Name: improving small rna-seq: less bias and better detection of 2'-o-methyl rnas
Uploaded: 2019-09-16T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальным центром научных исследований (CNRS), Французской комиссией по альтернативным энергетикам и атомной энергии (CEA) и Университетом Париж-Суд. Вся подготовка библиотеки, анализы последовательности illumina и биоинформатики для данного исследования были проведены на объекте I2BC Next-Generation Sequencing (NGS). Члены i2BC NGS объекта признаны для критического чтения рукописи и полезные предложения.

1. Изоляция малых РНК
<ol><li>Извлекайте полную РНК с помощью реагентов на основе фенола или любого другого метода. Проверьте, является ли РНК хорошего качества.</li>
	<li>Предварительно запустить 15% TBE-мочевого геля (см. Таблица материалов) в течение 15 мин при 200 В.</li>
	<li>В то время как ге...

<ol>
	<li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+silencing+RNAs:+an+expanding+universe.">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).</li><li>Chang, T. C., Mendell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNAs+in+vertebrate+physiology+and+human+disease.">microRNAs in vertebrate physiology and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).</li><li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+expression+profiling+by+high-throughput+sequencing:+implications+of+enzymatic+manipulation.">Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation.</a> Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).</li><li>van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library+preparation+methods+for+next-generation+sequencing:+tone+down+the+bias.">Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias.</a> Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).</li><li>Munafo, D. B., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+enzymatic+reaction+conditions+for+generating+representative+pools+of+cDNA+from+small+RNA.">Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA.</a> RNA. 16, 2537-2552 (2010).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries.">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17, 1697-1712 (2011).</li><li>Sorefan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+ligation+bias+of+small+RNAs+in+libraries+for+next+generation+sequencing.">Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing.</a> Silence. 3, 4 (2012).</li><li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bias-reducing+strategy+in+profiling+small+RNAs+using+Solexa.">A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa.</a> RNA. 17, 2256-2262 (2011).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).</li><li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+bias+in+T4+RNA+ligase-mediated+3'-adapter+ligation.">Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation.</a> Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).</li><li>Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bias+in+ligation-based+small+RNA+sequencing+library+construction+is+determined+by+adaptor+and+RNA+structure.">Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure.</a> PLoS One. 10, 0126049 (2015).</li><li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing.">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19, 118 (2018).</li><li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing.">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6, 26969 (2011).</li><li>Harrison, B., Zimmerman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-stimulated+ligation:+enhanced+ligation+of+oligo-+and+polynucleotides+by+T4+RNA+ligase+in+polymer+solutions.">Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions.</a> Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).</li><li>Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+ligation+dependent+artifacts+in+T4+RNA+ligase+to+achieve+high+efficiency+and+low+bias+microRNA+capture.">Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture.</a> PLoS One. 9, 94619 (2014).</li><li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing.">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14, 109 (2013).</li><li>Barberan-Soler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreasing+miRNA+sequencing+bias+using+a+single+adapter+and+circularization+approach.">Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach.</a> Genome Biology. 19, 105 (2018).</li><li>Chen, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cost-effective+method+for+Illumina+small+RNA-Seq+library+preparation+using+T4+RNA+ligase+1+adenylated+adapters.">A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters.</a> Plant Methods. 8, 41 (2012).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. , (2011).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10, 25 (2009).</li><li>Shore, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+Library+Preparation+Method+for+Next-Generation+Sequencing+Using+Chemical+Modifications+to+Prevent+Adapter+Dimer+Formation.">Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation.</a> PLoS One. 11, 0167009 (2016).</li></ol>

Подготовка небольшой библиотеки РНК остается сложной из-за предвзятости, в основном внедряемой во время этапов перевязки адаптера. РНК с 2'-OMe модификации в их 3 'конец, такие как мифы растений, piRNA у насекомых, нематод и млекопитающих, и малых вмешательства РНК (siRNA) в насекомых и растений о...

Малые РНК (РНК) участвуют в контроле разнообразия биологических процессов1. Eukaryotic нормативных sRNAs, как правило, между 20 и 30 nt в размере; три основных типа: микроРНК (miRNA), piwi-взаимодействующих РНК (piRNA) и малых интерферирующих РНК (siRNA). Аномальные уровни экспрессии miRNA были вовлечены в различные заболевания2. Это подчеркивает важность миРНК в области здравоохранения и болезней и потребность в точных количественных исследовательских инструментах для выявления СРНК в целом.
Секвенирование следующего поколения (NGS) является широко используемым методом изучения сРНК. Основные преимущества NGS по сравнению с другими подходами, такими как количественные методы ПЦР или microarray (qPCR), заключаются в том, что он не нуждается в априори знания последовательностей сРНК и поэтому может быть использован для обнаружения новых РНК, и, кроме того, он страдает меньше фоновый сигнал и эффекты насыщения. Кроме того, он может обнаружить одно нуклеотидные различия и имеет более высокую пропускную мощность, чем microarrays. Тем не менее, NGS также имеет некоторые недостатки; стоимость последовательного запуска остается относительно высокой, и многоступенчатый процесс, необходимый для преобразования образца в библиотеку для секвенирования, может привести к смещениям. В типичном процессе подготовки библиотеки sRNA, 3' адаптер сначала ligated к sRNA (часто гель-очищенной от полной РНК) используя усеченную версию RNA ligase 2 (RNL2) и preadenylated 3' адаптер(Рисунок 1) в отсутствии ATP. Это повышает эффективность перевязки sRNA-адаптера и уменьшает образование побочных реакций, таких как циркуляризация sRNA или конкатегоризация. Впоследствии 5' адаптер сливается с помощью РНК лигаза 1 (RNL1), а затем обратная транскрипция (RT) и pcR усиление. Все эти шаги могут ввести предвзятость3,4. Следовательно, считываемые числа могут не отражать фактические уровни экспрессии sRNA, ведущие к искусственным, зависимым от метода шаблонам выражения. Конкретные СРНК могут быть либо чрезмерно или недопредставлены в библиотеке, а сильно недопредставленные СРНк могут избежать обнаружения. Особенно сложная ситуация с растительными миРНКами, сиРНК у насекомых и растений, а также пиРНК у насекомых, нематод и млекопитающих, в которых 3' терминальный нуклеотид имеет 2'O-метил (2'-OMe) модификацию1. Эта модификация сильно подавляет перевязку 3' адаптера5,что делает подготовку библиотеки для этих типов РНК трудной задачей.
Предыдущая работа показала, что перевязка адаптера вводит серьезные предубеждения, из-за РНК последовательности / структурных эффектов6,7,8,9,10,11. Шаги вниз по течению перевязки адаптера, такие как обратная транскрипция и ПЦР, существенно не способствуют смещению6,11,12. Смещение лигации, вероятно, связано с тем, что молекулы адаптера с заданной последовательностью будут взаимодействовать с молекулами SRNA в реакционной смеси для формирования сгибов, что может либо привести к благоприятным или неблагоприятным конфигурациям для перевязки(рисунок 2). Данные Sorefan et al7 свидетельствуют о том, что RNL1 предпочитает один контекст, в то время как RNL2 предпочитает двойную нить для перевязки. Тот факт, что структуры совместного сгиба адаптера/sRNA определяются конкретным истектором адаптера и последовательностями sRNA, объясняет, почему конкретные sRNA чрезмерно или недопредставлены с данным набором адаптера. Важно также отметить, что в рамках серии библиотек sRNA для сопоставления следует использовать одни и те же последовательности адаптера. Действительно, ранее было отмечено, что изменение адаптеров путем введения различных последовательностей штрих-кодов изменяет профили miRNA в секвенирующих библиотеках9,13.
Рандомизация последовательностей адаптера вблизи перевязочных узлов, вероятно, уменьшает эти предубеждения. Sorefan и коллеги7 использовали адаптеры с 4 случайных нуклеотидов на их конечностях, назначенных "Высокой четкости" (HD) адаптеры, и показал, что использование этих адаптеров привести к библиотекам, которые лучше отражают истинные уровни экспрессии SRNA. Более поздние работы подтвердили эти наблюдения и показали, что рандомизированный регион не должен быть рядом с перевязочную перевязку11. Этот новый тип адаптеров был назван "MidRand" адаптеры. В совокупности эти результаты показывают, что улучшение конструкции адаптера может уменьшить предвзятость.
Вместо того, чтобы изменять адаптеры, смещение может быть подавлено путем оптимизации условий реакции. Полиэтиленгликоль (PEG), макромолекулярный скученность агент, как известно, увеличение эффективности перевязки14, было показано, значительно уменьшить предвзятость15,16. На основе этих результатов на рынке появилось несколько комплектов "низкой предвзятости". К ним относятся комплекты, которые используют PEG в реакции перевязки, либо в сочетании с классическими адаптерами или HD адаптеры. Другие комплекты избежать перевязки в целом, и использовать 3' полиаденилаации и шаблона переключения для 3' и 5' адаптер дополнение, соответственно12. В еще одной стратегии, 3' перевязка адаптера сопровождается круговой шаг, таким образом, опуская 5' адаптер перевязки17.
В предыдущем исследовании мы искали протокол подготовки библиотеки sRNA с наименьшими уровнями смещения и лучшим обнаружением 2'-OMe РНК12. Мы протестировали некоторые из вышеупомянутых комплектов «низкого смещения», которые имели лучшее обнаружение 2'-OMe РНК, чем стандартный протокол (TS). Удивительно, однако, при модификации (использование рандомизированных адаптеров, PEG в реакции перевязки и удаление избытка 3' адаптера путем очистки) последний превзошел другие протоколы для обнаружения 2'-OMe РНК. Здесь мы подробно описываем протокол, основанный на протоколе TS, 'TS5', который имел лучшее общее обнаружение 2'-OMe РНК. Протокол можно соблюдать с помощью реагентов из комплекта ТС и одного реагента из комплекта «Nf» или, чтобы сэкономить деньги, с помощью самодельных реагентов, с одинаковой производительностью. Мы также предоставляем подробный протокол для очистки сРНК от общей РНК и подготовки предаденина 3' адаптера.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:873px;" width="874">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">2100 Bioanalyzer Instrument&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">G2939BA</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td style="width:159px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:169px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Bioanalyzer Small RNA Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">5067-1548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS8162-96EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Dark Reader transilluminator</td>
			<td style="width:159px;">various suppiers</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">HotStart PCR Kit, with dNTPs</td>
			<td style="width:159px;">Kapa Biosystems</td>
			<td>KK2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">NEXTflex small RNA-seq V3 kit</td>
			<td style="width:159px;">BIOO Scientific</td>
			<td style="width:169px;">NOVA-5132-05</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Novex TBE gels 6%</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Novex TBE Urea gels 15%</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EC6885BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td style="width:159px;">Qiagen&#160;</td>
			<td style="width:169px;">28304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Qubit 4 Quantitation Starter Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">Q33227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Qubit ssDNA Assay Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:374px;">RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">RNase Inhibitor, Murine&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">18090200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:28px;width:374px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">T4 RNA Ligase 2, truncated</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrackIt 50 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">10488043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">TruSeq Small RNA Library Prep Kit</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td>RS-200-0012/24/36/48</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Glycogen</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>10814010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">ZR small RNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:169px;">R1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td>the last two numbers correspond to the set of indexes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving small rna-seq: less bias and better detection of 2'-o-methyl rnas

Изучение малых РНК (РНК) по секвенированию следующего поколения (NGS) оспаривается проблемами предвзятости при подготовке библиотеки. Несколько типов сРНК, таких как микроРНК растений (миРНК) имеют модификацию 2'O-метил (2'-OMe) на их 3' терминал нуклеотида. Эта модификация добавляет еще одну трудность, поскольку она подавляет 3' перевязки адаптера. Ранее мы продемонстрировали, что модифицированные версии протокола 'TruSeq (TS)' имеют меньшую предвзятость и улучшенное обнаружение 2'-OMe РНК. Здесь мы подробно описываем протокол 'TS5', который показал лучшую общую производительность. За TS5 можно следить либо с помощью самодельных реагентов, либо реагентов из комплекта TS, с одинаковой производительностью.

Критическими шагами являются изоляция небольшой рнковой доли исходного материала РНК(рисунок 3)и желаемого конечного продукта библиотеки(рисунок 4). Оба этапа включают очистку полиакриламидного геля; малая РНК выделена из 15% гелей мочевины TBE, в то время ...

Watch this Scientific Journal Video about Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs at JoVE.com

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

Мы представляем подробный небольшой протокол репарации библиотеки РНК с меньшим уклоном, чем стандартные методы и повышенной чувствительностью для 2'-O-метил РНК. Этот протокол можно соблюдать с помощью самодельных реагентов, чтобы сэкономить стоимость или с помощью комплектов для удобства.

Улучшение малых РНК-сек: Меньше предвзятости и лучшее обнаружение 2'-O-Метил РНК

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

Малая РНК регулирует многие биологические процессы. Поэтому важно разработать чувствительные и беспристрастные методы их обнаружения. Наш протокол протокол предусматривает шаги вперед к этой цели.Наш протокол страдает от меньшего количества проблем с предвзятостью, чем классические методы присвоения библиотеки РНК, и, что важно, он позволяет более чувствительные обнаружения двух зубцов или мезо-РНК. Такие как растительные микро-РНК. После извлечения общей РНК в соответствии со стандартными протоколами.Предварительно запустите 15%TBE мочевины гель в течение пятнадцати минут на 200 вольт. И смешать пять-двадцать микрограммов общей РНК, в пять-пятнадцать микролитер объем, с равным объемом формамида загрузки красителя в 200 микролитровой трубки. Через пять минут при 65 градусах Цельсия, в термоциклере с нагретой крышкой, немедленно поместите трубки на лед и загрузите последний и накройте гель хотя бы одной полосой между ними.Затем запустите гель на 200 вольт, пока бромофенол мигрировал около двух третей длины геля. Чтобы загрузить РНК, сначала проколоть дно нуклеазы бесплатно 0,5 миллилитров микро центрифуги трубки, с 21 калибровочных иглы, и поместите проколотую трубку в нуклеазы бесплатно круглые два миллилитров микро центрифуги трубки. Далее, инкубировать гель при комнатной температуре с нуклеиновой кислотой гель пятно в воде в течение десяти-пятнадцати минут, прежде чем просматривать гель на трансиллюминатор.Вырежьте образец РНК между 17 и 29 нуклеотидных полос лестницы, и передать гель кусок в проколотую трубку. Спин вниз гель в микро центрифуге на максимальной скорости в течение двух минут, и удалить 0,5 миллилитров трубки, которая теперь должна быть пустой. Добавьте 300 микролитров нуклеазы бесплатно 0,3 моляров хлорида натрия в измельченный гель, и поместите трубку на ротатор, по крайней мере два часа при комнатной температуре.В конце конца инкубации перенесите измельченную гелевую суспензию на спиновую колонку и центрифугу на две минуты на максимальной скорости в микро центрифуге. Для нелигированной три основных ликвидации адаптера, тщательно смешать десять микролитров нуклеазы свободной воды с извлеченным образцом РНК, и добавить шесть микролитров из трех моляров ацетата натрия с смешиванием. Добавьте в образец 40 микролитров шариков магнитной очистки и 60 микролитров изопропанола с тщательным смешиванием.И инкубировать подвеску в течение пяти минут при комнатной температуре. В конце инкубации поместите образец на магнитную стойку, пока раствор не станет ясным. Удалите чистый супернатант и добавьте в бисер 180 микролитров свежеприготовленного 80%этанола.Через 30 секунд снимите этанол и ненадолго закрути трубку. Удалите остатки жидкости, которые, возможно, собраны в нижней части трубки, и позволить бисеру высохнуть в течение двух минут, прежде чем повторно приостановить образец в 22 микролитров 10 миллимоляров Tris. Через две минуты намагнителизируйте образец до тех пор, пока раствор не окажется ясным.Затем смешайте 20 микролитров ясного супернатанта с шестью микролитерами из трех ацетата натрия в новой трубке и добавьте 40 микролитров магнитных бусин и 60 микролитров 100%изопропанола. Через пять минут при комнатной температуре намагничйте образец до тех пор, пока раствор не появится ясным, прежде чем удалить супернатант. Обработать образец с 180 микролитров свежеприготовленных 80% этанола в течение 30 секунд, прежде чем удалить этанол спиннинг вниз образца, и удаление любой остаточной жидкости, которая накопилась в нижней части трубки.После того, как шарики высохнут в течение двух минут, повторно приостанавливайте их в 10 микролитров нуклеазной свободной воды в течение двух минут, прежде чем намагничить образец до тех пор, пока раствор не станет ясным. Затем перенесите девять микролитров супернатанта в новую трубку и добавьте в образец один микролитер буфера РНК-лигазы T4 и один ммиколитер воды. Для очистки геля, запустить пять, десять и двадцать микролитров продукта ПЦР на родной 6%TBE гель в течение одного часа.Инкубировать завершенный гель с нуклеиновой кислотой гель пятно в воде в течение десяти-пятнадцати минут, и просматривать гель на трансиллюминатор, чтобы добыча 150 базовых пар библиотечной полосы. Поскольку трудно изолировать 150 базовых пар полос, представляющих их, это наша библиотека, из-за наличия тесно мигрирующих побочных продуктов вам нужно будет сократить гель очень тщательно. Затем изолировать РНК, как только что продемонстрировали.Для изменения файла необработанной последовательности загрузите файлы последовательности fastq, генерируемые во время секвенирования, и при необходимости преформируете демултиплексирование с bcl2fastq2. Удалите последовательности адаптеров с помощью cutodapt и используйте команду, как это было продемонстрировано. Используйте seqtk, как указано для удаления терминальных случайных нуклеотидов в последовательностях читает.Затем используйте команду awk, как указано, чтобы отбросить последовательности короче 10 нуклеотидов. Чтобы сопоставить обрезанные последовательности, откройте miRBase и загрузите зрелый файл fa. Используйте команду, как указано, чтобы заменить остатки U с остатками T, чтобы дать полный список всех микро РНК в базе данных, происходящих из различных организмов.Выберите микро-РНК последовательности организма, представляющих интерес, с командой, как указано, и карта читает файл с помощью bowtie2, не допуская несоответствий. Используйте инструмент для выравнивания последовательностей читает в базу данных, требуя, чтобы читать карты полностью микро РНК базы данных, с любыми несоответствиями, как указано. Затем используйте команду, чтобы отбросить чтения, которые не выравниваются.После загрузки увеличения количества ПЦР усиленная библиотека на гель, как попродемонстрировано, продукты, соответствующие ожидаемому размеру могут быть извлечены. После элюции очищенную библиотеку можно проверить на чипе электрофореза капиллярного геля. В дополнение к ожидаемым 150 базовых парных продуктов, и увеличение доли 130 базовых пар видов, соответствующих адаптер димеры, как правило, наблюдается как увеличение количества продукта ПЦР загружаются.Аналогичные результаты получаются, когда библиотеки из смеси синтетических малых РНК готовятся с использованием реагентов из комплектов или других принадлежностей. Для сравнения показаны ранее опубликованные результаты для той же небольшой смеси РНК. Здесь показано сравнение выполнения протокола TS5 со стандартным протоколом TS для обнаружения неизмененных и двух основных микро-РНК O-methal.Было также протестировано обнаружение двух основных модифицированных пиРНК O-метала в образцах человека. Как отмечается, TS5 преформируется значительно лучше, чем ТС для обнаружения двух основных O-метхальных РНК, но не для неизмененных РНК. Подготовка библиотек репликации для каждого образца в разные даты.Обычно между репликациями, сделанными одновременно, практически нет различий, или между библиотеками, подготовленными в разные даты, могут быть существенные различия.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Последовательность конкретных и избирательное признание двуцепочечной РНК над одноцепочечной РНК, химически изменены пептид нуклеиновых кислот

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Метаболические маркировки и профилирование передачи РНК с помощью Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

ТРИФОСФАТЫ опосредованной реорганизация структуры хроматина цикла

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Обнаружение редких событий, с помощью Исправлена ошибка ДНК и РНК последовательности

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Методология для точного обнаружения метилирования митохондриальной ДНК

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Одной капли цифровой полимеразной цепной реакции для комплексного и одновременного обнаружения мутаций в регионах Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Ячейки на основе анализов SINEUP кодирования РНК, которые могут конкретно улучшить перевод мРНК

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Использование в пробирке и в клеток форму расследовать малые молекулы индуцированной пре мРНК структурные изменения

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Экспрессирующих длиной некодирующих РНК с помощью активации генов ТРИФОСФАТЫ

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...