Name: improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps
Uploaded: 2019-07-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of

Les auteurs remercient tous les membres du laboratoire Ito, en particulier K Ito et H Sato, et l'Einstein Stem Cell Institute pour les commentaires et les installations de base Einstein Flow Cytometry and Analytical Imaging (financé par la subvention P30 CA013330 du National Cancer Institute) pour aider à réaliser les expériences. K.I. est soutenu par des subventions des National Institutes of Health (R01DK98263, R01DK115577, et R01DK100689) et du New York State Department of Health en tant que directeur principal de la génomique monocellulaire/épigénomique d'Einstein (C029154). K.I. Ito est chercheur à la Leukemia and Lymphoma Society.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Albert Einstein College of Medicine.
1. Préparation de solutions
<ol><li>Tampon de coloration (saline tamponnée de phosphate (PBS) - sérum bovin fœtal (FBS) : Ajouter 10 ml de FBS dans 500 ml d'une solution stérile de PBS. REMARQUE: Cette solution peut être stockée à 4 oC pendant au moins un mois dans un état stérile. Avant de...

<ol>
	<li>Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+progenitor+cells:+origins,+phenotypes,+lineage+commitments,+and+transdifferentiations.">Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).</li><li>Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+stem+cell+biology.">Regulatory mechanisms in stem cell biology.</a> Cell. 88 (3), 287-298 (1997).</li><li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li><li>Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell:+keystone+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+and+a+stepping-stone+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine.</a> Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).</li><li>Ito, K., Bonora, M., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+as+master+of+hematopoietic+stem+cell+fate.">Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate.</a> International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+a+purified+Tie2++hematopoietic+stem+cell+population+relies+on+mitochondrial+clearance.">Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance.</a> Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).</li><li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthesis+and+storage.">ATP synthesis and storage.</a> Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).</li><li>Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+catalysis+in+ATP+synthase.">The regulation of catalysis in ATP synthase.</a> Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).</li><li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment.">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li><li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+efflux+studies+suggest+that+hematopoietic+stem+cells+expressing+low+or+undetectable+levels+of+CD34+antigen+exist+in+multiple+species.">Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species.</a> Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).</li><li>Spangrude, G. J., Johnson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+and+activated+subsets+of+mouse+multipotent+hematopoietic+stem+cells.">Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).</li><li>Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABCG2+transporter+is+an+efficient+Hoechst+33342+efflux+pump+and+is+preferentially+expressed+by+immature+human+hematopoietic+progenitors.">The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors.</a> Blood. 99 (2), 507-512 (2002).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+transporter+Bcrp1/ABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype.">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, 13125 (2016).</li><li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress.">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+imaging+of+mitochondrial+structure+and+function+during+acute+kidney+injury.">In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury.</a> Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cyclophilin+with+the+mitochondrial+inner+membrane+and+regulation+of+the+permeability+transition+pore,+and+cyclosporin+A-sensitive+channel.">Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance.">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).</li></ol>

La mesure potentielle de membrane mitochondriale est une pierre angulaire de l'analyse et de l'évaluation des mitochondries, qui sont critiques à l'état métabolique de la cellule. Ici, nous décrivons un protocole pour l'analyse de la coloration de 'm par TMRM. TMRM est un colorant fluorescent à permeant cellulaire qui s'accumule dans les mitochondries actives en raison de l'Am, et ses niveaux respectifs restent en équilibre entre les compartiments extracellulaires, cytoplasmiques et mitochondriaux<sup class="xref"...

Les cellules souches hématopoïétiques (HSC) sont auto-renouvelantes, multipotentes, et capables de donner naissance à toutes les cellules du sang1,2. Le métabolisme cellulaire est un régulateur clé de la maintenance HSC, avec des facteurs transcriptionnels, des signaux intrinsèques et le microenvironnement3,4,5. Le contrôle approprié de la fonction et de la qualité mitochondriales est donc essentiel à l'entretien de HSC6,7.
Le potentiel de la membrane mitochondriale est un paramètre clé dans l'évaluation des mitochondries car il reflète directement leur fonctionnalité, qui découle de l'équilibre de l'activité de pompage des protons dans la chaîne de transport d'électrons et du flux de protons à travers F 1/FO ATP synthase. Ceux-ci sont tous deux nécessaires (selon l'expression des gènes et la disponibilité du substrat) pour la phosphorylation dépendante de l'oxygène d'ADP à L'ATP8,9. Profitant de l'électronégativité du compartiment mitochondrial, divers colorants potentialométriques ont été développés pour mesurer l'amon. L'un d'eux est la tétramethylrhodamine méthylester perchlorate (TMRM), qui a été largement utilisé pour mesurer la cytométrie de flux dans une variété de cellules10, y compris les cellules hématopoïétiques tige et progénitrice11.
Les colorants mitochondriaux doivent être utilisés avec une certaine prudence dans les HSC, cependant, parce que la forte activité des pompes à efflux xénobiotiques de ces cellules peut entraîner l'extrusion de colorant12. En effet, l'extrusion de colorants mitochondriaux tels que Rhodamine 123 a permis aux chercheurs d'isoler les HSC13 ou d'identifier les « populations secondaires » du HSC en exploitant l'extrusion différentielle des teintures Hoechst Blue et Hoechst Red14, 15. Il a également été démontré que fumitremorgin E, un bloqueur spécifique du transporteur de la sous-famille G (ABCG2) de la cassette liant l'ATP, n'affecte pas le modèle de coloration de MitoTracker dans les HSPC16. Après la publication de ces résultats, de multiples études ont été réalisées à l'aide de colorants mitochondriaux en l'absence d'inhibiteurs de la pompe à efflux xénobiotiques, ce qui a donné l'impression répandue que les HSC n'ont qu'un petit nombre de mitochondries à faible niveau16. , 17 Annonces , 18.
Récemment, il a été démontré, cependant, que Verapamil, un inhibiteur à large spectre des pompes d'efflux, modifie de manière significative le modèle de coloration du colorant mitochondrial MitoTracker Vert19. Cet écart est probablement dû au fait que fumitremorgin E est très sélectif pour Abcg2, tandis que les HSC expriment également d'autres transporteurs tels que Abcb1a (qui n'est que faiblement sensible à Fumitremorgin C)19. Nous avons également signalé que d'autres colorants mitochondriaux, tels que TMRM, Nonyl acridine orange, et Mitotracker Orange (MTO) présentent les mêmes modèles que Mitotracker Green. Plus important encore, nous avons observé que les modèles cytométriques de flux des HSPC reflètent leur 'm en plus de la masse mitochondriale11.
La prise de colorant TMRM dépend strictement de la charge négative des mitochondries, mais l'accumulation résultante de colorant est en équilibre constant entre sa prise et le dégagement par des pompes d'efflux20. La différence dans l'expression de pompe d'efflux xénobiotique entre HSCs et populations matures de cellules affecte cet équilibre et peut mener aux résultats biaisés. L'utilisation d'inhibiteurs dédiés tels que Verapamil devrait être prise en compte dans l'analyse de l''amon par les colorants potentialométriques. Ici, nous décrivons un protocole modifié pour la mesure précise de l'écoulement par TMRM qui corrige l'activité du transporteur xénobiotique grâce à l'utilisation d'inhibiteurs dédiés.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3e-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0031-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD48-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0481-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD135-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1351-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150-PerCP/Cy5.5&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-kit-APC/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporin H</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1575-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr1-biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-5790-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Il7R&#945;-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1271-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nk1.1-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca-1-PE/Cy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF murine</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>250-03-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM medium</td>
			<td>STEMCELL technologies</td>
			<td>9605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Pacific Blue</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5428-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-14-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>V4629-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps

Comme le métabolisme cellulaire est un régulateur clé de l'auto-renouvellement des cellules souches hématopoïétiques (HSC), les divers rôles joués par les mitochondries dans l'homéostasie hématopoïétique ont été largement étudiés par les chercheurs de HSC. Les niveaux d'activité mitochondriale sont reflétés dans leurs potentiels membranaires, qui peuvent être mesurés par des colorants cationic à perméatifs tels que TMRM (tetramethylrhodamine, ester méthyle). La capacité des pompes d'efflux pour extruder ces colorants des cellules peut limiter leur utilité, cependant. Le biais de mesure qui en résulte est particulièrement critique lors de l'évaluation des HSC, car les transporteurs xénobiotiques présentent des niveaux d'expression et d'activité plus élevés dans les HSC que dans les cellules différenciées. Ici, nous décrivons un protocole utilisant Verapamil, un inhibiteur de pompe d'efflux, pour mesurer avec précision le m à travers les populations multiples de moelle. L'inhibition résultante de l'activité de pompe est montrée pour augmenter l'intensité de TMRM dans les cellules hématopoïétiques de tige et d'ancêtre (HSPc), tout en la laissant relativement inchangée dans les fractions mûres. Cela met en évidence l'attention particulière à l'activité de teinture-efflux qui est nécessaire lorsque les colorants dépendants de l'état d'œil sont utilisés, et comme écrit et visualisé, ce protocole peut être utilisé pour comparer avec précision soit différentes populations au sein de la moelle osseuse, ou la même population différents modèles expérimentaux.

Le protocole décrit ci-dessus permet l'isolement facile des BM-MNC à partir d'un modèle de souris. La figure 1 résume les principales étapes du protocole : isolement osseux, chasse d'eau de la moelle osseuse, lyse des globules rouges et coloration des anticorps, suivie d'une coloration TMRM pour mesurer le potentiel de la membrane mitochondriale dans une population hématopoïétique spécifique. .
Les BM-MNC contiennent plusieurs populations cellulaires, y c...

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Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

Les pompes à efflux xénobiotiques sont très actives dans les cellules hématopoïétiques des tiges et des progéniteurs (HSPC) et provoquent l'extrusion de TMRM, un colorant fluorescent potentiel de membrane mitochondriale. Ici, nous présentons un protocole pour mesurer avec précision le potentiel de membrane mitochondriale dans HSPCs par TMRM en présence de Verapamil, un inhibiteur de pompe d'efflux.

Améliorer la précision de l'évaluation cytométrique du débit du potentiel de membrane mitochondriale dans les cellules hématopoïétiques de tige et d'ancêtre grâce à l'inhibition des pompes d'Efflux

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

La fonction mitochondrique est critique pour l’auto-renouvellement hématopoïétique de cellules souches. L’activité mitochondriale est un réflecteur du potentiel de membrane mitochondrique interne, qui peut être mesuré par TMRM, un colorant cationique fluorescent et perméant de cellules. Les pompes d’efflux xénobiotiques sont très actives dans HSC, et causent l’extrusion de TMRM.Le principal avantage de ce protocole, est la correction de cet effet, en utilisant Verapamil, un inhibiteur des pompes efflux. Commencez par isoler la moelle osseuse des fémurs de souris. Utilisez une paire de forceps et de ciseaux pointus pour couper les deux pattes postérieures.Ensuite, faire un petit snip dans la peau ventrale de la souris, et l’étirer. Extraire le fémur et le tibia, tout en prenant soin de ne pas déloger les têtes du fémur, et placer les os dans une plaque de six puits, rempli de 1,5 millilitres de tampon de coloration. Retirez les muscles des os et coupez les extrémités des os, ce qui permet à la moelle osseuse de sortir.Placez les os nettoyés dans de nouveaux puits, avec 1,5 millilitres de tampon de coloration. Ensuite, rincer la moelle osseuse avec une seringue de trois millilitres et une aiguille de calibre 25, jusqu’à ce que l’os devienne blanc. Recueillir toutes les cellules dans un tube de 1,5 millilitre, et les centrifuger pendant cinq minutes à 180 fois G, puis jeter le supernatant.Resuspendez soigneusement la pastille dans 300 microlitres de tampon de lysing ACK froid de glace, et mettez les cellules sur la glace pendant une minute. Ensuite, désactivez immédiatement la lyse en ajoutant un millilitre de tampon de coloration. Centrifuger les cellules pendant cinq minutes à 180 fois G.Resuspendre la pastille cellulaire, qui devrait apparaître blanc, dans un millilitre de tampon de coloration.Filtrer les cellules à l’aide d’un bouchon de passoire cellulaire, avec un maillage en nylon de 35 micromètres, pour obtenir des cellules mononucléaires. Commencez par préparer le cocktail de lignée, et fluorophore anticorps conjugués, selon les instructions manuscrites. Gardez les anticorps sur la glace et protégez-les de la lumière.Ensuite, centrifuger l’échantillon pendant cinq minutes à 180 fois G, et jeter le supernatant. Ajouter 400 microlitres du cocktail de lignée, et quatre microlitres d’anticorps biotinylés CD135 à la pastille cellulaire, et vortex le mélange. Ensuite, incubez-le sur la glace pendant 30 minutes.Après l’incubation, laver l’échantillon en ajoutant trois millilitres de tampon de coloration, en le faisant tourner pendant cinq minutes à 180 fois G et en jetant le supernatant. Ajouter ensuite 400 microlitres de solution d’anticorps et vortexer le mélange. Incubez-le sur la glace pendant encore 30 minutes, et répétez le lavage avec le tampon de coloration.Pour préparer la solution de coloration TMRM, ajouter 2,2 microlitres de solution de stock TMRM, et 1,1 microlitres de Verapamil, à 1,1 millilitres de milieu de culture hématopoïétique sans sérum, avec thrombopoïétine et facteur de cellules souches. Resuspendez la moelle osseuse en un millilitre de la solution de coloration TMRM, vortex rapidement, et incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius. Filtrer l’échantillon à l’aide d’un bouchon de passoire cellulaire, avec un maillage en nylon de 35 micromètres, pour éviter d’obstruer le cytomètre d’écoulement.Ajoutez ensuite un microlitre de DAPI et procédez à la cytométrie d’écoulement. Exécutez l’échantillon de moelle osseuse et acquérez au moins un million d’événements. Ensuite, affichez les cellules mononucléaires de moelle osseuse vivantes dans une parcelle de bleu pacifique, pour identifier les fractions cd135 Lin-négatives et lin-positives.Tracez la fraction lin-négative pour APC/Cy7 contre PE/Cy7 pour identifier l’ancêtre multipotent ou la fraction de MPP. Ensuite, tracez la fraction MPP pour APC contre PerCP/Cy5.5, pour identifier la cellule souche hématopoïétique ou la fraction HSC. Affichez la fraction HSC pour fitc, ou CD34, pour la diviser en fractions HSC négatives CD34 et CD34 positives HSC.Enfin acquérir l’intensité TMRM dans chaque population. Pour s’assurer que la coloration tmrm a fonctionné correctement, ajouter un microlitre de FCCP à l’échantillon, pour une concentration finale d’un millimolaire, et l’incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Puis acquérir un million d’événements.Après l’ajout de FCCP, l’intensité de TMRM devrait être considérablement augmentée. Ce protocole a été utilisé avec succès pour quantifier le potentiel memitochondrial de membrane dans diverses populations cellulaires, avec le colorant de TMRM. Il a été démontré que la présence de PBS et de FBS dans le milieu de culture affecte l’intensité du signal TMRM.Il est donc important d’effectuer la coloration TMRM dans le milieu d’expansion sans sérum. Les cellules souches hématopoïétiques expriment des niveaux d’activité élevés de pompes à efflux xénobiotiques qui extruder le colorant TMRM. Ainsi, les profils TMRM varient également en présence de Verapamil ou Cyclosporin H, qui bloquent les pompes.Pour vérifier l’exactitude de la coloration TMRM, FCCP peut être de dépolariser les mitochondries, et de réduire l’intensité TMRM. Ce protocole peut être facilement adapté pour étudier HSC avec un colorant potentiel de membrane mitochondrique différent, y compris TMRE ou JC-1. Ainsi que d’autres dyes mitochondriques tels que MitoTracker ou MitoSOX.Les questions critiques héritées par l’activité différente des pompes d’efflux parmi la population de moelle ont été soulignées seulement récemment. Ce protocole vise donc à réduire l’écart entre les résultats antérieurs.

Research

JoVE Journal

Biology

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The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

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