Name: improving small rna-seq: less bias and better detection of 2'-o-methyl rnas
Uploaded: 2019-09-16T14:45:00
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Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de pesquisa científica (CNRS), as energias alternativas francesas e a Comissão de energia atômica (CEA) e a Universidade Paris-Sud. Toda a preparação da biblioteca, o sequenciamento de Illumina e as análises de Bioinformática para este estudo foram realizadas na instalação de sequenciamento da próxima geração do I2BC (NGS). Os membros da instalação do I2BC NGS são reconhecidos para a leitura crítica do manuscrito e sugestões úteis.

1. isolamento de pequenas RNAs
<ol><li>Extraia o RNA total usando reagentes à base de fenóis ou qualquer outro método. Verifique se o RNA é de boa qualidade.</li>
	<li>Pré-executar um 15% TBE-ureia gel (ver tabela de materiais) para 15 min em 200 V.</li>
	<li>Quando o gel for pre-running, misture 5-20 μg do RNA total em um volume de 5-15 μl com um volume igual do corante da carga do formamida (veja a tabela de materiais; 95% formamida deionizada, 0, 25% azul do bromofenol, 0, 25...

<ol>
	<li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+silencing+RNAs:+an+expanding+universe.">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).</li><li>Chang, T. C., Mendell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNAs+in+vertebrate+physiology+and+human+disease.">microRNAs in vertebrate physiology and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).</li><li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+expression+profiling+by+high-throughput+sequencing:+implications+of+enzymatic+manipulation.">Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation.</a> Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).</li><li>van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library+preparation+methods+for+next-generation+sequencing:+tone+down+the+bias.">Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias.</a> Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).</li><li>Munafo, D. B., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+enzymatic+reaction+conditions+for+generating+representative+pools+of+cDNA+from+small+RNA.">Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA.</a> RNA. 16, 2537-2552 (2010).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries.">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17, 1697-1712 (2011).</li><li>Sorefan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+ligation+bias+of+small+RNAs+in+libraries+for+next+generation+sequencing.">Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing.</a> Silence. 3, 4 (2012).</li><li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bias-reducing+strategy+in+profiling+small+RNAs+using+Solexa.">A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa.</a> RNA. 17, 2256-2262 (2011).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).</li><li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+bias+in+T4+RNA+ligase-mediated+3'-adapter+ligation.">Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation.</a> Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).</li><li>Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bias+in+ligation-based+small+RNA+sequencing+library+construction+is+determined+by+adaptor+and+RNA+structure.">Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure.</a> PLoS One. 10, 0126049 (2015).</li><li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing.">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19, 118 (2018).</li><li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing.">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6, 26969 (2011).</li><li>Harrison, B., Zimmerman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-stimulated+ligation:+enhanced+ligation+of+oligo-+and+polynucleotides+by+T4+RNA+ligase+in+polymer+solutions.">Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions.</a> Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).</li><li>Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+ligation+dependent+artifacts+in+T4+RNA+ligase+to+achieve+high+efficiency+and+low+bias+microRNA+capture.">Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture.</a> PLoS One. 9, 94619 (2014).</li><li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing.">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14, 109 (2013).</li><li>Barberan-Soler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreasing+miRNA+sequencing+bias+using+a+single+adapter+and+circularization+approach.">Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach.</a> Genome Biology. 19, 105 (2018).</li><li>Chen, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cost-effective+method+for+Illumina+small+RNA-Seq+library+preparation+using+T4+RNA+ligase+1+adenylated+adapters.">A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters.</a> Plant Methods. 8, 41 (2012).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. , (2011).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10, 25 (2009).</li><li>Shore, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+Library+Preparation+Method+for+Next-Generation+Sequencing+Using+Chemical+Modifications+to+Prevent+Adapter+Dimer+Formation.">Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation.</a> PLoS One. 11, 0167009 (2016).</li></ol>

A preparação pequena da biblioteca do RNA permanece desafiante devido ao viés, introduzida principalmente durante etapas da ligadura do adaptador. RNAs com uma modificação de 2 '-ome em sua extremidade 3 ' tal como miRNAs da planta, Pirna nos insetos, nematóides e mamíferos, e RNAs de interferência pequenos (siRNA) nos insetos e nas plantas são particularmente difíceis de estudar porque a modificação 2 '-ome inibe 3 ' a ligadura do adaptador. Uma série de soluções foram propostas na literatura para melhora...

Pequenas RNAs (sRNAs) estão envolvidas no controle de uma diversidade de processos biológicos1. Os sRNAs regulatórios eucarióticos são tipicamente entre 20 e 30 NT de tamanho; os três tipos principais são microRNAs (miRNA), Piwi-interagindo RNAs (piRNA) e RNAs de interferência pequenas (siRNA). Os níveis de expressão de miRNA aberrantes têm sido implicados em uma variedade de doenças2. Isso ressalta a importância do miRNAs na saúde e na doença e a exigência de ferramentas de pesquisa quantitativas e precisas para detectar sRNAs em geral.
O sequenciamento de próxima geração (NGS) é um método amplamente utilizado para estudar sRNAs. As vantagens principais de NGS em comparação com outras aproximações, tais como técnicas quantitativas do PCR ou do microarray (qPCR), são que não precisa um conhecimento a priori das seqüências de sRNA e podem conseqüentemente ser usadas para descobrir RNAs novas, e além sofre menos de sinal de fundo e efeitos de saturação. Além disso, ele pode detectar diferenças de nucleotídeo único e tem uma taxa de transferência maior do que Microarrays. No entanto, o NGS também tem algumas desvantagens; o custo de uma execução de seqüenciamento permanece relativamente alto e o processo de várias etapas necessário para converter uma amostra em uma biblioteca para seqüenciamento pode introduzir vieses. Em um processo típico de preparação da biblioteca sRNA, um adaptador de 3 ' é primeiro ligado ao sRNA (muitas vezes purificado a partir do RNA total) usando uma versão truncada de RNA ligase 2 (RNL2) e um adaptador de 3 ' preadenylated (Figura 1) na ausência de ATP. Isso aumenta a eficiência da ligadura do adaptador sRNA e reduz a formação de reações colaterais, como circularização de sRNA ou concatemerização. Posteriormente, um adaptador de 5 ' é ligado por RNA ligase 1 (RNL1), seguido por transcrição reversa (RT) e amplificação de PCR. Todos estes passos podem introduzir viés3,4. Consequentemente, os números de leitura podem não refletir os níveis de expressão sRNA reais, levando a padrões de expressão artificiais e dependentes de método. Os sRNAs específicos podem ser over-ou underrepresentado em uma biblioteca, e os sRNAs fortemente subrepresentados podem escapar da detecção. A situação é particularmente complicada com miRNAs vegetais, siRNAs em insetos e plantas, e piRNAs em insetos, nematoides e mamíferos, nos quais o nucleotídeo terminal 3 ' tem uma modificação 2 '-O-metil (2 '-OMe)1. Esta modificação inibe fortemente 3 ' ligadura do adaptador5, fazendo a preparação da biblioteca para estes tipos de RNA uma tarefa difícil.
O trabalho prévio demonstrou que a ligadura do adaptador introduz viés grave, devido àsequência de RNA/efeitos de estrutura6,7,8,9,10,11. As etapas a jusante da ligadura do adaptador tais como a transcrição reversa e o PCR não contribuem significativamente à polarização6,11,12. A polarização da ligadura é provável devido ao fato de que as moléculas do adaptador com uma determinada seqüência irão interagir com moléculas de sRNA na mistura de reação para formar codobras, que podem levar a configurações favoráveis ou desfavoráveis para a ligadura (Figura 2). Dados de Sorefan et al7 SUGEREM que RNL1 prefere um único contexto encalhado, enquanto RNL2 prefere uma dupla vertente para a ligadura. O fato de que as estruturas cofold Adapter/sRNA são determinadas pelo adaptador específico e seqüências sRNA explica por que sRNA específicos são over-ou underrepresentado com um determinado adaptador definido. Também é importante notar que, dentro de uma série de bibliotecas sRNA a serem comparadas, as mesmas sequências de adaptadores devem ser usadas. De fato, tem sido observado anteriormente que a mudança de adaptadores pela introdução de diferentes sequências de código de barras altera os perfis de Mirna nas bibliotecas de sequenciamento9,13.
A randomização de seqüências de adaptadores perto da junção de ligadura provavelmente reduz esses desvios. Sorefan e colegas7 adaptadores usados com 4 nucleotídeos aleatórios em suas extremidades, designados adaptadores de "alta definição" (HD), e mostraram que o uso desses adaptadores levam a bibliotecas que refletem melhor os níveis de expressão de Srna verdadeiros. O trabalho mais recente confirmou essas observações e revelou que a região randomizada não precisa ser adjacente à junção de ligadura11. Este novo tipo de adaptadores foi nomeado "MidRand" adaptadores. Juntos, esses resultados demonstram que o design aprimorado do adaptador pode reduzir o viés.
Em vez de modificar os adaptadores, o viés pode ser suprimido através da otimização das condições de reação. O polietileno glicol (PEG), um agente de aglomeração macromolecular conhecido para aumentar a eficiência da ligadura14, foi mostrado para reduzir significativamente o viés15,16. Com base nesses resultados, vários kits de "baixo viés" apareceram no mercado. Estes incluem kits que utilizam PEG nas reacções de ligadura, quer em combinação com adaptadores clássicos ou adaptadores HD. Outros kits de evitar a ligadura completamente, e usar 3 ' poliadenilação e modelo de comutação para 3 ' e 5 ' adaptador de adição, respectivamente12. Em outra estratégia, 3 ' ligadura do adaptador é seguido por uma etapa de circularização, omitindo assim 5 ' ligadura do adaptador17.
Em um estudo anterior, procurou-se um protocolo de preparação da biblioteca sRNA com os menores níveis possíveis de viés e a melhor detecção de 2 '-OMe RNAs12. Nós testamos alguns dos acima mencionados ' baixo viés ' kits, que teve uma melhor detecção de 2 '-OMe RNAs do que o protocolo padrão (TS). Surpreendentemente, no entanto, após a modificação (o uso de adaptadores randomizados, PEG nas reações de ligadura e remoção do excesso de 3 ' adaptador por purificação) o último superou os outros protocolos para a detecção de 2 '-OMe RNAs. Aqui, descrevemos detalhadamente um protocolo baseado no protocolo TS, ' TS5 ', que teve a melhor detecção geral de RNAs 2 '-OMe. O protocolo pode ser seguido usando reagentes do kit TS e um reagente do kit ' NF ' ou, para economizar dinheiro, usando reagentes caseiros, com igual desempenho. Nós igualmente fornecemos um protocolo detalhado para a purificação de sRNA do RNA total e a preparação de 3 ' adaptador preadenylated.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:873px;" width="874">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">2100 Bioanalyzer Instrument&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">G2939BA</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td style="width:159px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:169px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Bioanalyzer Small RNA Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">5067-1548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS8162-96EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Dark Reader transilluminator</td>
			<td style="width:159px;">various suppiers</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">HotStart PCR Kit, with dNTPs</td>
			<td style="width:159px;">Kapa Biosystems</td>
			<td>KK2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">NEXTflex small RNA-seq V3 kit</td>
			<td style="width:159px;">BIOO Scientific</td>
			<td style="width:169px;">NOVA-5132-05</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Novex TBE gels 6%</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Novex TBE Urea gels 15%</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EC6885BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td style="width:159px;">Qiagen&#160;</td>
			<td style="width:169px;">28304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Qubit 4 Quantitation Starter Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">Q33227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Qubit ssDNA Assay Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:374px;">RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">RNase Inhibitor, Murine&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">18090200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:28px;width:374px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">T4 RNA Ligase 2, truncated</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrackIt 50 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">10488043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">TruSeq Small RNA Library Prep Kit</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td>RS-200-0012/24/36/48</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Glycogen</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>10814010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">ZR small RNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:169px;">R1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td>the last two numbers correspond to the set of indexes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving small rna-seq: less bias and better detection of 2'-o-methyl rnas

O estudo de pequenas RNAs (sRNAs) por sequenciamento de próxima geração (NGS) é desafiado por problemas de viés durante a preparação da biblioteca. Diversos tipos de sRNA tais como microRNAs da planta (miRNAs) carregam uma modificação 2 '-O-methyl (2 '-OMe) em seus 3 ' nucleotide terminal. Esta modificação acrescenta outra dificuldade, pois inibe 3 ' ligadura do adaptador. Nós demonstramos previamente que as versões modificadas do protocolo de TruSeq (TS) têm menos polarização e uma deteção melhorada de 2 '-OMe RNAs. Aqui nós descrevemos no protocolo do detalhe ' TS5 ', que mostrou o melhor desempenho total. TS5 pode ser seguido usando reagentes caseiros ou reagentes do kit TS, com desempenho igual.

As etapas críticas são o isolamento da pequena fração de RNA do material de RNA total inicial (Figura 3) e o produto da biblioteca final desejada (Figura 4). Ambas as etapas envolvem a purificação do gel do poliacrilamida; o RNA pequeno é isolado dos géis da ureia de 15% TBE, quando as bibliotecas finais forem isoladas de 6% géis nativos de TBE. O RNA pequeno isolado do gel pode ser analisado em uma microplaqueta capilar pequena da electroforese do RNA ...

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Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

Nós apresentamos um protocolo pequeno detalhado da reparação da biblioteca do RNA com menos viés do que métodos padrão e uma sensibilidade aumentada para 2 '-O-methyl RNAs. Este protocolo pode ser seguido usando reagentes caseiros para economizar custos ou usar kits para conveniência.

Melhorando O RNA-Seq pequeno: menos polarização e melhor deteção de 2 '-O-methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

O RNA pequeno regula muitos processos biológicos. Por isso, é importante desenvolver métodos sensíveis e imparciales para detectá-los. Nosso protocolo de protocolo fornece passos em direção a esse objetivo.Nosso protocolo sofre de menos problemas de viés do que os métodos clássicos de apropriação da biblioteca RNA, e, importante, permite detecções mais sensíveis de dois pinos ou meso-RNAs. Como micro-RNAs de plantas. Depois de extrair RNA total de acordo com os protocolos padrão.Pré executar um gel de ureia de 15% TBE por quinze minutos a 200 volts. E misture de cinco a vinte microgramas de RNA total, em um volume de cinco a quinze microliter, com um volume igual de corante de carga de formamida em um tubo de 200 microliter. Depois de cinco minutos a 65 graus Celsius, em um termociclador com tampa aquecida, coloque imediatamente os tubos no gelo e carregue este último e prove no gel com pelo menos uma faixa entre eles.Em seguida, executar o gel a 200 volts até que o bromofenol tenha migrado cerca de dois terços do comprimento do gel. Para carregar o RNA, primeiro puna a parte inferior de um tubo micro centrífuga 0,5 mililitro livre de nuclease, com uma agulha de calibre 21, e coloque o tubo perfurado em um fundo redondo livre de nuclease dois mililitros micro centrífugas tubo. Em seguida, incubar o gel à temperatura ambiente com mancha de gel ácido nucleico na água por dez a quinze minutos, antes de ver o gel em um transilluminador.Corte a amostra de RNA entre 17 e 29 bandas de escada nucleotídeo, e transfira a peça de gel para o tubo perfurado. Gire o gel em uma micro centrífuga em velocidade máxima por dois minutos e remova o tubo de 0,5 mililitro que agora deve estar vazio. Adicione 300 microlitros de cloreto de sódio nuclease livre de 0,3 molares ao gel esmagado, e coloque o tubo em um rotador por pelo menos duas horas em temperatura ambiente.No final da incubação, transfira a suspensão das peças de gel esmagadas para uma coluna de giro e centrífuga por dois minutos em velocidade máxima na micro centrífuga. Para a eliminação de três adaptadores prime, misture completamente dez microliters nuclease água livre com a amostra de RNA extraída, e adicione seis microlitros de três acetato de sódio molares com mistura. Adicione 40 microliters de contas de purificação magnética, e 60 microliters de isopropanol à amostra com mistura completa.E incubar a suspensão por cinco minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, coloque a amostra em um rack magnético, até que a solução fique clara. Remova o supernanato claro e adicione 180 microliters de 80% de etanol recém-preparado às contas.Após 30 segundos, retire o etanol e gire brevemente o tubo. Remova qualquer líquido residual que possa ter coletado na parte inferior do tubo, e permita que as contas sequem por dois minutos antes de suspender a amostra em 22 microlitrais de 10 mililitros Tris. Após dois minutos magnetize a amostra até que a solução pareça clara.Em seguida, misture 20 microlitadores de supernascer claro com seis microlitadores de três acetatos de sódio molar em um novo tubo, e adicione 40 microliters de contas magnéticas e 60 microliters de 100% isopropanol. Após cinco minutos em temperatura ambiente, magnetize a amostra até que a solução pareça clara, antes de remover o sobrenatante. Trate a amostra com 180 microliters de 80% de etanol recém-preparado por 30 segundos antes de remover o etanol girando para baixo da amostra, e remover qualquer líquido residual que tenha se acumulado na parte inferior do tubo.Depois de permitir que as contas sequem por dois minutos, suspenda-as em 10 microlitadores de água livre de nuclease, por dois minutos, antes de magnetizar a amostra até que a solução fique clara. Em seguida, transfira nove microlitadores de supernascer para um novo tubo e adicione um microliter de tampão ligase T4 RNA, e um micrcoliter de água para a amostra. Para purificação de gel, execute cinco, dez e vinte microliters de produto PCR em um gel nativo de 6% TBE por cerca de uma hora.Incubar o gel completo com mancha de gel ácido nucleico na água por dez a quinze minutos, e ver o gel em um transilluminador para permitir a extração da banda de biblioteca de 150 pares de base. Como é difícil isolar a banda de 150 bases que os representa, estas são a nossa biblioteca, devido à presença de produtos laterais que você precisará cortar o gel com muito cuidado. Em seguida, isole o RNA como apenas demonstrado.Para modificação de arquivo de sequência bruta, baixe os arquivos de sequência de fastq gerados durante a execução de sequenciamento e desmultiplexing pré-formado com bcl2fastq2, conforme necessário. Remova as sequências do adaptador usando cutodapt e use o comando como demonstrado. Use seqtk conforme indicado para remover os nucleotídeos aleatórios do terminal nas sequências.Em seguida, use o comando awk como indicado, para descartar as sequências mais curtas que 10 nucleotídeos. Para mapear as sequências aparadas, abra o miRBase e baixe o arquivo fa maduro. Use o comando como indicado para substituir os resíduos de U por resíduos T, para produzir uma lista completa de todos os micro RNAs no banco de dados, originários de uma variedade de organismos.Selecione as sequências de micro RNA do organismo de interesse, com o comando como indicado, e mapeie as leituras para o arquivo usando bowtie2, não permitindo incompatibilidades. Use a ferramenta para alinhar as sequências no banco de dados, exigindo que um mapa de leitura inteiramente para um micro RNA do banco de dados, com quaisquer incompatibilidades conforme indicado. Em seguida, use o comando para descartar as leituras que não se alinharam.Depois de carregar quantidades crescentes de uma biblioteca amplificada pcr em um gel como demonstrado, os produtos correspondentes ao tamanho esperado podem ser extraídos. Após a elução, a biblioteca purificada pode ser verificada em um chip de eletroforese de gel capilar. Além do esperado produto de par de base de 150, e a proporção crescente de 130 espécies de par de base correspondentes aos dimers adaptadores, são tipicamente observadas à medida que a quantidade crescente de produto PCR é carregada.Resultados semelhantes são obtidos quando bibliotecas de uma mistura de rnas pequenas sintéticas são preparadas usando reagentes de kits ou outros suprimentos. Para comparação, são mostrados resultados publicados anteriormente para o mesmo pequeno mix de RNA. Aqui, é mostrada uma comparação para o desempenho do protocolo TS5 com o protocolo TS padrão para a detecção de micro RNAs de plantas modificadas O-methal principais.A detecção de dois piRNAs modificados O-methal em amostras humanas também foi testada. Como observado, o TS5 pré-formado foi significativamente melhor que o TS para a detecção de dois RNAs O-methal primos, mas não para RNAs não modificados. Prepare bibliotecas de réplica para cada amostra em datas diferentes.Geralmente há pouca variação entre as réplicas feitas simultaneamente, ou pode haver variação substancial entre bibliotecas preparadas em diferentes datas.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detecção de Copy Number Alterações Usando Sequencing única célula

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Genética

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Reconhecimento de sequência específica e seletivo de RNAs Double-stranded sobre Single-stranded RNA por modificados quimicamente ácidos nucleicos de peptídeo

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Etiquetando metabólica e caracterização das RNAs de transferência usando Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Mediada por CRISPR reorganização da estrutura de Loop de cromatina

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Deteção de evento raro usando o DNA de correção de erro e a sequenciação do ARN

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metodologia para detecção precisa de metilação do DNA mitocondrial

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Reação em Cadeia da Polimerase Digital de Gota Única para Detecção Abrangente e Simultânea de Mutações em Regiões de Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Célula com base em ensaios de SINEUP não-codificante RNAs que especificamente podem melhorar a tradução de mRNA

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Usando em forma de Vitro e na célula para investigar a pequena molécula induzida por alterações estruturais Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Superexpressão de tempo não-codificante RNAs usando CRISPR ativando o Gene

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...