um Geld zu sparen, mit hausgemachten Reagenzien, mit gleicher Leistung befolgt werden. Wir bieten auch ein detailliertes Protokoll für die Reinigung von sRNA aus der gesamten RNA und die Herstellung von präadenylierten 3' Adapter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:873px;" width="874">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">2100 Bioanalyzer Instrument&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">G2939BA</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td style="width:159px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:169px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Bioanalyzer Small RNA Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">5067-1548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS8162-96EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Dark Reader transilluminator</td>
			<td style="width:159px;">various suppiers</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">HotStart PCR Kit, with dNTPs</td>
			<td style="width:159px;">Kapa Biosystems</td>
			<td>KK2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">NEXTflex small RNA-seq V3 kit</td>
			<td style="width:159px;">BIOO Scientific</td>
			<td style="width:169px;">NOVA-5132-05</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Novex TBE gels 6%</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Novex TBE Urea gels 15%</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EC6885BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td style="width:159px;">Qiagen&#160;</td>
			<td style="width:169px;">28304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Qubit 4 Quantitation Starter Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">Q33227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Qubit ssDNA Assay Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:374px;">RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">RNase Inhibitor, Murine&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">18090200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:28px;width:374px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">T4 RNA Ligase 2, truncated</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrackIt 50 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">10488043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">TruSeq Small RNA Library Prep Kit</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td>RS-200-0012/24/36/48</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Glycogen</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>10814010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">ZR small RNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:169px;">R1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td>the last two numbers correspond to the set of indexes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving small rna-seq: less bias and better detection of 2'-o-methyl rnas

Die Untersuchung kleiner RNAs (sRNAs) durch Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) wird durch Voreingenommenheitsprobleme während der Bibliotheksvorbereitung in Frage gestellt. Mehrere Arten von sRNA, wie z. B. pflanzliche microRNAs (miRNAs), tragen eine 2'-O-Methyl(2'-OMe) Modifikation an ihrem 3' Terminalnukleotid. Diese Änderung fügt eine weitere Schwierigkeit hinzu, da sie 3' Adapterligation hemmt. Wir haben zuvor gezeigt, dass modifizierte Versionen des 'TruSeq (TS)'-Protokolls weniger Voreingenommenheit und eine verbesserte Erkennung von 2'-OMe RNAs haben. Hier beschreiben wir im Detail Protokoll 'TS5', das die beste Gesamtleistung zeigte. TS5 kann entweder mit hausgemachten Reagenzien oder Reagenzien aus dem TS-Kit mit gleicher Leistung verfolgt werden.

Kritische Schritte sind die Isolierung des kleinen RNA-Anteils des Startgesamt-RNA-Materials (Abbildung 3) und des gewünschten Endbibliotheksprodukts (Abbildung 4). Beide Schritte beinhalten Polyacrylamid-Gel-Reinigung; kleine RNA wird aus 15% TBE Harnstoffgelen isoliert, während die endgültigen Bibliotheken aus 6% nativen TBE-Gelen isoliert sind. Kleine rna isoliert aus Gel kann auf einem kleinen RNA Kapillarelektrophorese Chip analysiert werden (Tab...

Watch this Scientific Journal Video about Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs at JoVE.com

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

Wir präsentieren ein detailliertes reparaturbasiertes Analyseprotokoll für kleine RNA-Bibliotheken mit weniger Voreingenommenheit als Standardmethoden und einer erhöhten Empfindlichkeit für 2'-O-Methyl-RNAs. Dieses Protokoll kann mit hausgemachten Reagenzien befolgt werden, um Kosten zu sparen oder Kits für die Bequemlichkeit zu verwenden.

Verbesserung der kleinen RNA-Seq: Weniger Voreingenommenheit und bessere Detektion von 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

Kleine RNA regulieren viele biologische Prozesse. Daher ist es wichtig, sensible und unvoreingenommene Methoden zu ihrer Erkennung zu entwickeln. Unser Protokoll bietet Fortschritte in Richtung dieses Ziels.Unser Protokoll leidet unter weniger Voreingenommenheitsproblemen als klassische Methoden zur Aneignung von RNA-Bibliotheken, und vor allem ermöglicht es eine sensiblere Detektion von zwei Prong- oder Meso-RNAs. Wie z. B. pflanzliche Mikro-RNAs. Nach Extraktion der gesamten RNA nach Standardprotokollen.Führen Sie ein 15%TBE Harnstoffgel für 15 Minuten bei 200 Volt vor. Und mischen Sie fünf bis zwanzig Mikrogramm gesamter RNA in einem Volumen von fünf bis fünfzehn Mikrolitern mit einem gleichen Volumen an Formamid-Ladefarbstoff in einem 200-Mikroliter-Rohr. Nach fünf Minuten bei 65 Grad Celsius, in einem Thermocycler mit einem beheizten Deckel, sofort die Rohre auf Eis legen und die letztere belasten und auf das Gel mit mindestens einer Spur zwischen ihnen proben.Dann laufen Sie das Gel bei 200 Volt, bis das Bromphenol etwa zwei Drittel der Länge des Gels migriert hat. Um die RNA zu laden, punktieren Sie zuerst den Boden eines Nuklease-freien 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohrs mit einer 21-Spur-Nadel und legen Sie das punktierte Rohr in einen nukleasefreien runden Boden zwei Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Als nächstes inkubieren Sie das Gel bei Raumtemperatur mit Nukleinsäure-Gelfleck in Wasser für zehn bis fünfzehn Minuten, bevor Sie das Gel auf einem Transilluminator betrachten.Schneiden Sie die Proben-RNA zwischen 17 und 29 Nukleotidleiterbändern aus und übertragen Sie das Gelstück in das punktierte Rohr. Drehen Sie das Gel in einer Mikrozentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit für zwei Minuten, und entfernen Sie das 0,5 Milliliter Rohr, das jetzt leer sein sollte. Fügen Sie dem zerkleinerten Gel 300 Mikroliter Nukleasefreies 0,3 Molaren-Natriumchlorid hinzu und legen Sie das Rohr mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einen Rotator.Am Ende des Endes der Inkubation die Suspension der zerkleinerten Gelteile in eine Spinsäule und zentrifugieren Sie zwei Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit in der Mikrozentrifuge. Für die Elimination von drei Prime-Adaptern zehn Mikroliter freies Wasser mit der extrahierten RNA-Probe gründlich mischen und sechs Mikroliter von drei Molaren-Natriumacetat mit Mischen hinzufügen. Fügen Sie 40 Mikroliter magnetische Reinigungsperlen und 60 Mikroliter Isopropanol mit gründlicher Durchmischung in die Probe ein.Und die Suspension für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Am Ende der Inkubation die Probe auf ein magnetisches Rack legen, bis die Lösung klar wird. Entfernen Sie den klaren Überstand und fügen Sie 180 Mikroliter frisch zubereitetes 80%Ethanol in die Perlen.Entfernen Sie nach 30 Sekunden das Ethanol und drehen Sie das Rohr kurz. Entfernen Sie alle Restflüssigkeiten, die sich an der Unterseite des Rohres gesammelt haben, und lassen Sie die Perlen für zwei Minuten trocknen, bevor Sie die Probe in 22 Mikrolitern von 10 Millimolaren Tris wieder aufhängen. Nach zwei Minuten magnetisieren Sie die Probe, bis die Lösung klar erscheint.Als nächstes mischen Sie 20 Mikroliter klaren Überstand mit sechs Mikrolitern von drei Molaren-Natriumacetat in einem neuen Rohr, und fügen Sie 40 Mikroliter magnetische Perlen und 60 Mikroliter 100%Isopropanol. Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur die Probe magnetisieren, bis die Lösung klar erscheint, bevor Sie den Überstand entfernen. Behandeln Sie die Probe mit 180 Mikroliter frisch zubereitetem 80%Ethanol für 30 Sekunden, bevor Sie das Ethanol entfernen, das die Probe herunterdreht, und entfernen Sie alle Restflüssigkeiten, die sich an der Unterseite des Rohres angesammelt haben.Nachdem Sie die Perlen für zwei Minuten trocknen lassen, setzen Sie sie in 10 Mikroliter nukleasefreies Wasser für zwei Minuten wieder auf, bevor Sie die Probe magnetisieren, bis die Lösung klar wird. Dann übertragen Sie neun Mikroliter Überstand in ein neues Rohr und fügen Sie einen Mikroliter T4-RNA-Ligasepuffer und einen Micrcoliter Wasser in die Probe. Für die Gelreinigung fünf, zehn und zwanzig Mikroliter PCR-Produkt auf einem nativen 6%TBE-Gel für etwa eine Stunde laufen.Inkubieren Sie das fertige Gel mit Nukleinsäure-Gel-Färbung in Wasser für zehn bis fünfzehn Minuten, und sehen Sie sich das Gel auf einem Transilluminator an, um die Extraktion des 150 Base pair Bibliotheksbandes zu ermöglichen. Da es schwierig ist, das 150 Basispaarband, das sie darstellt, zu isolieren, sind dies unsere Bibliothek, aufgrund des Vorhandenseins von eng migrierenden Nebenprodukten müssen Sie das Gel sehr sorgfältig schneiden. Dann isolieren Sie die RNA, wie gerade gezeigt.Laden Sie für die Änderung der Rohsequenzdatei die fastq-Sequenzdateien herunter, die während des Sequenzierungslaufs generiert wurden, und preform demultiplexing mit bcl2fastq2 bei Bedarf. Entfernen Sie Adaptersequenzen mit cutodapt, und verwenden Sie den Befehl wie gezeigt. Verwenden Sie seqtk, wie angegeben, um die terminalen zufälligen Nukleotide in den Sequenzen zu entfernen.Verwenden Sie dann den Befehl awk wie angegeben, um die Sequenzen zu verwerfen, die kürzer als 10 Nukleotide sind. Um die getrimmten Sequenzen zuzuordnen, öffnen Sie miRBase und laden Sie die ausgereifte Fa-Datei herunter. Verwenden Sie den angegebenen Befehl, um U-Rückstände durch T-Rückstände zu ersetzen, um eine vollständige Liste aller Mikro-RNAs in der Datenbank zu erstellen, die aus einer Vielzahl von Organismen stammen.Wählen Sie die Mikro-RNA-Sequenzen des Organismus von Interesse, mit dem Befehl wie angegeben, und ordnen Sie die Lesevorgänge der Datei mit bowtie2, so dass keine Inkongruenzen. Verwenden Sie das Tool, um die Sequenzen in der Datenbank auszurichten, sodass ein Lesecode vollständig einer Mikro-RNA der Datenbank zugeordnet werden muss, ohne dass die sukzessorische Übereinstimmungen, wie angegeben, enthalten sind. Verwenden Sie dann den Befehl, um die Lesevorgänge zu verwerfen, die nicht ausgerichtet wurden.Nachdem die Mengen einer PCR-verstärkten Bibliothek wie nachgewiesen auf ein Gel geladen wurden, können die Produkte, die der erwarteten Größe entsprechen, extrahiert werden. Nach der Elution kann die gereinigte Bibliothek auf einem Kapillargel-Elektrophorese-Chip überprüft werden. Zusätzlich zu den erwarteten 150 Basispaarprodukt, und immer mehr Anteil einer 130 Basispaar-Arten entsprechend Adapter-Dimer, werden in der Regel beobachtet, wie zunehmende Menge an PCR-Produkt geladen werden.Ähnliche Ergebnisse werden erzielt, wenn Bibliotheken aus einer Mischung synthetischer kleiner RNAs mit Reagenzien aus Kits oder anderen Verbrauchsmaterialien hergestellt werden. Zum Vergleich werden zuvor veröffentlichte Ergebnisse für den gleichen kleinen RNA-Mix angezeigt. Hier wird ein Leistungsvergleich des Protokolls TS5 mit dem Standard-TS-Protokoll zum Nachweis von menschlichen unveränderten und zwei erstklassigen O-Methal-modifizierten Pflanzenmikro-RNAs gezeigt.Der Nachweis von zwei erstklassigen O-Methal-modifizierten PiRNAs in menschlichen Proben wurde ebenfalls getestet. Wie beobachtet, hat TS5 deutlich besser als TS für den Nachweis von zwei erstklassigen O-Methal RNAs vorgeformt, jedoch nicht für unveränderte RNAs. Bereiten Sie Replikationsbibliotheken für jedes Beispiel zu unterschiedlichen Datumsangaben vor.In der Regel gibt es wenig Variation zwischen Replikationen gleichzeitig gemacht, oder es kann erhebliche Variationen zwischen Bibliotheken zu verschiedenen Datumsvorbereitungen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Forschung

Genetik

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Sequenz-spezifische und gezielte Anerkennung der Doppelstrang-RNA über Single-Stranded RNA durch chemisch modifiziert Peptid-Nukleinsäuren

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Metabolische Etikettier- und Profilierung des Transfer-RNAs mit Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-vermittelten Reorganisation der Chromatinstruktur mit Schleife

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Methodik für die präzise Erkennung der mitochondrialen DNA-Methylierung

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Zellbasierte Assays der SINEUP nicht-kodierende RNAs, die speziell mRNA Übersetzung verbessern können

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Mit In-vitro- und In der Zelle Form zu untersuchen, kleines Molekül induzierte Pre-mRNA Strukturveränderungen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Überexprimierenden lange forensisches RNAs mit Gen-Aktivierung CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...