Name: improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps
Uploaded: 2019-07-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of

Forfatterne takker alle medlemmer af Ito laboratorium, især K Ito og H Sato, og Einstein stamcelle Institute for kommentarer og Einstein flow cytometry og analytiske Imaging Core faciliteter (finansieret af National Cancer Institute Grant P30 CA013330) for hjælpe med at udføre forsøgene. K.I. er støttet af tilskud fra National Institutes of Health (R01DK98263, R01DK115577 og R01DK100689) og New York State Department of Health som Core Director of Einstein enkelt celle Genomics/epigenomics (C029154). K.I. Ito er en forsker i leukæmi og lymfomer samfund.

Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-anvendelse (IACUC) for Albert Einstein College of Medicine.
1. forberedelse af løsninger
<ol><li>Farvnings buffer (fosfat-bufferet saltvand (PBS) + 2% føtal bovint serum (FBS)): Tilsæt 10 mL FB'ER i 500 mL steril PBS-opløsning. Bemærk: Denne opløsning kan opbevares ved 4 °C i mindst en måned i steril tilstand. Før følgende procedurer påbegyndes, sættes en al...

<ol>
	<li>Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+progenitor+cells:+origins,+phenotypes,+lineage+commitments,+and+transdifferentiations.">Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).</li><li>Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+stem+cell+biology.">Regulatory mechanisms in stem cell biology.</a> Cell. 88 (3), 287-298 (1997).</li><li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li><li>Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell:+keystone+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+and+a+stepping-stone+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine.</a> Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).</li><li>Ito, K., Bonora, M., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+as+master+of+hematopoietic+stem+cell+fate.">Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate.</a> International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+a+purified+Tie2++hematopoietic+stem+cell+population+relies+on+mitochondrial+clearance.">Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance.</a> Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).</li><li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthesis+and+storage.">ATP synthesis and storage.</a> Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).</li><li>Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+catalysis+in+ATP+synthase.">The regulation of catalysis in ATP synthase.</a> Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).</li><li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment.">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li><li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+efflux+studies+suggest+that+hematopoietic+stem+cells+expressing+low+or+undetectable+levels+of+CD34+antigen+exist+in+multiple+species.">Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species.</a> Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).</li><li>Spangrude, G. J., Johnson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+and+activated+subsets+of+mouse+multipotent+hematopoietic+stem+cells.">Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).</li><li>Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABCG2+transporter+is+an+efficient+Hoechst+33342+efflux+pump+and+is+preferentially+expressed+by+immature+human+hematopoietic+progenitors.">The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors.</a> Blood. 99 (2), 507-512 (2002).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+transporter+Bcrp1/ABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype.">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, 13125 (2016).</li><li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress.">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+imaging+of+mitochondrial+structure+and+function+during+acute+kidney+injury.">In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury.</a> Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cyclophilin+with+the+mitochondrial+inner+membrane+and+regulation+of+the+permeability+transition+pore,+and+cyclosporin+A-sensitive+channel.">Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance.">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).</li></ol>

Mitokondriel membran potentiel måling er en hjørnesten i analysen og vurderingen af mitokondrier, som er afgørende for den metaboliske tilstand af cellen. Her beskriver vi en protokol til analyse af ΔΨm ved TMRM-farvning. TMRM er en celle-permente fluorescerende farvestof, der ophobes i aktive mitokondrier på grund af ΔΨm, og dens respektive niveauer forbliver i ligevægt mellem de ekstracellulære, cytoplasmiske og mitokondrie rum10. Denne protokol kan tilpasses til forskellige farvestoff...

Hæmatopoietiske stamceller (hscs) er selvfornyende, multi-potent, og i stand til at give anledning til alle cellerne i blodet1,2. Cellulære metabolisme er en central regulator af HSC vedligeholdelse, sammen med transkriptionelle faktorer, iboende signaler og mikromiljø3,4,5. Korrekt kontrol af mitokondrie funktion og kvalitet er derfor afgørende for HSC vedligeholdelse6,7.
Mitokondriel membran potentiale (ΔΨm) er en nøgleparameter i vurderingen af mitokondrier, da det direkte afspejler deres funktionalitet, som stammer fra balancen i protonpumpe aktivitet i elektrontransportkæden og proton strømmen gennem F 1/FO ATP syntase. Disse er begge påkrævet (afhængigt af genekspression og substrat tilgængelighed) for den iltafhængige fosforylering af ADP til ATP8,9. Ved at drage fordel af det mitokondriske rums elektron, er der udviklet forskellige potentiometriske farvestoffer til måling af ΔΨm. En af dem er tetramethylrhodamin methylester perchlorat (TMRM), som er blevet flittigt anvendt til at måle ΔΨm ved flow cytometri i en række celler10, herunder hæmatopoietisk stilk og stamceller11.
Mitokondrie farvestoffer skal anvendes med en vis forsigtighed i hscs, men fordi den høje aktivitet af xenobiotiske effluks pumper af disse celler kan resultere i Dye ekstrudering12. Faktisk har ekstrudering af mitokondrie farvestoffer som Rhodamine 123 gjort det muligt for forskerne at isolere HSCs13 eller identificere HSC "side populationer" ved at udnytte differentialekstrudering af farvestofferne Hoechst Blue og Hoechst Red14, 15. det er også blevet påvist, at Fumitremorgin C, der er en specifik blokker af ATP-bindings kassetten under familie G member 2 (ABCG2), ikke påvirker farvnings mønsteret for MitoTracker i HSPCs16. Efter offentliggørelsen af disse resultater blev der udført flere undersøgelser ved hjælp af mitokondrie farvestoffer i fravær af xenobiotiske effluks-pumpe hæmmere, hvilket førte til det udbredte indtryk, at hscs kun har et lille antal mitokondrier med lav ΔΨm16 , 17 , 18.
For nylig blev det påvist, at verapamil, en bredspektret hæmmer af effluks pumper, væsentligt ændrer farvning mønster af mitokondrie farvestof mitotracker grøn19. Denne afvigelse skyldes sandsynligvis, at Fumitremorgin C er yderst selektiv for Abcg2, mens HSCs også udtrykker andre transportører såsom Abcb1a (som kun er svagt følsom over for Fumitremorgin C)19. Vi har også rapporteret, at andre mitokondrie farvestoffer, såsom tmrm, nonyl acridin orange, og mitotracker orange (MTO) udviser de samme mønstre som mitotracker Green. Endnu vigtigere, vi har observeret, at strømnings cytometriske mønstre af Hspc'er afspejle deres ΔΨm ud over mitokondrie masse11.
Indtagelse af tmrm farvestof strengt afhænger af den negative ladning af mitokondrier, men den resulterende ophobning af farvestof er i konstant balance mellem dets indtag og clearance af effluks pumper20. Forskellen i xenobiotiske effluks pumpe udtryk mellem hscs og modne cellepopulationer påvirker denne balance og kan føre til partiske resultater. Brugen af dedikerede hæmmere såsom verapamil bør overvejes i analysen af ΔΨm af potentiometriske farvestoffer. Her beskriver vi en modificeret protokol for nøjagtig ΔΨm måling af tmrm-baseret flow cytometri, som korrigerer for xenobiotiske transporter aktivitet gennem brug af dedikerede hæmmere.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3e-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0031-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD48-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0481-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD135-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1351-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150-PerCP/Cy5.5&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-kit-APC/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporin H</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1575-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr1-biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-5790-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Il7R&#945;-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1271-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nk1.1-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca-1-PE/Cy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF murine</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>250-03-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM medium</td>
			<td>STEMCELL technologies</td>
			<td>9605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Pacific Blue</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5428-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-14-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>V4629-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps

Da cellulær metabolisme er en central regulator af hæmatopoietisk stamcelle (HSC) selvfornyelse, er de forskellige roller, der spilles af mitokondrierne i hæmatopoietisk homøostase, blevet grundigt undersøgt af HSC-forskere. Mitokondrie aktivitetsniveauer afspejles i deres membran potentialer (ΔΨm), som kan måles ved celle-permente kationiske farvestoffer såsom TMRM (tetramethylrhodamin, methylester). Effluks-pumpernes evne til at ekstrudere disse farvestoffer fra celler kan dog begrænse deres anvendelighed. Den resulterende måle skævhed er særlig kritisk ved vurdering af HSCs, da xenobiotiske transportører udviser højere udtryks-og aktivitetsniveauer i HSCs end i differentierede celler. Her beskriver vi en protokol, der udnytter verapamil, en effluks-pumpe hæmmer, til nøjagtigt at måle ΔΨm på tværs af flere knoglemarvs populationer. Den resulterende hæmning af pumpe aktivitet viser sig at øge TMRM-intensiteten i hæmatopoietisk stamceller og progenitorcellerne (Hspc'er), samtidig med at den forbliver relativt uændret i modne fraktioner. Dette fremhæver den tætte opmærksomhed på Dye-efflux aktivitet, der er nødvendig, når ΔΨm-afhængige farvestoffer anvendes, og som skrevet og visualiseret, denne protokol kan bruges til præcist at sammenligne enten forskellige populationer i knoglemarven, eller den samme population på tværs af forskellige eksperimentelle modeller.

Den ovenfor beskrevne protokol gør det nemt at isolere BM-multinationale selskaber fra en musemodel. Figur 1 opsummerer de vigtigste trin i protokollen: knogle isolation, rødmen ud af knoglemarven, røde blodlegemer og antistof farvning efterfulgt af TMRM-farvning for at måle mitokondriel membranpotentialet i en specifik hæmatopoietisk population .
BM-multinationale selskaber indeholder flere cellepopulationer, herunder HSCs. De antistof-cocktails, der anvende...

Watch this Scientific Journal Video about Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of 

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

Xenobiotiske effluks pumper er meget aktive i hæmatopoietisk stilk og progenitorceller (hspc'er) og forårsage ekstrudering af tmrm, en mitokondriel membran potentielle fluorescerende farvestof. Her præsenterer vi en protokol til præcist at måle mitokondrie membran potentiale i hspcs af tmrm i nærværelse af verapamil, en effluks pumpe hæmmer.

Forbedring af nøjagtigheden af strømnings Cytometrisk vurdering af mitokondriel membran potentiale i hæmatopoietisk stamceller og Progenitorcellerne gennem hæmning af efflux-pumper

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Mitokondriel funktion er afgørende for hæmatopoietiske stamceller selvfornyelse. Mitokondriel aktivitet er en reflektor af den indre mitokondrielle membran potentiale, som kan måles ved TMRM, en celle fluorescerende, celle-permeant kationiske farvestof. Xenobiotiske efflux pumper er meget aktive i HSC, og forårsage TMRM ekstrudering.Den største fordel ved denne protokol, er korrektionen af denne effekt, udnytte Verapamil, en hæmmer af efflux pumper. Begynd med at isolere knoglemarven fra mus lårben. Brug et par vicess og skarpe saks til at skære de to bageste poter.Lav derefter et lille klip i musens ventrale hud, og stræk den. Uddrag lårbenet og skinnebenet, mens du skal passe på ikke at løsne lårbenets hoveder, og læg knoglerne i en seks-brønd plade, fyldt med 1,5 milliliter farvning buffer. Fjern musklerne fra knoglerne, og skær enderne af knoglerne, så knoglemarven at afslutte.Placer de rensede knogler i nye brønde, med 1,5 milliliter farvning buffer. Skyl derefter knoglemarven ud med en tre millilitersprøjte og en 25 gauge nål, indtil knoglen bliver hvid. Indsamle alle celler i en 1,5 milliliter rør, og centrifuge dem i fem minutter ved 180 gange G, derefter kassere supernatant.Forsigtigt resuspend pellet i 300 mikroliter af iskold ACK lysing buffer, og læg cellerne på is i et minut. Derefter straks deaktivere lysis ved at tilføje en milliliter farvning buffer. Centrifuge cellerne i fem minutter ved 180 gange G.Resuspend cellen pellet, som skal vises hvid, i en milliliter farvning buffer.Cellerne filtreres ved hjælp af en cellesierlede hætte med et 35 mikrometer nylonnet for at opnå mononukleare celler. Start med at forberede afstamning cocktail, og fluorophore konjugeret antistoffer, i henhold til manuskript retninger. Hold antistofferne på is og beskyttet mod lys.Derefter centrifuge prøven i fem minutter ved 180 gange G, og kassér supernatant. Tilføj 400 mikroliter af afstamning cocktail, og fire mikroliter af CD135 biotinylerede antistoffer til cellen pellet, og vortex blandingen. Derefter inkuberes det på is i 30 minutter.Efter inkubationen vaskes prøven ved at tilsætte tre milliliter farvningsbuffer, dreje den ned i fem minutter ved 180 gange G og kassere supernatanten. Derefter tilsættes 400 mikroliter af antistofopløsning, og vortex blandingen. Inkuber det på is i yderligere 30 minutter, og gentag vasken med farvning buffer.For at forberede TMRM farvningsopløsningen tilsættes 2,2 mikroliter TMRM-stamopløsning og 1,1 mikroliter Verapamil til 1,1 milliliter serumfri hæmatopoietisk dyrkningsmedium med trombopoietin og stamcellefaktor. Opslæmning knoglemarven igen i en milliliter af TMRM farvningsopløsningen, vortex hurtigt og inkuber i en time ved 37 grader Celsius. Prøven filtreres ved hjælp af en cellesierhætte med et 35 mikrometer nylonnet for at undgå tilstopning af flowcytometeret.Derefter tilsættes en mikroliter af DAPI og fortsætte med flow cytometri. Kør knoglemarvsprøven, og erhverve mindst en million hændelser. Derefter vise levende knoglemarv mononuclear celler i et plot for pacific blå, at identificere CD135 Lin-negative og Lin-positive fraktioner.Den Lin-negative fraktion for APC/Cy7 versus PE/Cy7 afbildes for at identificere den multipotente stamfader eller MPP-fraktion. Derefter afbildes MPP-fraktionen for APC versus PerCP/Cy5.5 for at identificere den hæmatopoietiske stamcelle eller HSC-fraktion. Vis HSC-fraktionen for FITC eller CD34 for at opdele den i CD34 negative HSC- og CD34-positive HSC-brøker.Endelig erhverve TMRM intensitet i hver befolkning. For at sikre, at TMRM-farvningen fungerede korrekt, tilsættes en mikroliter AF FCCP til prøven for en endelig koncentration på en millimolar og inkuberes ved 37 grader Celsius i fem minutter. Derefter erhverve en million begivenheder.Efter FCCP tilføjelse, TMRM intensitet bør øges drastisk. Denne protokol er med succes blevet brugt til at kvantificere mitokondrielle membran potentiale i forskellige cellepopulationer, med TMRM farvestof. Det er blevet påvist, at tilstedeværelsen af PBS og FBS i kulturmediet påvirker TMRM-signalintensiteten.Så det er vigtigt at udføre TMRM farvning i serum-fri ekspansion medium. Hæmatopoietiske stamceller udtrykker høje aktivitetsniveauer af xenobiotiske efflux pumper, der ekstruderer TMRM farvestof. Så TMRM profiler også variere i nærvær af Verapamil eller Cyclosporin H, som blokerer pumperne.For at kontrollere nøjagtigheden af TMRM farvning, kan FCCP være at depolarisere mitokondrier, og reducere TMRM intensitet. Denne protokol kan nemt tilpasses til at studere HSC med et andet mitokondrielt farvestof, herunder TMRE eller JC-1. Samt andre mitokondrielle farvestoffer såsom MitoTracker eller MitoSOX.De kritiske spørgsmål arvet af de forskellige aktivitet af efflux pumper blandt knoglemarvspopulation blev påpeget først for nylig. Så denne protokol har til formål at mindske uoverensstemmelsen mellem tidligere resultater.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fænotypisk analyse og isolering af murine hæmatopoietiske stamceller og Lineage-progenitorer

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og stamcelle i Voksen Mouse calvarie knoglemarv

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Identifikation af Nøglefaktorer Regulering Self-fornyelse og differentiering i EML Hæmatopoietisk precursorceller ved RNA-sekventering Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig måling af Mitokondriel Calcium og mitokondriemembranen Potentiale i levende celler ved Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Måling af mitokondriel masse og membran potentiale i hæmatopoietiske stamceller og T-celler ved flow cytometri

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Vurdering af cellulær bioenergetik i hæmatopoietisk stamme og primitive stamceller ved hjælp af den ekstracellulære fluxanalysator

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Funktionel vurdering af kinesin-7 CENP-E i spermatocytter ved anvendelse af in vivo-hæmning , immunofluorescens og flowcytometri

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...