Name: improving small rna-seq: less bias and better detection of 2'-o-methyl rnas
Uploaded: 2019-09-16T14:45:00
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Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional de Investigaciones Científicas (CNRS), la Comisión Francesa de Energías Alternativas y Energía Atómica (CEA) y la Universidad de París-Sud. Toda la preparación de la biblioteca, la secuenciación de Illumina y los análisis bioinformáticos para este estudio se realizaron en las instalaciones de secuenciación de próxima generación (NGS) de I2BC. Los miembros de las instalaciones de I2BC NGS son reconocidos por la lectura crítica del manuscrito y sugerencias útiles.

1. Aislamiento de pequeños ARN
<ol><li>Extraiga el ARN total utilizando reactivos a base de fenol o cualquier otro método. Verifique si el ARN es de buena calidad.</li>
	<li>Pre-ejecutar un gel tBE-urea 15% (ver Tabla de Materiales)durante 15 min a 200 V.</li>
	<li>Mientras el gel está pre-funcionando, mezcle 5-20 g de ARN total en un volumen de 5-15 l con un volumen igual de tinte de carga de formamida (ver Tabla de Materiales;Formamida 95% desionizada, 0.025% de azul bromofenol, 0...

<ol>
	<li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+silencing+RNAs:+an+expanding+universe.">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).</li><li>Chang, T. C., Mendell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNAs+in+vertebrate+physiology+and+human+disease.">microRNAs in vertebrate physiology and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).</li><li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+expression+profiling+by+high-throughput+sequencing:+implications+of+enzymatic+manipulation.">Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation.</a> Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).</li><li>van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library+preparation+methods+for+next-generation+sequencing:+tone+down+the+bias.">Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias.</a> Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).</li><li>Munafo, D. B., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+enzymatic+reaction+conditions+for+generating+representative+pools+of+cDNA+from+small+RNA.">Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA.</a> RNA. 16, 2537-2552 (2010).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries.">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17, 1697-1712 (2011).</li><li>Sorefan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+ligation+bias+of+small+RNAs+in+libraries+for+next+generation+sequencing.">Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing.</a> Silence. 3, 4 (2012).</li><li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bias-reducing+strategy+in+profiling+small+RNAs+using+Solexa.">A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa.</a> RNA. 17, 2256-2262 (2011).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).</li><li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+bias+in+T4+RNA+ligase-mediated+3'-adapter+ligation.">Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation.</a> Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).</li><li>Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bias+in+ligation-based+small+RNA+sequencing+library+construction+is+determined+by+adaptor+and+RNA+structure.">Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure.</a> PLoS One. 10, 0126049 (2015).</li><li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing.">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19, 118 (2018).</li><li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing.">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6, 26969 (2011).</li><li>Harrison, B., Zimmerman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-stimulated+ligation:+enhanced+ligation+of+oligo-+and+polynucleotides+by+T4+RNA+ligase+in+polymer+solutions.">Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions.</a> Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).</li><li>Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+ligation+dependent+artifacts+in+T4+RNA+ligase+to+achieve+high+efficiency+and+low+bias+microRNA+capture.">Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture.</a> PLoS One. 9, 94619 (2014).</li><li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing.">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14, 109 (2013).</li><li>Barberan-Soler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreasing+miRNA+sequencing+bias+using+a+single+adapter+and+circularization+approach.">Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach.</a> Genome Biology. 19, 105 (2018).</li><li>Chen, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cost-effective+method+for+Illumina+small+RNA-Seq+library+preparation+using+T4+RNA+ligase+1+adenylated+adapters.">A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters.</a> Plant Methods. 8, 41 (2012).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. , (2011).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10, 25 (2009).</li><li>Shore, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+Library+Preparation+Method+for+Next-Generation+Sequencing+Using+Chemical+Modifications+to+Prevent+Adapter+Dimer+Formation.">Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation.</a> PLoS One. 11, 0167009 (2016).</li></ol>

La preparación de la biblioteca de ARN pequeño sigue siendo difícil debido al sesgo, introducido principalmente durante los pasos de ligadura del adaptador. Los ARN con una modificación de 2'-OMe en sus 3' extremos como miRNAs vegetales, piRNA en insectos, nematodos y mamíferos, y pequeños ARN que interfieren (siRNA) en insectos y plantas son particularmente difíciles de estudiar porque la modificación 2'-OMe inhibe la ligadura adaptadora de 3'. En la literatura se han propuesto una serie de soluciones para mejor...

Pequeños ARN (ARN) participan en el control de una diversidad de procesos biológicos1. Los ARNm reguladores eucariotas suelen tener entre 20 y 30 nt de tamaño; los tres tipos principales son los microARN (miRNA), los ARN que interactúan con piwi (piRNA) y los ARN pequeños que interfieren (siRNA). Los niveles de expresión de miRNA aberrante se han implicado en una variedad de enfermedades2. Esto subraya la importancia de los miRNA en la salud y las enfermedades y el requisito de herramientas de investigación precisas y cuantitativas para detectar los ARNNa en general.
La secuenciación de próxima generación (NGS) es un método ampliamente utilizado para estudiar los ARN. Las principales ventajas de NGS en comparación con otros enfoques, como las técnicas cuantitativas de PCR o microarray (qPCR), son que no necesita conocimiento a priori de las secuencias de ARN y, por lo tanto, puede utilizarse para descubrir nuevos ARN, y además sufre menos de señal de fondo y efectos de saturación. Además, puede detectar diferencias de nucleótidos individuales y tiene un mayor rendimiento que los microarrays. Sin embargo, NGS también tiene algunos inconvenientes; el costo de una ejecución de secuenciación sigue siendo relativamente alto y el proceso de varios pasos necesario para convertir una muestra en una biblioteca para la secuenciación puede introducir sesgos. En un proceso típico de preparación de la biblioteca de ARNS, un adaptador de 3' se liga primero al ARNS (a menudo purificado en gel del ARN total) utilizando una versión truncada de la ligada de ARN 2 (RNL2) y un adaptador de 3' preadenilado(Figura 1) en ausencia de ATP. Esto aumenta la eficiencia de la ligadura del adaptador de ARN sRNA y reduce la formación de reacciones secundarias como la circularización del ARNS o la concatemerización. Posteriormente, un adaptador de 5' es ligado por la ligada de ARN 1 (RNL1), seguido de transcripción inversa (RT) y amplificación pcR. Todos estos pasos pueden introducir sesgo3,4. Por consiguiente, es posible que los números de lectura no reflejen los niveles reales de expresión de ARNS reales que conducen a patrones de expresión artificiales dependientes del método. Los ARNEspecíficos específicos pueden estar sobrerrepresentados o subrepresentados en una biblioteca, y los ARNs fuertemente subrepresentados pueden escapar a la detección. La situación es particularmente complicada con miRNAs vegetales, siRNAs en insectos y plantas, y piRNAs en insectos, nematodos y mamíferos, en los que el nucleótido terminal de 3' tiene una modificación de 2'-O-metil (2'-OMe)1. Esta modificación inhibe fuertemente la ligadura del adaptadorde 3',haciendo que la preparación de la biblioteca para estos tipos de ARN sea una tarea difícil.
Trabajos anteriores demostraron que la ligadura del adaptador introduce un sesgo grave, debido a los efectos de secuencia/estructura de ARN6,7,8,9,10,11. Los pasos aguas abajo de la ligadura del adaptador, como la transcripción inversa y la PCR, no contribuyen significativamente al sesgo6,11,12. Es probable que el sesgo de ligadura se deba al hecho de que las moléculas adaptadoras con una secuencia determinada interactuarán con moléculas de ARNS en la mezcla de reacción para formar pliegues, que pueden conducir a configuraciones favorables o desfavorables para la ligadura(Figura 2). Los datos de Sorefan et al7 sugieren que RNL1 prefiere un solo contexto trenzado, mientras que RNL2 prefiere una doble hebra para la ligadura. El hecho de que las estructuras de plegado conjunto del adaptador/sRNA estén determinadas por las secuencias específicas de adaptador y sRNA explica por qué el ARNS específico está sobrerrepresentado o subrepresentado con un conjunto de adaptadores determinado. También es importante tener en cuenta que dentro de una serie de bibliotecas de SRNA que se van a comparar, se deben utilizar las mismas secuencias de adaptador. De hecho, se ha observado anteriormente que el cambio de adaptadores mediante la introducción de diferentes secuencias de códigos de barras altera los perfiles de miRNA en las bibliotecas de secuenciación9,13.
La aleatorización de secuencias de adaptadores cerca de la unión de ligación probablemente reduce estos sesgos. Sorefan y sus colegas7 utilizaron adaptadores con 4 nucleótidos aleatorios en sus extremidades, designaron adaptadores de "alta definición" (HD) y demostraron que el uso de estos adaptadores conduce a bibliotecas que reflejan mejor los verdaderos niveles de expresión de ARNS. Trabajos más recientes confirmaron estas observaciones y revelaron que la región aleatorizada no necesita ser adyacente a la unión de ligación11. Este novedoso tipo de adaptadores se llamaba "MidRand" adaptadores. Juntos, estos resultados demuestran que el diseño mejorado del adaptador puede reducir el sesgo.
En lugar de modificar los adaptadores, el sesgo se puede suprimir mediante la optimización de las condiciones de reacción. Se ha demostrado que el polietilenglicol (PEG), un agente de aglomeración macromolecular conocido por aumentar la eficiencia de la ligadura14,reduce significativamente el sesgo15,16. Sobre la base de estos resultados, varios kits de "bajo sesgo" aparecieron en el mercado. Estos incluyen kits que utilizan PEG en las reacciones de ligadura, ya sea en combinación con adaptadores clásicos o adaptadores HD. Otros kits evitan la ligadura por completo, y utilizar 3' poliadenilación y cambio de plantilla para 3' y 5' adición de adaptador, respectivamente12. En otra estrategia, la ligadura del adaptador de 3' es seguida por un paso de circularización, omitiendo así 5' ligadura del adaptador17.
En un estudio anterior, buscamos un protocolo de preparación de la biblioteca de ARNS con los niveles más bajos posibles de sesgo y la mejor detección de los ARN 2'-OMe12. Probamos algunos de los kits de "sesgo bajo" antes mencionados, que tenían una mejor detección de los ARN 2'-OMe que el protocolo estándar (TS). Sorprendentemente, sin embargo, tras la modificación (el uso de adaptadores aleatorios, PEG en las reacciones de ligación y la eliminación del exceso de adaptador de 3' por purificación) este último superó a los otros protocolos para la detección de RNA 2'-OMe. Aquí, describimos en detalle un protocolo basado en el protocolo TS, 'TS5', que tenía la mejor detección general de 2'-OMe RNAs. El protocolo se puede seguir utilizando reactivos del kit TS y un reactivo del kit 'Nf' o, para ahorrar dinero, utilizando reactivos caseros, con el mismo rendimiento. También proporcionamos un protocolo detallado para la purificación de ARN SRNA a partir del ARN total y la preparación del adaptador preadenilado de 3'.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:873px;" width="874">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">2100 Bioanalyzer Instrument&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">G2939BA</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td style="width:159px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:169px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Bioanalyzer Small RNA Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">5067-1548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS8162-96EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Dark Reader transilluminator</td>
			<td style="width:159px;">various suppiers</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">HotStart PCR Kit, with dNTPs</td>
			<td style="width:159px;">Kapa Biosystems</td>
			<td>KK2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">NEXTflex small RNA-seq V3 kit</td>
			<td style="width:159px;">BIOO Scientific</td>
			<td style="width:169px;">NOVA-5132-05</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Novex TBE gels 6%</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Novex TBE Urea gels 15%</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EC6885BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td style="width:159px;">Qiagen&#160;</td>
			<td style="width:169px;">28304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Qubit 4 Quantitation Starter Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">Q33227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Qubit ssDNA Assay Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:374px;">RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">RNase Inhibitor, Murine&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">18090200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:28px;width:374px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">T4 RNA Ligase 2, truncated</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrackIt 50 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">10488043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">TruSeq Small RNA Library Prep Kit</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td>RS-200-0012/24/36/48</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Glycogen</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>10814010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">ZR small RNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:169px;">R1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td>the last two numbers correspond to the set of indexes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving small rna-seq: less bias and better detection of 2'-o-methyl rnas

El estudio de los ARN pequeños (ARN) mediante la secuenciación de próxima generación (NGS) se ve cuestionado por problemas de sesgo durante la preparación de la biblioteca. Varios tipos de ARNS, como los microARN vegetales (miRNAs) llevan una modificación de 2'-O-metil (2'-OMe) en su nucleótido terminal de 3'. Esta modificación añade otra dificultad, ya que inhibe la ligadura del adaptador de 3'. Anteriormente demostramos que las versiones modificadas del protocolo 'TruSeq (TS)' tienen menos sesgo y una mejor detección de ARN 2'-OMe. Aquí describimos en detalle el protocolo 'TS5', que mostró el mejor rendimiento general. TS5 se puede seguir utilizando reactivos caseros o reactivos del kit TS, con el mismo rendimiento.

Los pasos críticos son el aislamiento de la pequeña fracción de ARN del material de ARN total inicial(Figura 3) y el producto de biblioteca final deseado (Figura 4). Ambos pasos implican la purificación del gel de poliacrilamida; ARN pequeño se aísla del 15% de geles de urea TBE, mientras que las bibliotecas finales están aisladas de geles TBE nativos al 6%. ARN pequeño aislado de gel se puede analizar en un pequeño chip de electroforesis capilar de ARN...

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Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

Presentamos un protocolo detallado de reparación de la biblioteca de ARN pequeño con menos sesgo que los métodos estándar y una mayor sensibilidad para los ARN de 2'-O-metil. Este protocolo se puede seguir utilizando reactivos caseros para ahorrar costos o usar kits para mayor comodidad.

Mejora de ARN pequeño-seq: Menos sesgo y mejor detección de 2'-O-Metil RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

El ARN pequeño regula muchos procesos biológicos. Por lo tanto, es importante desarrollar métodos sensibles e imparciales para detectarlos. Nuestro protocolo de protocolo proporciona pasos hacia adelante hacia este objetivo.Nuestro protocolo sufre de menos problemas de sesgo, que los métodos clásicos de apropiación de bibliotecas de ARN pequeño, y lo que es más importante permite una detección más sensible de dos puntas o meso-RNAs. Como micro-RNAs de plantas. Después de extraer el ARN total de acuerdo con los protocolos estándar.Pre-ejecutar un 15%TBE gel de urea durante quince minutos a 200 voltios. Y mezcle de cinco a veinte microgramos de ARN total, en un volumen de cinco a quince microlitros, con un volumen igual de tinte de carga de formamida en un tubo de 200 microlitros. Después de cinco minutos a 65 grados Celsius, en un termociclo con una tapa calentada, coloque inmediatamente los tubos sobre hielo y cargue este último y muestree el gel con al menos un carril entre ellos.A continuación, ejecute el gel a 200 voltios hasta que el bromofenol haya migrado aproximadamente dos tercios de la longitud del gel. Para cargar el ARN, primero perfore la parte inferior de un tubo de micro centrífuga de 0,5 mililitros libre de nucleasas, con una aguja de calibre 21, y coloque el tubo perforado en un tubo de micro centrífuga de dos mililitros de fondo redondo libre de nucleasa. A continuación, incubar el gel a temperatura ambiente con la mancha de gel de ácido nucleico en agua durante diez a quince minutos, antes de ver el gel en un transiluminador.Corte el ARN de muestra entre 17 y 29 bandas de escalera de nucleótidos y transfiera la pieza de gel al tubo perforado. Gire hacia abajo el gel en una micro centrífuga a la velocidad máxima durante dos minutos, y retire el tubo de 0,5 mililitros que ahora debería estar vacío. Añadir 300 microlitros de cloruro de sodio sin nucleasas 0,3 al gel triturado y colocar el tubo sobre un rotador durante al menos dos horas a temperatura ambiente.Al final de la incubación, transfiera la suspensión de las piezas de gel trituradas a una columna de espín y centrifugar durante dos minutos a la velocidad máxima en la micro centrífuga. Para la eliminación sin esligar de tres adaptadores primos, mezcle a fondo diez microlitros de agua libre de nucleasa con la muestra de ARN extraída, y agregue seis microlitros de tres molares de acetato de sodio con mezcla. Agregue 40 microlitros de cuentas de purificación magnética y 60 microlitros de isopropanol a la muestra con una mezcla exhaustiva.E incubar la suspensión durante cinco minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, coloque la muestra en un bastidor magnético, hasta que la solución quede clara. Retire el sobrenadante transparente y agregue 180 microlitros de 80% de etanol recién preparado a las perlas.Después de 30 segundos, retire el etanol y gire brevemente el tubo. Retire cualquier líquido residual que pueda haberse acumulado en la parte inferior del tubo, y deje que las cuentas se sequen durante dos minutos antes de volver a suspender la muestra en 22 microlitros de 10 Tris mililares. Después de dos minutos magnetizar la muestra hasta que la solución aparezca clara.A continuación, mezclar 20 microlitros de sobrenadante transparente con seis microlitros de tres molares de acetato de sodio en un tubo nuevo, y añadir 40 microlitros de cuentas magnéticas y 60 microlitros de 100% isopropanol. Después de cinco minutos a temperatura ambiente, magnetice la muestra hasta que la solución parezca transparente, antes de retirar el sobrenadante. Tratar la muestra con 180 microlitros de 80% de etanol recién preparado durante 30 segundos antes de retirar el etanol girando por la muestra, y eliminar cualquier líquido residual que se haya acumulado en la parte inferior del tubo.Después de permitir que las perlas se sequen durante dos minutos, vuelva a suspenderlas en 10 microlitros de agua libre de nucleasas, durante dos minutos, antes de magnetizar la muestra hasta que la solución quede clara. A continuación, transfiera nueve microlitros de sobrenadante a un nuevo tubo y agregue un microlitro de tampón de ARN 4, y un micrcoliter de agua a la muestra. Para la purificación de gel, ejecutar cinco, diez, y veinte microlitros de producto PCR en un gel nativo 6%TBE durante aproximadamente una hora.Incubar el gel completo con la mancha de gel de ácido nucleico en agua durante diez a quince minutos, y ver el gel en un transilluminador para permitir la extracción de la banda de biblioteca de 150 pares base. Como es difícil aislar la banda de 150 pares base que los representa, estas son nuestra biblioteca, debido a la presencia de productos secundarios estrechamente migratorios que tendrá que cortar el gel con mucho cuidado. A continuación, aísle el ARN como se acaba de demostrar.Para la modificación de archivos de secuencia sin procesar, descargue los archivos de secuencia fastq generados durante la ejecución de secuenciación y preforme la demultiplexación con bcl2fastq2 según sea necesario. Quite las secuencias de adaptadores mediante cutodapt y utilice el comando como se ha demostrado. Utilice seqtk como se indica para eliminar los nucleótidos aleatorios terminales en las lecturas de secuencias.A continuación, utilice el comando awk como se indica, para descartar las secuencias más cortas que 10 nucleótidos. Para asignar las secuencias recortadas, abra miRBase y descargue el archivo fa maduro. Utilice el comando indicado para sustituir los residuos U por residuos de T, para producir una lista completa de todos los micro ARN de la base de datos, procedentes de una variedad de organismos.Seleccione las secuencias de micro ARN del organismo de interés, con el comando como se indica, y asigne las lecturas al archivo utilizando bowtie2, sin permitir discrepancias. Utilice la herramienta para alinear las lecturas de secuencias con la base de datos, lo que requiere que una lectura se asigne por completo a un micro ARN de la base de datos, sin que se desajusten las discrepancias indicadas. A continuación, utilice el comando para descartar las lecturas que no se alinearon.Después de cargar cantidades crecientes de una biblioteca amplificada PCR en un gel como se ha demostrado, los productos correspondientes al tamaño esperado se pueden extraer. Después de la elución, la biblioteca purificada se puede comprobar en un chip de electroforesis de gel capilar. Además del producto esperado de 150 pares base, y la proporción creciente de una especie de par base de 130 correspondientes a los dimers de adaptador, se observan típicamente como cantidad creciente de producto PCR se cargan.Se obtienen resultados similares cuando las bibliotecas de una mezcla de ARN pequeños sintéticos se preparan utilizando reactivos de kits u otros suministros. Para la comparación, se muestran los resultados publicados previamente para la misma pequeña mezcla de ARN. Aquí, se muestra una comparación para el rendimiento del protocolo TS5 con el protocolo TS estándar para la detección de microNas de plantas modificadas O-metales de primera calidad.También se probó la detección de dos piRNAs modificados o-metales de primera calidad en muestras humanas. Como se observó TS5 preformado significativamente mejor que TS para la detección de dos ARN ometales primos, pero no para ARN no modificados. Prepare bibliotecas de réplicas para cada ejemplo en fechas diferentes.Por lo general, hay poca variación entre las réplicas hechas simultáneamente, o puede haber una variación sustancial entre las bibliotecas preparadas en diferentes fechas.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detección del número de copias alteraciones Uso de Secuenciación de los organismos unicelulares

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Investigación

Genética

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Reconocimiento de secuencia específica y selectivo de RNAs de doble cadena sobre ARN monocatenario de modifica químicamente los ácidos nucleicos péptidos

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Etiquetado metabólico y perfiles de RNAs de transferencia utilizando Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Mediada por CRISPR reorganización de la estructura de bucles de cromatina

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Detección de eventos raros usando ADN Error corregido y secuenciación de ARN

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metodología para la detección exacta de la metilación del ADN mitocondrial

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Reacción en cadena polimerasa Digital sola gota para la detección integral y simultánea de mutaciones en las regiones de Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Celular basado en análisis de SINEUP no-codificación RNAs que específicamente pueden mejorar la traducción del mRNA

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

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Uso en Vitro y en las células la forma para investigar la molécula pequeña inducida por cambios estructurales Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Overexpressing larga Noncoding RNAs mediante activación de gen CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...