Name: improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps
Uploaded: 2019-07-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of

ويشكر المؤلفون جميع أعضاء مختبر آيتو، ولا سيما K Ito وH Sato، ومعهد أينشتاين للخلايا الجذعية على التعليقات ومرافق قياس التدفق الخلوي والتصوير التحليلي (الممولة من المعهد الوطني للسرطان منحة P30 CA013330) ل المساعدة في إجراء التجارب. ويدعم K.I. من قبل المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R01DK98263, R01DK115577, و R01DK100689) ووزارة الصحة في ولاية نيويورك كمدير أساسي لعلم الجينوم أحادي الخلية /Epigenomics (C029154). K.I. Ito هو باحث في جمعية سرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية.

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من كلية ألبرت أينشتاين للطب.
1. إعداد الحلول
<ol><li>تلطيخ العازلة (الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) + 2٪ مصل البقر الجنيني (FBS)): إضافة 10 مل من FBS في 500 مل من محلول PBS معقمة. ملاحظة:</strong...

<ol>
	<li>Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+progenitor+cells:+origins,+phenotypes,+lineage+commitments,+and+transdifferentiations.">Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).</li><li>Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+stem+cell+biology.">Regulatory mechanisms in stem cell biology.</a> Cell. 88 (3), 287-298 (1997).</li><li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li><li>Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell:+keystone+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+and+a+stepping-stone+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine.</a> Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).</li><li>Ito, K., Bonora, M., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+as+master+of+hematopoietic+stem+cell+fate.">Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate.</a> International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+a+purified+Tie2++hematopoietic+stem+cell+population+relies+on+mitochondrial+clearance.">Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance.</a> Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).</li><li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthesis+and+storage.">ATP synthesis and storage.</a> Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).</li><li>Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+catalysis+in+ATP+synthase.">The regulation of catalysis in ATP synthase.</a> Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).</li><li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment.">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li><li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+efflux+studies+suggest+that+hematopoietic+stem+cells+expressing+low+or+undetectable+levels+of+CD34+antigen+exist+in+multiple+species.">Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species.</a> Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).</li><li>Spangrude, G. J., Johnson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+and+activated+subsets+of+mouse+multipotent+hematopoietic+stem+cells.">Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).</li><li>Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABCG2+transporter+is+an+efficient+Hoechst+33342+efflux+pump+and+is+preferentially+expressed+by+immature+human+hematopoietic+progenitors.">The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors.</a> Blood. 99 (2), 507-512 (2002).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+transporter+Bcrp1/ABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype.">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, 13125 (2016).</li><li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress.">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+imaging+of+mitochondrial+structure+and+function+during+acute+kidney+injury.">In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury.</a> Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cyclophilin+with+the+mitochondrial+inner+membrane+and+regulation+of+the+permeability+transition+pore,+and+cyclosporin+A-sensitive+channel.">Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance.">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).</li></ol>

قياس غشاء الميتوكوندريا المحتملة هو حجر الزاوية في تحليل وتقييم الميتوكوندريا، والتي هي حاسمة للحالة الأيضية للخلية. هنا، ونحن نصف بروتوكول لتحليل ΔM من قبل TMRM تلطيخ. TMRM هو صبغة فلورية خلية permeant التي تتراكم في الميتوكوندريا النشطة بسبب ΔM، ومستويات كل منها لا تزال في التوازن بين المقصورات...

الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) هي تجديد ذاتي، متعددة القوة، وقادرة على أن تؤدي إلى جميع خلايا الدم1،2. التمثيل الغذائي الخلوي هو منظم رئيسي لصيانة HSC، جنبا إلىجنب مع العوامل النسخية، والإشارات الجوهرية والبيئة الدقيقة 3،4،5. وبالتالي فإن السيطرة السليمة على وظيفة الميتوكوندريا والجودة أمر بالغ الأهمية لصيانة HSC6،7.
إمكانات غشاء الميتوكوندريا (ΔM) هي معلمة رئيسية في تقييم الميتوكوندريا لأنها تعكس مباشرة وظائفها، والتي تستمد من توازن نشاط ضخ البروتون في سلسلة نقل الإلكترون وتدفق البروتون من خلال F 1/ Fيا ATP synthase. هذه مطلوبة على حد سواء (اعتمادا على التعبير الجيني وتوافر الركيزة) للفسفورية المعتمدة على الأكسجين من ADP إلى ATP8،9. الاستفادة من الإلكترونات من مقصورة الميتوكوندريا، وقد وضعت الأصباغ الفعالة المختلفة لقياس ΔM. واحد منهم هو رباعي ميثيل رودادومين ميثيل استر بيركلورات (TMRM)، والتي استخدمت على نطاق واسع لقياس ΔM عن طريق قياس التدفق في مجموعة متنوعة من الخلايا10، بما في ذلك الجذعية المكونة للدم وخلايا السلف11.
يجب استخدام الأصباغ الميتوكوندريا مع بعض الحذر في HSCs، ومع ذلك، لأن النشاط العالي لمضخات efflux xenobiotic من هذه الخلايا يمكن أن يؤدي إلى النتوء صبغ12. في الواقع، وقد سمح قذف الأصباغ الميتوكوندريا مثل رودامين 123 للباحثين لعزل HSCs13 أو تحديد HSC "السكان الجانب" من خلال استغلال قذف تفاضلي من الأصباغ Hoechst الأزرق وهويشت الأحمر14، 15.وقد تبين أيضا أن Fumitremorgin C، مانع محددة من ATP ملزمة كاسيت الفرعية الأسرة G عضو 2 (ABCG2) الناقل، لا يؤثر على نمط تلطيخ MitoTracker في HSPCs16. بعد نشر هذه النتائج، أجريت دراسات متعددة باستخدام الأصباغ الميتوكوندريا في غياب مثبطات مضخة efflux xenobiotic، مما أدى إلى انطباع واسع النطاق أن HSCs لديها سوى عدد قليل من الميتوكوندريا مع ΔM منخفضة16 , 17 سنة , 18.
في الآونة الأخيرة، ومع ذلك، ثبت أن فيراباميل، وهو مثبط طيف واسع من مضخات efflux، يعدل بشكل كبير نمط تلطيخ صبغ الميتوكوندريا ميتوتراكر الأخضر19. هذا التباين من المرجح أن يرجع إلى حقيقة أن Fumitremorgin C انتقائية للغاية لAbcg2، في حين أن HSCs أيضا التعبير عن ناقلات أخرى مثل Abcb1a (الذي هو حساسة ضعيفة فقط لFumitremorgin C)19. وقد أبلغنا أيضا أن الأصباغ الميتوكوندريا الأخرى، مثل TMRM، نونيل أكريدين البرتقال، وميتوتراكر أورانج (MTO) تظهر نفس أنماط ميتوتراكر الأخضر. والأهم من ذلك، لاحظنا أن أنماط تدفق السيتومتري من HSPCs تعكس ΔM الخاصة بهم بالإضافة إلى كتلة الميتوكوندريا11.
يعتمد تناول صبغTMRM بشكل صارم على الشحنة السلبية من الميتوكوندريا، ولكن تراكم الصبغة الناتج عن ذلك هو في توازن ثابت بين تناولها والتخليص بواسطة مضخات efflux20. الفرق في التعبير مضخة efflux xenobiotic بين HSCs وخلايا ناضجة السكان يؤثر على هذا التوازن ويمكن أن يؤدي إلى نتائج متحيزة. وينبغي النظر في استخدام مثبطات مخصصة مثل فيراباميل في تحليل ΔM بواسطة الأصباغ الجهد. هنا نقوم بوصف بروتوكول معدل لقياس ΔM دقيقة من قبل قياس التدفق القائم على TMRM الذي يصحح لنشاط الناقل xenobiotic من خلال استخدام مثبطات مخصصة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3e-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0031-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD48-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0481-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD135-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1351-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150-PerCP/Cy5.5&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-kit-APC/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporin H</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1575-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr1-biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-5790-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Il7R&#945;-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1271-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nk1.1-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca-1-PE/Cy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF murine</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>250-03-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM medium</td>
			<td>STEMCELL technologies</td>
			<td>9605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Pacific Blue</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5428-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-14-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>V4629-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps

كما التمثيل الغذائي الخلوي هو منظم رئيسي للخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) التجديد الذاتي، وقد درست الأدوار المختلفة التي لعبتها الميتوكوندريا في التوازن المكونة للدم على نطاق واسع من قبل الباحثين HSC. وتنعكس مستويات نشاط الميتوكوندريا في إمكانات الغشاء (ΔM)، والتي يمكن قياسها بالأصباغ الموجبة المفترضة بالخلايا مثل TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). قدرة مضخات efflux لقذف هذه الأصباغ من الخلايا يمكن أن تحد من فائدتها، ومع ذلك. ويتسم تحيز القياس الناتج عن ذلك بأهمية بالغة عند تقييم مركبات HSCs، حيث أن الناقلين الزنيوبيين يظهرون مستويات أعلى من التعبير والنشاط في هذه المراكز مقارنة بالخلايا المتمايزة. هنا، ونحن نصف بروتوكول باستخدام فيراباميل، مثبط مضخة efflux، لقياس بدقة ΔM عبر مجموعات نخاع العظام متعددة. وتبين أن تثبيط نشاط المضخة الناتج عن ذلك يزيد من كثافة TMRM في الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية (HSPCs)، مع تركها دون تغيير نسبي في الكسور الناضجة. وهذا يسلط الضوء على الاهتمام الوثيق بنشاط صبغ efflux المطلوب عند استخدام الأصباغ المعتمدة على ΔM، وكما هو مكتوب وتصور، يمكن استخدام هذا البروتوكول لمقارنة بدقة إما مجموعات مختلفة داخل نخاع العظام، أو نفس السكان عبر نماذج تجريبية مختلفة.

يتيح البروتوكول الموضح أعلاه العزل السهل للمركبات المتعددة الجنسيات من طراز M-MNCs من طراز الماوس. يلخص الشكل 1 الخطوات الرئيسية للبروتوكول: عزل العظام، وطرد نخاع العظام، وملطات خلايا الدم الحمراء، وتلطيخ الأجسام المضادة متبوعاً بتلطيخ TMRM لقياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا ?...

Watch this Scientific Journal Video about Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of 

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

مضخات efflux Xenobiotic نشطة للغاية في الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف (HSPCs) وتسبب قذف TMRM، صبغة الفلورسنت غشاء الميتوكوندريا المحتملة. هنا، نقدم بروتوكول لقياس بدقة إمكانات غشاء الميتوكوندريا في HSPCs من قبل TMRM في وجود فيراباميل، مثبط مضخة efflux.

تحسين دقة التقييم السيتومتري للتدفق لإمكانات الغشاء الميتوكوندريا في الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف من خلال تثبيط مضخات Efflux

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

وظيفة الميتوكوندريا أمر بالغ الأهمية لتجديد الخلايا الجذعية ذاتية الدم. نشاط الميتوكوندريا هو انعكاس لإمكانية غشاء الميتوكوندريا الداخلي ، والذي يمكن قياسه بواسطة TMRM ، وهو صبغة فلورية الخلية ، صبغة صبغة ملونة بالخلايا. مضخات efflux xenobiotic نشطة للغاية في HSC، وتسبب TMRM البثق.الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول، هو تصحيح هذا التأثير، وذلك باستخدام فيراباميل، وهو المانع لمضخات efflux. تبدأ من خلال عزل نخاع العظم من عظم الفخذ الماوس. استخدام زوج من ملقط ومقص حاد لقطع الكفوف الخلفية اثنين.ثم جعل قصاصة صغيرة في الجلد البطني من الماوس، وتمتد عليه. استخراج عظم الفخذ والساق، مع الحرص على عدم طرد رؤساء عظم الفخذ، ووضع العظام في لوحة ستة بئر، مليئة 1.5 ملليلتر من العازلة تلطيخ. إزالة العضلات من العظام، وقطع نهايات العظام، والسماح للنخاع العظمي للخروج.ضع العظام النظيفة في آبار جديدة، مع 1.5 ملليلتر من عازلة تلطيخ. ثم، طرد نخاع العظم مع حقنة ثلاثة ملليلتر وإبرة قياس 25، حتى يصبح العظم أبيض. جمع جميع الخلايا في أنبوب 1.5 ملليلتر، والطرد المركزي لهم لمدة خمس دقائق في 180 مرات G، ثم تجاهل نابيرانت.بعناية resuspend بيليه في 300 ميكرولترات من الجليد الباردة ACK lysing العازلة، ووضع الخلايا على الجليد لمدة دقيقة واحدة. ثم قم بإلغاء تنشيط فوراً عن طريق إضافة ملليلتر واحد من مخزن البقع المؤقت. الطرد المركزي الخلايا لمدة خمس دقائق في 180 مرة G.Resuspend بيليه الخلية، والتي ينبغي أن تظهر بيضاء، في ملليلتر واحد من عازلة تلطيخ.تصفية الخلايا باستخدام غطاء مصفاة الخلية، مع شبكة النايلون 35 ميكرومتر، للحصول على خلايا أحادية النوى. ابدأ بإعداد كوكتيل النسب، والأجسام المضادة المترافقة مع الفلوروهور، وفقًا لاتجاهات المخطوطات. إبقاء الأجسام المضادة على الجليد، ومحمية من الضوء.ثم، الطرد المركزي العينة لمدة خمس دقائق في 180 مرات G، والتخلص من الفائق. إضافة 400 ميكرولتررس من كوكتيل النسب، وأربعة ميكرولترات من الأجسام المضادة CD135 biotinylated إلى بيليه الخلية، ودوامة الخليط. ثم احتضانه على الجليد لمدة 30 دقيقة.بعد الحضانة، وغسل العينة عن طريق إضافة ثلاثة ملليلتر من العازلة تلطيخ، والغزل عليه لمدة خمس دقائق في 180 مرة G، والتخلص من supernatant. ثم إضافة 400 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة، ودوامة الخليط. احتضانه على الجليد لمدة 30 دقيقة أخرى ، وتكرار الغسيل مع عازلة تلطيخ.لإعداد حل تلطيخ TMRM ، أضف 2.2 ميكرولترات من محلول الأسهم TMRM ، و 1.1 ميكرولترات من فيراباميل ، إلى 1.1 ملليلتر من الاستزراع الدموي الخالي من الدم ، مع عامل الجلطات والخلايا الجذعية. إعادة زرع نخاع العظم في ملليلتر واحد من TMRM تلطيخ الحل، دوامة بسرعة، واحتضان لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية. تصفية العينة باستخدام غطاء مصفاة الخلية، مع شبكة النايلون 35 ميكرومتر، لتجنب انسداد جهاز قياس التدفق.ثم إضافة ميكرولتر واحد من DAPI والمضي قدما مع تدفق القياسات. تشغيل عينة نخاع العظام، والحصول على ما لا يقل عن مليون الأحداث. ثم عرض خلايا أحادية النواة نخاع العظم الحية في مؤامرة وزرقاء المحيط الهادئ، لتحديد الكسور السلبية لـ CD135 Lin و Lin-positive.رسم الكسر Lin سالب لـ APC/Cy7 مقابل PE/Cy7 لتحديد الكسر السلف أو MPP متعدد القدرات. ثم رسم جزء MPP لـ APC مقابل PerCP/Cy5.5، لتحديد الخلايا الجذعية الدموية أو كسر HSC. عرض كسر HSC لـ FITC أو CD34، لتقسيمه إلى كسور HSC سالبة CD34 و CD34.وأخيرا الحصول على كثافة TMRM في كل مجموعة من السكان. لضمان أن تلطيخ TMRM يعمل بشكل صحيح، إضافة ميكرولتر واحد من FCCP إلى العينة، لتركيز نهائي من ملليمتر واحد، واحتضانه في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم الحصول على مليون حدث.بعد إضافة FCCP، ينبغي زيادة كثافة TMRM بشكل كبير. وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح لقياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا في مختلف مجموعات الخلايا، مع صبغة TMRM. وقد ثبت أن وجود PBS و FBS في الوسط الثقافة يؤثر على كثافة إشارة TMRM.لذلك من المهم تنفيذ تلطيخ TMRM في وسيط التوسع الخالي من المصل. الخلايا الجذعية الدموية التعبير عن مستويات عالية من النشاط من مضخات efflux xenobiotic أن قذف TMRM صبغ. حتى TMRM أيضا تختلف في وجود فيراباميل أو Cyclosporin H، والتي تمنع المضخات.للتحقق من دقة تلطيخ TMRM، يمكن أن يكون FCCP لإزالة قطب الميتوكوندريا، وتقليل كثافة TMRM. يمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة لدراسة HSC مع صبغة غشاء ميتوكوندريا مختلفة محتملة، بما في ذلك TMRE أو JC-1. فضلا عن الأصباغ الميتوكوندريا الأخرى مثل الميتو تراكر أو ميتو فوكس.وقد أشير إلى القضايا الحرجة التي ورثتها الأنشطة المختلفة لمضخات الـ efflux بين نخاع العظام مؤخراً فقط. لذا فإن هذا البروتوكول يهدف إلى الحد من التناقض بين النتائج السابقة.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

العزلة وتحليل الخلايا الجذعية المكونة للدم من المشيمة

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

تدفق تنقية الخلوي للخلايا الفأر الانتصافي

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral بوساطة خلال ضربة قاضية السابقين فيفو تكون الكريات الحمر في الإنسان خلايا الجذعية المكونة للدم

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

المظهري التحليل وعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم الفئران والأسلاف النسب، الملتزم

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

تحديد العوامل الرئيسية تنظيم-تجديد الذات والتمايز في الخلايا المكونة للدم EML السلائف بواسطة تحليل الحمض النووي الريبي التسلسل

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

قياس وقت واحد من الميتوكوندريا الكالسيوم والميتوكوندريا غشاء المحتملة في الخلايا الحية التي كتبها نيون الميكروسكوب

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

قياس الكتلة المتقدريه والاغشيه المحتملة في الخلايا الجذعية التي تكون الدم وخلايا T بواسطة التدفق الخلوي

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

تقييم الطاقة الحيوية الخلوية في الخلايا الجذعية المكونة للدم للفأر والخلايا السلفية البدائية باستخدام محلل التدفق خارج الخلية

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

التقييم الوظيفي ل Kinesin-7 CENP-E في الخلايا المنوية باستخدام تثبيط الجسم الحي والتألق المناعي وقياس التدفق الخلوي

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...