Name: improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps
Uploaded: 2019-07-30T15:00:00
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Die Autoren danken allen Mitgliedern des Ito-Labors, insbesondere K Ito und H Sato, und dem Einstein Stem Cell Institute für Kommentare und den Kerneinrichtungen Einstein Flow Cytometry and Analytical Imaging (gefördert vom National Cancer Institute Grant P30 CA013330) für Hilfe bei der Durchführung der Experimente. K.I. wird von den National Institutes of Health (R01DK98263, R01DK115577 und R01DK100689) und dem New York State Department of Health als Core Director of Einstein Single-Cell Genomics/Epigenomics (C029154) unterstützt. K.I. Ito ist Forschungsstipendiat der Leukämie- und Lymphom-Gesellschaft.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Albert Einstein College of Medicine genehmigt.
1. Vorbereitung von Lösungen
<ol><li>Färbepuffer (phosphatgepufferte Saline (PBS) + 2% fetales Rinderserum (FBS)): Fügen Sie 10 ml FBS in 500 ml einer sterilen PBS-Lösung hinzu. HINWEIS: Diese Lösung kann bei 4 °C für mindestens einen Monat in sterilem Zustand gelagert werden. Bevor Sie mit den folgenden Verfahren beginn...

<ol>
	<li>Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+progenitor+cells:+origins,+phenotypes,+lineage+commitments,+and+transdifferentiations.">Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).</li><li>Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+stem+cell+biology.">Regulatory mechanisms in stem cell biology.</a> Cell. 88 (3), 287-298 (1997).</li><li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+efflux+studies+suggest+that+hematopoietic+stem+cells+expressing+low+or+undetectable+levels+of+CD34+antigen+exist+in+multiple+species.">Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species.</a> Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).</li><li>Spangrude, G. J., Johnson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+and+activated+subsets+of+mouse+multipotent+hematopoietic+stem+cells.">Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).</li><li>Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABCG2+transporter+is+an+efficient+Hoechst+33342+efflux+pump+and+is+preferentially+expressed+by+immature+human+hematopoietic+progenitors.">The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors.</a> Blood. 99 (2), 507-512 (2002).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+transporter+Bcrp1/ABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype.">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, 13125 (2016).</li><li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress.">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+imaging+of+mitochondrial+structure+and+function+during+acute+kidney+injury.">In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury.</a> Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cyclophilin+with+the+mitochondrial+inner+membrane+and+regulation+of+the+permeability+transition+pore,+and+cyclosporin+A-sensitive+channel.">Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance.">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).</li></ol>

Die mitochondriale Membranpotentialmessung ist ein Eckpfeiler der Analyse und Bewertung von Mitochondrien, die für den Stoffwechselzustand der Zelle entscheidend sind. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Analyse von M durch TMRM-Färbung. TMRM ist ein zellpermeant Fluoreszenzfarbstoff, der sich in aktiven Mitochondrien aufgrund von m ansammelt, und seine jeweiligen Werte bleiben im Gleichgewicht zwischen den extrazellulären, zytoplasmatischen und mitochondrialen Kompartimenten10. Dieses Proto...

Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) sind sich selbst erneuernd, multipotent und in der Lage, alle Zellen des Blutes1,2zu entsteht. Der Zellstoffwechsel ist ein wichtiger Regulator der HSC-Wartung, zusammen mit Transkriptionsfaktoren, intrinsischen Signalen und der Mikroumgebung3,4,5. Die richtige Kontrolle der mitochondrialen Funktion und Qualität ist daher entscheidend für die HSC-Wartung6,7.
Mitochondriales Membranpotential ist ein wichtiger Parameter bei der Beurteilung von Mitochondrien, da sie direkt ihre Funktionalität widerspiegelt, die sich aus dem Gleichgewicht der Protonenpumpaktivität in der Elektronentransportkette und des Protonenflusses durch F ergibt. 1/FO ATP-Synthase. Diese sind beide (abhängig von der Genexpression und substratverfügbarkeit) für die sauerstoffabhängige Phosphorylierung von ADP zu ATP8,9erforderlich. Unter Ausnutzung der Elektronegativität des mitochondrialen Fachs wurden verschiedene potentiometrische Farbstoffe entwickelt, um die Messung von m zu messen. Eines davon ist Tetramethylrhodinmethylesterperchlorat (TMRM), das ausgiebig verwendet wurde, um die Durchflusszytometrie in einer Vielzahl von Zellen10zu messen, einschließlich hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen11.
Mitochondriale Farbstoffe müssen jedoch mit einer gewissen Vorsicht in HSCs verwendet werden, da die hohe Aktivität der xenobiotischen Efflux-Pumpen dieser Zellen zu Farbstoffextrusion führen kann12. Tatsächlich hat die Extrusion von mitochondrialen Farbstoffen wie Rhodamine 123 es Forschern ermöglicht, HSCs13 zu isolieren oder HSC-"Seitenpopulationen" zu identifizieren, indem sie die Differentialextrusion der Farbstoffe Hoechst Blue und Hoechst Red14 ausnutzen. 15. Es hat sich auch gezeigt, dass Fumitremorgin C, ein spezifischer Blocker des ATP-bindenden Kassetten-Unterfamilien-Unterfamilien-G-Mitglieds-2 (ABCG2)-Transporters, das Färbemuster von MitoTracker in HSPCs16nicht beeinflusst. Nach der Veröffentlichung dieser Ergebnisse wurden mehrere Studien mit mitochondrialen Farbstoffen in Abwesenheit von xenobiotischen Efflux-Pumpeninhibitoren durchgeführt, was zu dem weit verbreiteten Eindruck führte, dass HSCs nur eine geringe Anzahl von Mitochondrien mit niedrigem , 17 , 18.
Kürzlich wurde jedoch nachgewiesen, dass Verapamil, ein Breitspektrum-Inhibitor von Efflux-Pumpen, das Färbemuster des mitochondrialen Farbstoffs MitoTracker Green19signifikant verändert. Diese Diskrepanz ist wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass Fumitremorgin C sehr selektiv für Abcg2 ist, während HSCs auch andere Transporter wie Abcb1a (das nur schwach empfindlich auf Fumitremorgin C)19ausdrückt. Wir haben auch berichtet, dass andere mitochondriale Farbstoffe, wie TMRM, Nonyl-Akridin-Orange und Mitotracker Orange (MTO) die gleichen Muster wie Mitotracker Green aufweisen. Noch wichtiger ist, dass wir beobachtet haben, dass die zytometrischen Strömungsmuster von HSPCs zusätzlich zu der mitochondrialen Masse11ihre M widerspiegeln.
Die Aufnahme von TMRM-Farbstoff hängt streng von der negativen Ladung von Mitochondrien ab, aber die resultierende Ansammlung von Farbstoff ist in einem konstanten Gleichgewicht zwischen seiner Aufnahme und Clearance durch Effluxpumpen20. Der Unterschied in der xenobiotischen Efflux-Pumpenexpression zwischen HSCs und reifen Zellpopulationen wirkt sich auf dieses Gleichgewicht aus und kann zu verzerrten Ergebnissen führen. Die Verwendung von speziellen Inhibitoren wie Verapamil sollte bei der Analyse von 'm durch potentiometrische Farbstoffe berücksichtigt werden. Hier beschreiben wir ein modifiziertes Protokoll zur genauen Messung durch TMRM-basierte Durchflusszytometrie, das die xenobiotische Transportaktivität durch den Einsatz spezieller Inhibitoren korrigiert.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3e-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0031-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD48-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0481-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD135-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1351-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150-PerCP/Cy5.5&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-kit-APC/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporin H</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1575-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr1-biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-5790-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Il7R&#945;-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1271-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nk1.1-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca-1-PE/Cy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF murine</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>250-03-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM medium</td>
			<td>STEMCELL technologies</td>
			<td>9605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Pacific Blue</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5428-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-14-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>V4629-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps

Da der Zellstoffwechsel ein wichtiger Regulator der hämatopoetischen Stammzell-Selbsterneuerung (HSC) ist, wurden die verschiedenen Rollen, die die Mitochondrien bei der hämatopoetischen Homöostase spielen, von HSC-Forschern ausgiebig untersucht. Die mitochondrialen Aktivitätsniveaus spiegeln sich in ihren Membranpotentialen wider, die durch zellpermeant kationische Farbstoffe wie TMRM (Tetramethylrhodamin, Methylester) gemessen werden können. Die Fähigkeit von Effluxpumpen, diese Farbstoffe aus Zellen zu extrudieren, kann jedoch ihre Nützlichkeit einschränken. Die resultierende Messverzerrung ist besonders kritisch bei der Beurteilung von HSCs, da xenobiotische Transporter in HSCs eine höhere Expression und Aktivität aufweisen als in differenzierten Zellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das Verapamil, einen Efflux-Pumpeninhibitor, verwendet, um mehrere Knochenmarkpopulationen genau zu messen. Die daraus resultierende Hemmung der Pumpenaktivität erhöht nachweislich die TMRM-Intensität in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs), während sie in reifen Fraktionen relativ unverändert bleibt. Dies unterstreicht die Aufmerksamkeit auf die Farb-Efflux-Aktivität, die erforderlich ist, wenn m-abhängige Farbstoffe verwendet werden, und wie geschrieben und visualisiert, kann dieses Protokoll verwendet werden, um entweder verschiedene Populationen innerhalb des Knochenmarks oder die gleiche Population genau zu vergleichen. über verschiedene experimentelle Modelle hinweg.

Das oben beschriebene Protokoll ermöglicht die einfache Isolierung von BM-MNCs von einem Mausmodell. Abbildung 1 fasst die wichtigsten Schritte des Protokolls zusammen: Knochenisolierung, Ausspülen aus dem Knochenmark, Rote Blutzelllyse und Antikörperfärbung gefolgt von TMRM-Färbung zur Messung des mitochondrialen Membranpotenzials in einer bestimmten hämatopoetischen Population .
BM-MNCs enthalten mehrere Zellpopulationen, einschließlich HSCs. Die in diese...

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Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

Xenobiotische Efflux-Pumpen sind hochaktiv in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und verursachen die Extrusion von TMRM, einem mitochondrialen Membranpotenzial fluoreszierender Farbstoff. Hier stellen wir ein Protokoll zur genauen Messung des mitochondrialen Membranpotenzials in HSPCs durch TMRM in Gegenwart von Verapamil, einem Efflux-Pumpeninhibitor, vor.

Verbesserung der Genauigkeit der zytometrischen Bewertung des mitochondrialen Membranpotenzials in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch die Hemmung von Efflux-Pumpen

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Die mitochondriale Funktion ist entscheidend für die hämatopoetische Stammzell-Selbsterneuerung. Mitochondrienaktivität ist ein Reflektor des inneren mitochondrialen Membranpotentials, das mit TMRM, einem zellfluoreszierenden, zellpermeant kationischen Farbstoff, gemessen werden kann. Xenobiotische Efflux-Pumpen sind in HSC sehr aktiv und verursachen TMRM-Extrusion.Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist die Korrektur dieses Effekts, wobei Verapamil, ein Inhibitor der Effluxpumpen, verwendet wird. Beginnen Sie mit der Isolierung des Knochenmarks von Denfemuren der Maus. Verwenden Sie ein Paar Zangen und scharfe Schere, um die beiden hinteren Pfoten zu schneiden.Dann machen Sie einen kleinen Schnipsel in der ventralen Haut der Maus, und dehnen Sie es. Extrahieren Sie den Oberschenkelknochen und die Tibia, wobei Sie darauf achten, die Köpfe des Oberschenkelknochens nicht zu lösen, und legen Sie die Knochen in eine Sechs-Brunnen-Platte, gefüllt mit 1,5 Milliliter Färbepuffer. Entfernen Sie die Muskeln aus den Knochen, und schneiden Sie die Enden der Knochen, so dass Knochenmark zu verlassen.Legen Sie die gereinigten Knochen in neue Brunnen, mit 1,5 Milliliter Nstrich. Dann spülen Sie das Knochenmark mit einer Drei-Milliliter-Spritze und einer 25-Meter-Nadel aus, bis der Knochen weiß wird. Sammeln Sie alle Zellen in einem 1,5 Milliliter-Rohr, und zentrifugieren Sie sie für fünf Minuten bei 180 mal G, dann entsorgen Sie den Überstand.Das Pellet vorsichtig in 300 Mikrolitere eiskaltem ACK-Lysing-Puffer aussetzen und die Zellen für eine Minute auf Eis legen. Deaktivieren Sie dann sofort die Lyse, indem Sie einen Milliliter Färbepuffer hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Zellen für fünf Minuten bei 180-fachg. G.Resuspend das Zellpellet, das weiß erscheinen sollte, in einem Milliliter Färbepuffer.Filtern Sie die Zellen mit einer Zellsiebkappe mit einem 35 Mikrometer Nylongewebe, um mononukleäre Zellen zu erhalten. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Linie Cocktail, und Fluorophor konjugierte Antikörper, nach Manuskript Richtungen. Bewahren Sie die Antikörper auf Eis auf und schützen Sie sie vor Licht.Zentrifugieren Sie die Probe dann fünf Minuten lang bei 180 mal G und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie 400 Mikroliter des Lineage-Cocktails und vier Mikroliter CD135-Biotinyl-Antikörper in das Zellpellet und wirbeln Sie die Mischung aus. Dann inkubieren Sie es auf Eis für 30 Minuten.Waschen Sie die Probe nach der Inkubation, indem Sie drei Milliliter Färbepuffer hinzufügen, sie fünf Minuten bei 180 mal G nach unten drehen und den Überstand entsorgen. Dann 400 Mikroliter Antikörperlösung hinzufügen und die Mischung wirbeln. Bebrüte es noch 30 Minuten auf Eis und die Wäsche mit dem Färbepuffer wiederholen.Um die TMRM-Färbelösung vorzubereiten, fügen Sie 2,2 Mikroliter TMRM-Stammlösung und 1,1 Mikroliter Verapamil zu 1,1 Milliliter serumfreies hämatopoetisches Kulturmedium mit Thrombopoietin und Stammzellfaktor hinzu. Setzen Sie das Knochenmark in einem Milliliter der TMRM-Färbelösung wieder auf, wirbeln Sie schnell aus und brüten Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Filtern Sie die Probe mit einer Zellsiebkappe mit einem 35 Mikrometer Nylongewebe, um eine Verstopfung des Durchflusszytometers zu vermeiden.Fügen Sie dann einen Mikroliter DAPI hinzu und fahren Sie mit der Durchflusszytometrie fort. Führen Sie die Knochenmarkprobe aus, und erfassen Sie mindestens eine Million Ereignisse. Zeigen Sie dann die lebenden Knochenmark-Mononuklezellen in einem Diagramm für pazifisches Blau an, um CD135 Lin-negative und Lin-positive Fraktionen zu identifizieren.Plotten Sie die Lin-negative Fraktion für APC/Cy7 im Vergleich zu PE/Cy7, um den multipotenten Vorläufer oder mPP-Anteil zu identifizieren. Zeichnen Sie dann die MPP-Fraktion für APC versus PerCP/Cy5.5, um die hämatopoetische Stammzelle oder HSC-Fraktion zu identifizieren. Zeigen Sie den HSC-Anteil für FITC oder CD34 an, um ihn in CD34-negative HSC- und CD34-positive HSC-Fraktionen aufzuteilen.Schließlich erwerben Sie die TMRM-Intensität in jeder Population. Um sicherzustellen, dass die TMRM-Färbung korrekt funktioniert, fügen Sie der Probe einen Mikroliter FCCP für eine Endkonzentration von einem Millimolar hinzu und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Dann erwerben Sie eine Million Ereignisse.Nach der FCCP-Zugabe sollte die TMRM-Intensität drastisch erhöht werden. Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um das mitochondriale Membranpotenzial in verschiedenen Zellpopulationen mit TMRM-Farbstoff zu quantifizieren. Es wurde gezeigt, dass das Vorhandensein von PBS und FBS im Kulturmedium die TMRM-Signalintensität beeinflusst.Daher ist es wichtig, TMRM Färbung in serumfreien Expansionsmedium durchzuführen. Hämatopoetische Stammzellen drücken hohe Aktivitätsniveaus von xenobiotischen Effluxpumpen aus, die TMRM-Farbstoff extrudieren. So variieren TMRM Profile auch in Gegenwart von Verapamil oder Cyclosporin H, die die Pumpen blockieren.Um die Genauigkeit der TMRM-Färbung zu überprüfen, kann FCCP die Mitochondrien depolarisieren und die TMRM-Intensität reduzieren. Dieses Protokoll kann leicht für das Studium von HSC mit einem anderen mitochondrialen Membranpotentialfarbstoff, einschließlich TMRE oder JC-1, angepasst werden. Ebenso wie andere mitochondriale Farbstoffe wie MitoTracker oder MitoSOX.Die kritischen Probleme, die durch die unterschiedliche Aktivität von Efflux-Pumpen unter der Knochenmarkpopulation geerbt wurden, wurden erst vor kurzem aufgezeigt. Dieses Protokoll zielt daher darauf ab, die Diskrepanz zwischen früheren Erkenntnissen zu verringern.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Isolierung und Analyse von hämatopoetischen Stammzellen aus der Plazenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Forschung

Biologie

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Identifizierung von Schlüsselfaktoren Regelselbsterneuerung und Differenzierung in EML hämatopoetischen Vorläuferzellen durch RNA-Sequenzierungsanalyse

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Messung des mitochondrialen Masse- und Membranpotenzials in hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen durch Durchflusszytometrie

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Bewertung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Funktionelle Bewertung von Kinesin-7 CENP-E in Spermatozyten mittels In-vivo-Inhibition , Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...