Name: improving small rna-seq: less bias and better detection of 2'-o-methyl rnas
Uploaded: 2019-09-16T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Bilimsel Araştırma Merkezi (CNRS), Fransız Alternatif Enerjiler ve Atom Enerjisi Komisyonu (CEA) ve Paris-Sud Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma için tüm kütüphane hazırlama, Illumina dizilemesi ve biyoinformatik analizleri I2BC Yeni Nesil Sıralama (NGS) tesisinde yapılmıştır. I2BC NGS tesisinin üyeleri, makalenin eleştirel okunması ve yararlı öneriler için kabul edilmektedir.

1. Küçük RNA'ların İzolasyon
<ol><li>Fenol bazlı reaktifler veya başka bir yöntem kullanarak toplam RNA ayıklayın. RNA'nın kaliteli olup olmadığını doğrulayın.</li>
	<li>Önceden 200 V'de 15 dakika boyunca %15 TBE-üre jeli (Bkz. Malzeme Tablosu)çalıştırın.</li>
	<li>Jel önceden çalışırken, 5-15 μL hacimdeki toplam RNA'nın 5-20 μg'sini eşit hacimli formamid yükleme boyası ile karıştırın (bkz. Aynı şekilde, 10 μL (200 ng) küçük RNA merdiveni<st...

<ol>
	<li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+silencing+RNAs:+an+expanding+universe.">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).</li><li>Chang, T. C., Mendell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNAs+in+vertebrate+physiology+and+human+disease.">microRNAs in vertebrate physiology and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).</li><li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+expression+profiling+by+high-throughput+sequencing:+implications+of+enzymatic+manipulation.">Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation.</a> Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).</li><li>van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library+preparation+methods+for+next-generation+sequencing:+tone+down+the+bias.">Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias.</a> Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).</li><li>Munafo, D. B., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+enzymatic+reaction+conditions+for+generating+representative+pools+of+cDNA+from+small+RNA.">Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA.</a> RNA. 16, 2537-2552 (2010).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries.">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17, 1697-1712 (2011).</li><li>Sorefan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+ligation+bias+of+small+RNAs+in+libraries+for+next+generation+sequencing.">Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing.</a> Silence. 3, 4 (2012).</li><li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bias-reducing+strategy+in+profiling+small+RNAs+using+Solexa.">A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa.</a> RNA. 17, 2256-2262 (2011).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).</li><li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+bias+in+T4+RNA+ligase-mediated+3'-adapter+ligation.">Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation.</a> Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).</li><li>Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bias+in+ligation-based+small+RNA+sequencing+library+construction+is+determined+by+adaptor+and+RNA+structure.">Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure.</a> PLoS One. 10, 0126049 (2015).</li><li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing.">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19, 118 (2018).</li><li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing.">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6, 26969 (2011).</li><li>Harrison, B., Zimmerman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-stimulated+ligation:+enhanced+ligation+of+oligo-+and+polynucleotides+by+T4+RNA+ligase+in+polymer+solutions.">Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions.</a> Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).</li><li>Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+ligation+dependent+artifacts+in+T4+RNA+ligase+to+achieve+high+efficiency+and+low+bias+microRNA+capture.">Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture.</a> PLoS One. 9, 94619 (2014).</li><li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing.">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14, 109 (2013).</li><li>Barberan-Soler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreasing+miRNA+sequencing+bias+using+a+single+adapter+and+circularization+approach.">Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach.</a> Genome Biology. 19, 105 (2018).</li><li>Chen, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cost-effective+method+for+Illumina+small+RNA-Seq+library+preparation+using+T4+RNA+ligase+1+adenylated+adapters.">A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters.</a> Plant Methods. 8, 41 (2012).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. , (2011).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10, 25 (2009).</li><li>Shore, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+Library+Preparation+Method+for+Next-Generation+Sequencing+Using+Chemical+Modifications+to+Prevent+Adapter+Dimer+Formation.">Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation.</a> PLoS One. 11, 0167009 (2016).</li></ol>

Küçük RNA kitaplık hazırlığı, özellikle adaptör ligasyon adımları sırasında tanıtılan önyargı nedeniyle zorlu olmaya devam etmektedir. Bitki miRNA'ları, böceklerde, nematodlarda ve memelilerde piRNA ve böceklerde ve bitkilerde küçük müdahale eden RNA'lar (siRNA) gibi 3' ucunda 2'-OMe modifikasyonu olan RNA'ların incelenmesi özellikle zordur çünkü 2'-OMe modifikasyonu 3'-ADAPTÖR ligasyonunu engeller. Literatürde sRNA kitaplık hazırlama protokollerini geliştirmek için bir dizi çözüm ?...

Küçük RNA'lar (sRNA'lar) biyolojik süreçlerin çeşitliliğinin kontrolünde yer almaktadır1. Ökaryotik düzenleyici sRNA'lar genellikle 20 ile 30 nt arasındadır; üç ana tip mikroRNA (miRNA), piwi-etkileşimrra'lar (piRNA) ve küçük interferans RNA'ları (siRNA)dir. Anormal miRNA ekspresyon düzeyleri çeşitlihastalıklarakarışmış 2 . Bu, miRNA'ların sağlık ve hastalık taki önemini ve genel olarak SRNA'ları saptamak için doğru, nicel araştırma araçları nın gerekliliğini vurgulamaktadır.
Yeni nesil sıralama (NGS) sRNA'ları incelemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. NgS'nin kantitatif PCR veya mikrodizi teknikleri (qPCR) gibi diğer yaklaşımlarla karşılaştırıldığında başlıca avantajları, sRNA dizileri hakkında priori bilgisine ihtiyaç duymaması ve bu nedenle yeni RNA'ları keşfetmek için kullanılabilmesi ve buna ek olarak daha az arka plan sinyali ve doygunluk etkileri. Ayrıca, tek nükleotit farklılıkları algılayabilir ve mikrodizilerden daha yüksek bir iş elde eder. Ancak, NGS de bazı dezavantajları vardır; sıralama çalışmasının maliyeti nispeten yüksek kalır ve bir örneği sıralama için kitaplığa dönüştürmek için gereken çok aşamalı işlem önyargılara neden olabilir. Tipik bir sRNA kitaplık hazırlama işleminde, 3' adaptör ilk olarak SNA ligase 2 (RNL2) ve atp yokluğunda preadentlated 3' adaptör(Şekil 1)kesilmiş bir sürümü kullanılarak sRNA (genellikle toplam RNA'dan jel saflaştırılmış) ile bağlanır. Bu sRNA-adaptör ligasyonunun verimliliğini artırır ve sRNA daireselleştirme veya koncatemerization gibi yan reaksiyonların oluşumunu azaltır. Daha sonra, 5' adaptör RNA ligase 1 (RNL1) ile, ardından ters transkripsiyon (RT) ve PCR amplifikasyonu ile bağlanır. Tüm bu adımlar önyargı3,4tanıtabilir. Sonuç olarak, okuma sayıları yapay, yönteme bağımlı ifade desenlerine yol açan gerçek sRNA ifade düzeylerini yansıtmayabilir. Belirli SRNA'lar bir kütüphanede aşırı veya az temsil edilebilir ve güçlü bir şekilde yeterince temsil edilmeyen sRNA'lar tespitten kurtulabilir. Durum özellikle bitki miRNA'ları, böcek ve bitkilerdeki siRNA'lar ve böceklerde, nematodlarda ve memelilerde piRNA'lar ile karmaşıktır ve 3'-O-metil (2'-OMe) modifikasyonu1. Bu modifikasyon kuvvetle inhibe 3 ' adaptör ligasyon5,RNA bu tür için kütüphane hazırlık zor bir görev yapma.
Önceki çalışma adaptör ligasyonu ciddi önyargı tanıttı gösterdi, RNA dizisi nedeniyle / yapı etkileri6,7,8,9,10,11. Ters transkripsiyon ve PCR gibi adaptör ligasyonunun aşağı doğru adımlarında önyargı6,11,12önemli ölçüde katkıda bulunmaz. Ligasyon yanlılığı, belirli bir diziye sahip adaptör moleküllerinin reaksiyon karışımındaki sRNA molekülleriyle etkileşime girebileceği gerçeğinden kaynaklanmaktadır ve bu da ligasyon için olumlu veya elverişsiz konfigürasyonlara yol açabilir (Şekil 2). Sorefan ve ark7'den elde edilen veriler RNL1'in tek bir mahsur bağlamı tercih ettiğini, RNL2'nin ise ligasyon için çift iplikçik tercih ettiğini göstermektedir. Bağdaştırıcı/sRNA eş kıvrım yapılarının belirli bağdaştırıcı ve sRNA dizileri tarafından belirlenmesi, belirli sRNA'nın neden belirli bir bağdaştırıcı kümesiyle neden aşırı veya az temsil edildiğini açıklar. Karşılaştırılacak bir dizi sRNA kitaplığı içinde aynı bağdaştırıcı dizilerinin kullanılması gerektiğini de unutmayın. Nitekim, daha önce farklı barkod dizileri giriş tarafından adaptörleri değişen kütüphaneler9,13sıralama miRNA profilleri değiştirir gözlenmiştir.
Bağdaştırıcı dizilerinin ligasyon kavşağına yakın randomize edilmesi bu önyargıları azaltır. Sorefan ve meslektaşları7 kendi ekstremitelerinde 4 rasgele nükleotit ile adaptörler ihdas, belirlenen "High Definition" (HD) adaptörleri, ve bu adaptörlerin kullanımı daha iyi gerçek sRNA ifade düzeylerini yansıtan kütüphanelere yol gösterdi. Daha yeni çalışmalar bu gözlemler doğruladı ve randomize bölge ligasyon kavşak11bitişik olması gerekmez ortaya . Adaptörler bu roman türü "MidRand" adaptörleri seçildi. Birlikte, bu sonuçlar gelişmiş bağdaştırıcı tasarımıönyargı azaltabilir göstermektedir.
Bağdaştırıcıları değiştirmek yerine, yanlılık reaksiyon koşullarının optimizasyonu yoluyla bastırılabilir. Polietilen glikol (PEG), ligasyon verimliliğini artırmak için bilinen bir makromoleküler kalabalık ajan14,belirgin önyargı azaltmak için gösterilmiştir15,16. Bu sonuçlara dayanarak, birkaç "düşük önyargı" kitleri piyasada ortaya çıktı. Bunlar arasında, klasik adaptörler veya HD adaptörlerle birlikte ligasyon reaksiyonlarında PEG kullanan kitler yer almaktadır. Diğer kitleri tamamen ligasyon önlemek ve 3' poliadenilasyon ve şablon anahtarlama 3' ve 5' adaptör ek, sırasıyla12kullanın. Başka bir stratejide ise 3' adaptör ligasyonu daireselleştirme adımı ile takip edilir,böylece 5' adaptör ligasyonu 17.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.00
Bir önceki çalışmada, biz önyargı mümkün olan en düşük düzeyde ve 2'-OMe RNA12en iyi tespiti ile bir sRNA kütüphane hazırlama protokolü aradı. Biz standart protokol (TS) daha 2'-OMe RNA daha iyi bir tespit vardı yukarıda belirtilen 'düşük önyargı' kitleri, bazı test etti. Şaşırtıcı ancak, modifikasyon üzerine (randomize adaptörlerin kullanımı, ligasyon reaksiyonlarında PEG ve saflaştırma tarafından aşırı 3' adaptör kaldırılması) ikinci 2'-OMe RNA tespiti için diğer protokolleri geride. Burada, 2'-OMe RNA'ların en iyi genel tespitine sahip olan TS protokolü 'TS5'e dayalı bir protokolü ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Protokol, TS kitinden reaktifler ve 'Nf' kitinden bir reaktif kullanılarak veya paradan tasarruf etmek için ev yapımı reaktifler kullanılarak eşit performansla izlenebilir. Ayrıca sRNA'nın toplam RNA'dan arındırılması ve preadentlated 3' adaptörünün hazırlanması için ayrıntılı bir protokol salıyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:873px;" width="874">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">2100 Bioanalyzer Instrument&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">G2939BA</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td style="width:159px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:169px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Bioanalyzer Small RNA Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:169px;">5067-1548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS8162-96EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Dark Reader transilluminator</td>
			<td style="width:159px;">various suppiers</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">HotStart PCR Kit, with dNTPs</td>
			<td style="width:159px;">Kapa Biosystems</td>
			<td>KK2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">NEXTflex small RNA-seq V3 kit</td>
			<td style="width:159px;">BIOO Scientific</td>
			<td style="width:169px;">NOVA-5132-05</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Novex TBE gels 6%</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Novex TBE Urea gels 15%</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EC6885BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td style="width:159px;">Qiagen&#160;</td>
			<td style="width:169px;">28304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Qubit 4 Quantitation Starter Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">Q33227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">Qubit ssDNA Assay Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:374px;">RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">RNA Gel Loading Dye (2X)</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">RNase Inhibitor, Murine&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">18090200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:28px;width:374px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">T4 RNA Ligase 2, truncated</td>
			<td style="width:159px;">Nex England Biolabs</td>
			<td style="width:169px;">M0242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrackIt 50 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">10488043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">TruSeq Small RNA Library Prep Kit</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td>RS-200-0012/24/36/48</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Glycogen</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>10814010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:169px;">EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;">ZR small RNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:169px;">R1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:374px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td>the last two numbers correspond to the set of indexes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving small rna-seq: less bias and better detection of 2'-o-methyl rnas

Küçük RNA'ların (sRNA) yeni nesil sıralama (NGS) ile incelenmesi, kütüphane hazırlığı sırasında önyargı sorunlarıyla mücadele ediyor. Bitki mikroRNA'ları (miRNA'lar) gibi çeşitli sRNA tipleri 3'lük terminal nükleotitlerinde 2'-O-metil (2'-OMe) modifikasyonu taşırlar. Bu modifikasyon 3'ün adaptör ligasyonunu inhibe ederken başka bir zorluk daha ekler. Daha önce 'TruSeq (TS)' protokolünün değiştirilmiş sürümlerinin daha az önyargıya ve 2'-OMe RNA'ların daha iyi algılanmasına sahip olduğunu gösterdik. Burada ayrıntılı protokolü 'TS5' olan en iyi genel performansı gösterdi açıklar. TS5, ts kitinden ev yapımı reaktifler veya reaktifler kullanılarak eşit performansla takip edilebilir.

Kritik adımlar, başlangıç toplam RNA materyalinin küçük RNA fraksiyonunun(Şekil 3)ve istenilen nihai kütüphane ürününün(Şekil 4)izolasyonudur. Her iki adım da poliakrilamid jel saflaştırma içerir; küçük RNA% 15 TBE üre jelleri izole edilir, son kütüphaneler% 6 yerli TBE jelleri izole edilir. Jelden izole edilen küçük RNA küçük bir RNA kapiller elektroforez çipi üzerinde analiz edilebilir (Malzeme Tablosu; <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs at JoVE.com

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

Standart yöntemlere göre daha az önyargılı ve 2'-O-metil RNA'lar için artan hassasiyetiçeren ayrıntılı bir küçük RNA kütüphane telafi protokolü saiyoruz. Bu protokol maliyet tasarrufu veya kolaylık sağlamak için kitleri kullanarak ev yapımı reaktifler kullanılarak izlenebilir.

Küçük RNA-seq iyileştirilmesi: Daha Az Önyargı ve 2'-O-Metil RNA'ların Daha İyi Tespiti

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

Küçük RNA birçok biyolojik süreci düzenler. Bu nedenle bunları tespit etmek için hassas ve tarafsız yöntemler geliştirmek önemlidir. Protokol protokolümüz bu hedefe doğru adımlar atabiliyor.Protokolümüz klasik küçük RNA kütüphane ödenek yöntemleridaha az önyargı sorunları muzdarip ve daha da önemlisi iki prong veya meso-RNA daha hassas algılamaları sağlar. Bitki mikro-RNA'ları gibi. Standart protokollere göre toplam RNA ayıkladıktan sonra.Önceden 200 volt on beş dakika boyunca% 15 TBE üre jel çalıştırın. Ve toplam RNA beş ila yirmi mikrogram karıştırın, beş ila on beş mikrolitre hacmi, 200 mikrolitrelik bir tüp formamid yükleme boya eşit hacimli. 65 derece santigrat beş dakika sonra, ısıtmalı bir kapak ile bir termocycler, hemen buz tüpleri yerleştirin ve aralarında en az bir şerit ile jel ve örnek yük.Bromofenol jel uzunluğunun yaklaşık üçte ikisi ne kadar göç etti kadar Sonra 200 volt jel çalıştırın. RNA'yı yüklemek için, ilk olarak bir nükleaz içermeyen 0,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünün altını 21 gauge iğneyle delinin ve delinmiş tüpü çekirdeksiz yuvarlak alt iki mililitrelik mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Daha sonra, bir transilluminator üzerinde jel görüntülemeden önce, on ila on beş dakika suda nükleik asit jel lekesi ile oda sıcaklığında jel kuluçka.Örnek RNA'yı 17 ile 29 nükleotit merdiven bantları arasında kesin ve jel parçasını delinmiş tüpe aktarın. Jeli iki dakika boyunca maksimum hızda mikro santrifüjde aşağı doğru çevirin ve şimdi boş olması gereken 0,5 mililitrelik tüpü çıkarın. Ezilmiş jele 300 mikrolitre nükleaz içermeyen 0,3 azılak sodyum klorür ekleyin ve tüpü oda sıcaklığında en az iki saat rotator üzerine yerleştirin.Kuluçka sonunda, ezilmiş jel parçalarını bir spin sütununa aktarın ve mikro santrifüjde maksimum hızda iki dakika santrifüj edin. Unligated üç ana adaptör eliminasyonu için, iyice çıkarılan RNA örneği ile on mikrolitre nükleaz serbest su karıştırın ve karıştırma ile üç azı lı sodyum asetat altı mikrolitre ekleyin. Numuneye 40 mikrolitre manyetik saflaştırma boncukları ve 60 mikrolitre isopropanol ekleyin.Ve oda sıcaklığında süspansiyonu beş dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka nın sonunda, çözelti netleşene kadar numuneyi manyetik bir rafa yerleştirin. Berrak supernatant çıkarın ve boncuklar için taze hazırlanmış% 80 etanol 180 mikrolitre ekleyin.30 saniye sonra, etanol çıkarın ve kısaca tüp spin. Tüpün alt kısmında toplanmış olabilecek herhangi bir sıvıyı çıkarın ve 10 milimolar Tris'in 22 mikrolitresinde numuneyi yeniden askıya almadan önce boncukların iki dakika kurumasını bekleyin. İki dakika sonra çözelti net görünene kadar numuneyi manyetize edin.Daha sonra, yeni bir tüpte üç molar sodyum asetat altı mikrolitre ile açık supernatant 20 mikrolitre karıştırın ve manyetik boncuk 40 mikrolitre ve% 100 izopropanol 60 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, süpernatant çıkarmadan önce, çözelti net görünene kadar örnek manyetize. Numuneyi, numunenin altında biriken etanolçıkarmadan ve tüpün altında biriken sıvıyı çıkarmadan önce 30 saniye boyunca 180 mikrolitre taze hazırlanmış %80 etanolle tedavi edin.Boncukların iki dakika kurumasını sağladıktan sonra, çözelti netleşene kadar numuneyi manyetize etmeden önce 10 mikrolitre çekirdeksiz su yla iki dakika süreyle yeniden askıya alın. Daha sonra, yeni bir tüp için supernatant dokuz mikrolitre aktarın ve t4 RNA ligaz tampon bir mikrolitre ekleyin, ve örnek su bir micrcolitre. Jel arıtma için, yaklaşık bir saat boyunca bir yerli% 6 TBE jel pcr ürün beş, on ve yirmi mikrolitre çalıştırın.Tamamlanmış jeli 10 ila 15 dakika suda nükleik asit jelle birlikte inkübe edin ve 150 baz çifti kütüphane bandının çıkarılmasını sağlamak için jeli bir transilluminator üzerinde görüntüleyin. Onları temsil eden 150 baz çifti bandı izole etmek zor olduğundan, bu bizim kütüphane, çok dikkatli bir şekilde jel kesmek gerekir yakından göç yan ürünlerin varlığı nedeniyle vardır. O zaman RNA'yı az önce gösterildiği gibi izole edin.Ham sıralı dosya modifikasyonu için, sıralama çalışması sırasında oluşturulan fastq sıralı dosyaları indirin ve gerektiğinde bcl2fastq2 ile preform demultiplexing. Cutodapt kullanarak bağdaştırıcı dizilerini çıkarın ve gösterildiği gibi komutu kullanın. Sıralar okur terminal rasgele nükleotitleri kaldırmak için belirtildiği gibi seqtk kullanın.Daha sonra 10 nükleotitten daha kısa dizileri atmak için awk komutunu belirtildiği gibi kullanın. Kesilmiş sıraları eşlemek için miRBase'i açın ve olgun fa dosyasını indirin. Veritabanındaki çeşitli organizmalardan kaynaklanan tüm mikro RNA'ların tam bir listesini vermek için U kalıntılarını T artıklarıyla değiştirmek için gösterildiği gibi komutu kullanın.İlgi çekici organizmanın mikro RNA dizilerini, belirtildiği gibi komutla seçin ve okumaları bowtie2 kullanarak dosyaya eşleştirin, böylece hiçbir uyumsuzluk yok. Dizileri veritabanına okur hizalamak için aracı kullanın, bir okuma haritaları tamamen veritabanının mikro RNA için gerektiren, belirtildiği gibi herhangi bir uyuşmazlıkları dışarı. Ardından hizalamayan okumaları atmak için komutu kullanın.PcR amplifiye kütüphane artan miktarda yüklendikten sonra bir jel üzerine gösterildiği gibi, beklenen boyuta karşılık gelen ürünler ayıklanabilir. Elüsyondan sonra, saflaştırılmış kütüphane bir kılcal jel elektroforez çip üzerinde kontrol edilebilir. Beklenen 150 baz çifti ürüne ek olarak ve adaptör dimerlerine karşılık gelen 130 baz çifti türünün artan oranı, genellikle artan miktarda PCR ürün yüklendiğinde gözlemlenmektedir.Benzer sonuçlar, sentetik küçük RNA'ların karışımından gelen kütüphaneler kitlerden veya diğer malzemelerden reaktifler kullanılarak hazırlandığında elde edilir. Karşılaştırma için, aynı küçük RNA karışımı için daha önce yayınlanmış sonuçlar gösterilir. Burada, insan değiştirilmemiş ve iki başbakan O-methal modifiye bitki mikro RNA tespiti için standart TS protokolü ile protokol TS5 performansı için bir karşılaştırma gösterilir.İnsan örneklerinde iki prime O-methal modifiye piRNA saptanması da test edildi. Gözlendiği gibi TS5 iki prime O-methal RNA tespiti için TS'den önemli ölçüde daha iyi biçimlendirilmiştir, ancak değiştirilmemiş RNA'lar için değil. Her örnek için farklı tarihlerde çoğaltma kitaplıkları hazırlayın.Genellikle aynı anda yapılan çoğaltmalar arasında çok az varyasyon vardır, ya da farklı tarihlerde hazırlanan kütüphaneler arasında önemli bir varyasyon olabilir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Çift iplikçikli RNA'ların tek iplikçikli RNA'ların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Metabolik etiketleme ve Transfer RNA Macroarrays kullanarak profil oluşturma

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Kromatin döngü yapısı yeniden yapılanma CRISPR-aracılı

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Mitokondrial DNA metilasyonu doğru algılanması için metodoloji

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Özellikle mRNA çeviri geliştirebilirsiniz RNA'ların kodlamayan SINEUP deneyleri bağlı hücre

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

İn vitro ve hücre içi şeklinde küçük molekül araştırmak için kullanarak Pre-mRNA yapısal değişiklikler indüklenen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Gene aktive CRISPR kullanarak uzun kodlamayan RNA'ların overexpressing

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...