Name: improving small rna-seq: less bias and better detection of 2'-o-methyl rnas
Uploaded: 2019-09-16T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי המרכז הלאומי למחקר מדעי (CNRS), האנרגיות החלופיות הצרפתיות והנציבות לאנרגיה אטומית ואוניברסיטת פריס-Sud. כל הכנות הספריה, המאייר רצף וביואינפורמטיקה ניתוחים עבור מחקר זה בוצעו במתקן I2BC הדור הבא (NGS). חברי המתקן I2BC NGS מודעים לקריאה קריטית של כתב היד והצעות מועילות.

1. בידוד של RNAs קטנים
<ol><li>לחלץ כולל RNA בעזרת ריאגנטים מבוססי פנול או כל שיטה אחרת. ודא אם ה-RNA הוא באיכות טובה.</li>
	<li>הפעלה מראש של 15% TBE-אוריאה ג'ל (ראה טבלת חומרים) עבור 15 דקות ב 200 V.</li>
	<li>בעוד הג הוא מראש ריצה, לערבב 5-20 μg של RNA סה כ 5-15 בנפח μl עם נפח שווה של שוויון הטעינה צבע ( לראות את ...

<ol>
	<li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+silencing+RNAs:+an+expanding+universe.">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).</li><li>Chang, T. C., Mendell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNAs+in+vertebrate+physiology+and+human+disease.">microRNAs in vertebrate physiology and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).</li><li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+expression+profiling+by+high-throughput+sequencing:+implications+of+enzymatic+manipulation.">Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation.</a> Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).</li><li>van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library+preparation+methods+for+next-generation+sequencing:+tone+down+the+bias.">Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias.</a> Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).</li><li>Munafo, D. B., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+enzymatic+reaction+conditions+for+generating+representative+pools+of+cDNA+from+small+RNA.">Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA.</a> RNA. 16, 2537-2552 (2010).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries.">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17, 1697-1712 (2011).</li><li>Sorefan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+ligation+bias+of+small+RNAs+in+libraries+for+next+generation+sequencing.">Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing.</a> Silence. 3, 4 (2012).</li><li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bias-reducing+strategy+in+profiling+small+RNAs+using+Solexa.">A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa.</a> RNA. 17, 2256-2262 (2011).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).</li><li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+bias+in+T4+RNA+ligase-mediated+3'-adapter+ligation.">Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation.</a> Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).</li><li>Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bias+in+ligation-based+small+RNA+sequencing+library+construction+is+determined+by+adaptor+and+RNA+structure.">Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure.</a> PLoS One. 10, 0126049 (2015).</li><li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing.">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19, 118 (2018).</li><li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing.">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6, 26969 (2011).</li><li>Harrison, B., Zimmerman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-stimulated+ligation:+enhanced+ligation+of+oligo-+and+polynucleotides+by+T4+RNA+ligase+in+polymer+solutions.">Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions.</a> Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).</li><li>Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+ligation+dependent+artifacts+in+T4+RNA+ligase+to+achieve+high+efficiency+and+low+bias+microRNA+capture.">Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture.</a> PLoS One. 9, 94619 (2014).</li><li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing.">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14, 109 (2013).</li><li>Barberan-Soler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreasing+miRNA+sequencing+bias+using+a+single+adapter+and+circularization+approach.">Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach.</a> Genome Biology. 19, 105 (2018).</li><li>Chen, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cost-effective+method+for+Illumina+small+RNA-Seq+library+preparation+using+T4+RNA+ligase+1+adenylated+adapters.">A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters.</a> Plant Methods. 8, 41 (2012).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. , (2011).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10, 25 (2009).</li><li>Shore, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+Library+Preparation+Method+for+Next-Generation+Sequencing+Using+Chemical+Modifications+to+Prevent+Adapter+Dimer+Formation.">Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation.</a> PLoS One. 11, 0167009 (2016).</li></ol>

הכנה קטנה של ספריית RNA נותרת מאתגרת עקב הטיה, שהוצגה בעיקר במהלך שלבים להטיות במתאם. Rnas עם 2 '-OMe שינוי ב 3 ' סוף שלהם כגון צמח mirnas, pirna חרקים, נמטודות ויונקים, ו rnas מתערב קטן (sirna) חרקים וצמחים הם קשים במיוחד ללמוד כי 2 '-OMe שינוי מעכב 3 ' מתאם הקשר. מספר פתרונות הוצעו בספרות כדי לשפר את פרוטוקולי ההכנ?...

RNAs קטנים (sRNAs) מעורבים בשליטה של מגוון תהליכים ביולוגיים1. התקנות הרגולטוריות של eukaryotic הן בדרך כלל בין 20 ל-30 nt; שלושת הסוגים העיקריים הם microRNAs (miRNA), piwi-אינטראקציה RNAs (piRNA) ו-RNAs מתערב קטן (siRNA). רמות הביטוי המוטעות היו מעורבים במגוון מחלות2. זה מדגיש את החשיבות של miRNAs בריאות ומחלות והדרישה לכלי מחקר מדויקים, כמותיים כדי לזהות sRNAs בכלל.
רצף הדור הבא (NGS) הוא שיטה נפוצה ללימוד sRNAs. היתרונות העיקריים של ngs לעומת גישות אחרות, כגון ה-PCR כמותי או טכניקות microarray (qpcr), הם שהוא אינו זקוק לידע פריורי של רצפי srna ולכן ניתן להשתמש בהם כדי לגלות rnas הרומן, ובנוסף הוא סובל פחות מ אותות רקע ואפקטי רוויה. עוד, הוא יכול לזהות הבדלים נוקלאוטיד יחיד ויש לו תפוקה גבוהה יותר מאשר מיקרו מערכים. עם זאת, NGS יש גם כמה החסרונות; העלות של הפעלה ברצף נותרת גבוהה יחסית ותהליך רב הנדרש כדי להמיר מדגם לספריה לרצף עשוי להציג הטיות. בתהליך ההכנה האופייני של ספריית srna, מתאם 3 מגיע לראשונה ל-srna (לעתים קרובות ג'ל מזוקק מ-rna הכולל) בגרסה קטומה של rna ליגאז 2 (RNL2) ומתאם 3 מקדים (איור 1) בהיעדר ATP. הדבר מגביר את היעילות של הקשר המתאם של sRNA ומפחית את היווצרות התגובות הצדדיות כדוגמת sRNA circularization או קונקטאריזציה. לאחר מכן, 5 ' מתאם הוא ליגיום על ידי RNA ליגאז 1 (RNL1), ואחריו תמלול הפוכה (RT) ו-PCR הגברה. כל השלבים הללו עשויים להציג הטיה3,4. כתוצאה מכך, קריאת מספרים עשויה שלא לשקף רמות ביטוי בפועל של sRNA המובילות לתבניות ביטוי מלאכותיות התלויות בשיטה. SRNAs ספציפיים עשוי להיות מוגדר או לא מיוצג בספריה, ומאוד מיוצגת על-ידי sRNAs שעשוי להימלט מזיהוי. המצב מורכב במיוחד עם mirnas צמחים, sirnas בחרקים וצמחים, ו pirnas בחרקים, נמטודות ויונקים, שבו 3 ' מסוף נוקלאוטיד יש 2 '-O-מתיל (2 '-OMe) שינוי1. שינוי זה מעכב בחוזקה 3 ' מתאם התאמה5, ביצוע הכנה ספריה עבור סוגים אלה של RNA משימה קשה.
העבודה הקודמת הוכיחה שלקשר מתאם מציג הטיה רצינית, עקב השפעות רצף/מבנה RNA6,7,8,9,10,11. מדרגות במורד הזרם של המתאם כגון תעתיק הפוך ו-PCR לא תורמים באופן משמעותי להטיה6,11,12. הטיה ליפטיים היא כנראה בשל העובדה כי מולקולות מתאם עם רצף נתון יהיה אינטראקציה עם מולקולות sRNA בתערובת התגובה לטופס מקפלים שכונתיות, כי יכול להוביל תצורות חיוביות או שלילי לצורך הארכה (איור 2). נתונים מsorefan ואח '7 מראים כי RNL1 מעדיף הקשר נטוש יחיד, בעוד RNL2 מעדיף סטרנד כפול לצורך הארכה. העובדה שמבני הקיפול המשותף של המתאם/sRNA נקבעים על-ידי המתאם הספציפי ורצפי sRNA מסביר מדוע sRNA ספציפי מיוצג באמצעות ערכת מתאם נתונה. חשוב גם לציין שבתוך סדרה של ספריות sRNA שיש להשוותו, יש להשתמש באותם רצפי מתאמים. אכן, זה בעבר נצפתה כי שינוי מתאמים על ידי המבוא של רצפי ברקוד שונים משנה את פרופילי mirna ב רצף ספריות9,13.
אקראיות של רצפי מתאמים ליד צומת החיבור עלולה להקטין את הביסים האלה. Sorefan ועמיתיו7 מתאמים משומשים עם 4 נוקלאוטידים אקראיים בגפיים שלהם, המיועדים "high Definition" (HD) מתאמים, והראו כי השימוש במתאמים אלה מוביל לספריות שמשקפות טוב יותר את רמות הביטוי srna אמיתי. עבודה עדכנית יותר אישרה תצפיות אלה וחשף כי האזור האקראי אינו צריך להיות סמוך לצומת החיבור11. סוג זה של המתאמים נקרא "MidRand" מתאמים. יחד, תוצאות אלה מדגימות כי עיצוב מתאם משופר יכול להפחית את ההטיה.
במקום לשנות את המתאמים, הטיה ניתן לדכא דרך האופטימיזציה של תנאי התגובה. פוליאתילן גליקול (יתד), סוכן macromolecular צפיפות הידוע כדי להגדיל את יעילות לקצץ14, הוכח להפחית באופן משמעותי הטיה15,16. מבוסס על תוצאות אלה, כמה "נמוך הטיה" ערכות הופיעו בשוק. אלה כוללים ערכות המשתמשות ב-יתד בתגובות הקשר, או בשילוב עם מתאמים קלאסיים או מתאמי HD. ערכות אחרות להימנע לחלוטין, ולהשתמש 3 ' פוליאדלציה ומיתוג תבנית עבור 3 ' ו 5 ' מתאם התוספת, בהתאמה12. בעוד אסטרטגיה אחרת, הארכה של 3 מתאמים מלווה בצעד מעגלי, ובכך משמיט את החוגה של 5 מתאמים17.
במחקר קודם חיפשנו פרוטוקול הכנה של ספריית sRNA עם הרמות הנמוכות ביותר של הטיה ואת הזיהוי הטוב ביותר של 2 '-OMe RNAs12. בדקנו כמה מהעירייה ' הטיה נמוכה ' ערכות, אשר היה זיהוי טוב יותר של 2 '-OMe RNAs מאשר פרוטוקול רגיל (TS). באופן מפתיע עם זאת, עם השינוי (השימוש של מתאמים אקראיים, פג בתגובות לתיקון והסרה של עודף 3 ' מתאם על ידי טיהור) האחרון ביצע את הפרוטוקולים האחרים לאיתור של 2 '-OMe RNAs. כאן, אנו מתארים בפירוט פרוטוקול מבוסס על פרוטוקול TS, ' TS5 ', אשר היה הזיהוי הכללי הטוב ביותר של 2 '-כולל RNAs. הפרוטוקול יכול להיות בעקבות באמצעות ריאגנטים מערכת ה-TS ומגיב אחד מן הקיט ' Nf ' או, כדי לחסוך כסף, באמצעות ריאגנטים תוצרת בית, עם ביצועים שווים. אנו מספקים גם פרוטוקול מפורט לטיהור של sRNA מ-RNA הכולל והכנת מתאם 3 מראש.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:873px;" width="874">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">2100 Bioanalyzer Instrument&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">G2939BA</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td style="width:159px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:169px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Bioanalyzer Small RNA Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">5067-1548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS8162-96EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Dark Reader transilluminator</td>
			<td style="width:159px;">various suppiers</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">HotStart PCR Kit, with dNTPs</td>
			<td style="width:159px;">Kapa Biosystems</td>
			<td>KK2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">NEXTflex small RNA-seq V3 kit</td>
			<td style="width:159px;">BIOO Scientific</td>
			<td style="width:169px;">NOVA-5132-05</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Novex TBE gels 6%</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Novex TBE Urea gels 15%</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EC6885BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td style="width:159px;">Qiagen&#160;</td>
			<td style="width:169px;">28304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Qubit 4 Quantitation Starter Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">Q33227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Qubit ssDNA Assay Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:374px;">RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">RNase Inhibitor, Murine&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">18090200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:28px;width:374px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">T4 RNA Ligase 2, truncated</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrackIt 50 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">10488043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">TruSeq Small RNA Library Prep Kit</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td>RS-200-0012/24/36/48</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Glycogen</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>10814010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">ZR small RNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:169px;">R1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td>the last two numbers correspond to the set of indexes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving small rna-seq: less bias and better detection of 2'-o-methyl rnas

המחקר של RNAs קטן (sRNAs) לפי רצף הדור הבא (NGS) הוא מאותגר על ידי בעיות הטיה במהלך הכנת הספרייה. מספר סוגים של sRNA כגון צמח microRNAs (miRNAs) לשאת 2 '-O-מתיל (2 '-OMe) שינוי ב 3 ' מסופים שלהם שלהם. שינוי זה מוסיף קושי נוסף כאשר הוא מעכב את החיבור של 3 מתאמים. בעבר הדגמנו שלגירסאות ששונו של פרוטוקול TruSeq (TS) יש פחות הטיה וזיהוי משופר של 2 ' מוכן '. כאן אנו מתארים בפרוטוקול פירוט ' TS5 ', אשר הראה את הביצועים הכוללים הטוב ביותר. TS5 ניתן לעקוב גם באמצעות ריאגנטים תוצרת בית או ריאגנטים מערכת TS, עם ביצועים שווים.

שלבים קריטיים הם הבידוד של חלק RNA קטן של החומר ההתחלתי RNA הכולל (איור 3) ואת המוצר המבוקש הסופי ספרייה (איור 4). שני השלבים כרוכים בטיהור פוליאקרילאמיד ג'ל; רנ א קטן מבודד מ 15% שתנן TBE ג'ל, בעוד הספריות הסופיות מבודדות מ 6% הילידים TBE ג ' לים. רנ א קטן מבודד ג'ל ניתן לנ?...

Watch this Scientific Journal Video about Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs at JoVE.com

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

אנו מציגים פרוטוקול RNA קטן מפורט של הספרייה רנ א עם פחות הטיה מאשר שיטות סטנדרטיות רגישות מוגברת עבור 2 '-O-מתיל RNAs. פרוטוקול זה יכול להיות בעקבות שימוש ריאגנטים תוצרת בית כדי לחסוך עלות או באמצעות ערכות לנוחות.

שיפור רנ א קטן-seq: פחות הטיה וזיהוי טוב יותר של 2 '-O-מתיל RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

רנ"א קטן מווסת תהליכים ביולוגיים רבים. לכן חשוב לפתח שיטות רגישות ולא משוחדות כדי לזהות אותם. פרוטוקול הפרוטוקול שלנו מספק צעדים קדימה לעבר מטרה זו.הפרוטוקול שלנו סובל מפחות בעיות הטיה, מאשר שיטות ניפוח קלאסיות של ספריית RNA קטנה, וחשוב מכך הוא מאפשר זיהוי רגיש יותר של שני שיניים או מזו-RNAs. כגון מיקרו-RNAs צמחיים. לאחר חילוץ RNA הכולל על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.לפני להפעיל ג'ל אוריאה 15% TBE במשך רבע שעה ב 200 וולט. ומערבבים חמישה עד עשרים מיקרוגרם של רנ"א כולל, בנפח של 5 עד 15 מיקרוליטר, עם נפח שווה של צבע טעינת formamide בצינור 200 מיקרוליטר. לאחר חמש דקות ב 65 מעלות צלזיוס, בתרמוצ'ית עם מכסה מחומם, מיד למקם את הצינורות על קרח לטעון את האחרון ולדגום על הג'ל עם נתיב אחד לפחות ביניהם.לאחר מכן להפעיל את הג'ל ב 200 וולט עד bromophenol היגר כשני שלישים של אורך הג'ל. כדי לטעון את ה- RNA, נקבו תחילה את החלק התחתון של צינור צנטריפוגה מיקרו 0.5 מיליליטר חופשי, עם מחט מד 21, והמקמו את הצינור המנוקב בתחתית עגולה ללא גרעין שני צינור מיקרו צנטריפוגה מיליליטר. לאחר מכן, אין לארוב את הג'ל בטמפרטורת החדר עם כתם ג'ל חומצת גרעין במים במשך עשר עד רבע שעה, לפני צפייה בג'ל על טרנסילומינטור.חותכים את RNA מדגם בין 17 ל 29 להקות סולם נוקלאוטיד, ולהעביר את חתיכת הג'ל לתוך הצינור מנוקב. לסובב את הג'ל במיקרו צנטריפוגה במהירות מקסימלית במשך שתי דקות, ולהסיר את הצינור 0.5 מיליליטר אשר צריך עכשיו להיות ריק. מוסיפים 300 מיקרוליטרים של גרעין חינם 0.3 טוחנות נתרן כלורי לג'ל כתוש, ומנחים את הצינור על מסובב לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, מעבירים את חתיכות הג'ל המרוסקות לעמוד ספין, וצנטריפוגה לשתי דקות במהירות המרבית במיקרו צנטריפוגה. לקבלת חיסול מתאם ראשוני ללא תיחום, יש לערבב ביסודיות עשרה מיקרוליטרים של מים חופשיים עם דגימת ה-RNA המופקת, ולהוסיף שישה מיקרוליטרים של שלושה טוחנות נתרן אצטט עם ערבוב. הוסף 40 microliters של חרוזים טיהור מגנטי, ו 60 microliters של isopropanol לדגימה עם ערבוב יסודי.ולהדרור את ההשעיה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מניחים את הדגימה על מתלה מגנטי, עד שהפתרון מתבהר. מוציאים את העל-טבעי הצלול ומוסיפים 180 מיקרוליטרים של אתנול טרי 80% לחרוזים.לאחר 30 שניות, להסיר את האתנול ולסובב בקצרה את הצינור. הסר כל נוזל שיורית שאולי אסף בתחתית הצינור, ולאפשר את חרוזים להתייבש במשך שתי דקות לפני השעיית המדגם מחדש 22 microliters של 10 מילימולרים טריס. לאחר שתי דקות למגנט את הדגימה עד הפתרון נראה ברור.לאחר מכן, לערבב 20 microliters של על טבעי ברור עם שישה microliters של שלושה אצטט נתרן טוחן בצינור חדש, ולהוסיף 40 microliters של חרוזים מגנטיים ו 60 microliters של 100% isopropanol. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, מגנטים את הדגימה עד שהפתרון נראה ברור, לפני הסרת העל-טבעי. לטפל המדגם עם 180 microliters של 80% אתנול מוכן טרי במשך 30 שניות לפני הסרת אתנול מסתובב במורד המדגם, והסרת כל נוזל שיורית שהצטבר בתחתית הצינור.לאחר מתן אפשרות חרוזים להתייבש במשך שתי דקות, להשעות אותם מחדש 10 microliters של מים ללא גרעין, במשך שתי דקות, לפני מגנטיזציה המדגם עד הפתרון הופך ברור. לאחר מכן, להעביר תשעה microliters של על טבעי לצינור חדש ולהוסיף מיקרוליטר אחד של חיץ קשירה T4 RNA, ומיקרופוליטר אחד של מים לדגימה. לטיהור ג'ל, הפעל חמישה, עשרה ועשרים מיקרוליטרים של מוצר PCR על ג'ל מקורי של 6%TBE למשך כשעה.אין להחדיר את הג'ל שהושלם עם כתם ג'ל חומצת גרעין במים במשך עשר עד חמש עשרה דקות, ולהציג את הג'ל על טרנסילומינטור כדי לאפשר מיצוי של רצועת הספרייה 150 זוג הבסיס. מכיוון שקשה לבודד את רצועת 150 זוג הבסיס המייצגת אותם, אלה הספרייה שלנו, בשל נוכחותם של מוצרי צד נודדים היטב תצטרך לחתוך את הג'ל בזהירות רבה. ואז לבודד את RNA כפי שהוכח רק.לשינוי קובץ רצף גולמי, הורד את קבצי רצף fastq שנוצרו במהלך ריצוף, ואת demultiplexing מראש עם bcl2fastq2 לפי הצורך. הסר רצפי מתאם באמצעות cutodapt, ולהשתמש בפקודה כפי שהודגם. השתמש seqtk כפי שצוין כדי להסיר את הנוקלאוטידים אקראיים מסוף ברצפים קורא.לאחר מכן השתמש בפקודה awk כמצוין, כדי למחוק את הרצפים קצרים מ- 10 נוקלאוטידים. כדי למפות את הרצפים חתוך, לפתוח miRBase ולהוריד את הקובץ fa בוגרת. השתמש בפקודה כפי שצוין כדי להחליף שאריות U בשאריות T, כדי להניב רשימה מלאה של כל המיקרו RNAs במסד הנתונים, שמקורם במגוון אורגניזמים.בחר את רצפי המיקרו RNA של האורגניזם המעניין, כאשר הפקודה מסומנת, ומפה את ההקריאות לקובץ באמצעות bowtie2, ללא אי-התאמות. השתמש בכלי כדי ליישר את הרצפים קורא למסד הנתונים, הדורש כי לקרוא ממפה לחלוטין למיקרו RNA של מסד הנתונים, עם כל אי התאמות כפי שצוין. לאחר מכן השתמש בפקודה כדי לבטל את ההיקראות שלא התיישרו.לאחר טעינת כמויות הולכות וגדלות של ספריית PCR מוגברת על ג'ל כפי שהוכח, ניתן לחלץ את המוצרים המתאימים לגודל הצפוי. לאחר האלוטיון, ניתן לבדוק את הספרייה המטוהרת על שבב אלקטרופורזה ג'ל נימי. בנוסף למוצר הצפוי של 150 זוגות בסיסים, והגדלת חלקם של 130 מינים של זוג בסיסים המתאימים לעמעמי מתאם, נצפו בדרך כלל כאשר כמות הולכת וגדלה של מוצר PCR נטענת.תוצאות דומות מתקבלות כאשר ספריות מתערובת של RNAs קטנים סינתטיים מוכנים באמצעות רייגנטים מערכות, או חומרים מתכלים אחרים. לשם השוואה, מוצגות תוצאות שפורסמו בעבר עבור אותו תערובת RNA קטנה. כאן, השוואה לביצועים של פרוטוקול TS5 עם פרוטוקול TS סטנדרטי לגילוי של אדם ללא שינוי ושני RNAs צמחים ראשוניים שעברו שינוי O-methal מוצגים.הגילוי של שני piRNAs O-מתל שונה ראשוני בדגימות אנושיות נבדק גם. כפי שנצפה TS5 preformed טוב יותר באופן משמעותי מאשר TS לגילוי של שני RNAs O-מתל הממשלה, אבל לא עבור RNAs ללא שיפוץ. הכן ספריות שכפול עבור כל דוגמה בתאריכים שונים.בדרך כלל יש שונות קטנה בין שכפולים שנעשו בו זמנית, או שיכולה להיות שונות משמעותית בין ספריות שהוכנו בתאריכים שונים.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

זיהוי רצף ספציפי, סלקטיבי של גדילי כפול RNAs מעל חד גדילי RNAs על ידי שינוי כימי חומצות גרעין פפטיד

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

תיוג מטבולית, יצירת פרופילים של RNAs העברה באמצעות Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR בתיווך ארגון מחדש של הכרומטין לולאה

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

מתודולוגיה עבור איתור מדויק של מתילציה DNA מיטוכונדריאלי

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

תא המבוסס על מבחני של SINEUP ללא קידוד RNAs זה במיוחד יכולה לשפר את התרגום mRNA

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

שימוש בחוץ גופית וצורה בתא לחקור מולקולה קטנה המושרה שינויים מבניים Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Overexpressing RNAs Noncoding זמן באמצעות הפעלת גנים CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...