Name: improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps
Uploaded: 2019-07-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of

המחברים מודים לכל חברי המעבדה איטו, במיוחד K Ito ו-H סאטו, ו איינשטיין תא גזע המכון להערות הארגון איינשטיין Cy, הדמיה אנליטית מתקנים ליבה (ממומן על ידי המכון הלאומי לסרטן גרנט P30 CA013330) עבור סייע בביצוע הניסויים. K.I. נתמך על ידי מענקים מן המכון הלאומי לבריאות (R01DK98263, R01DK115577, ו R01DK100689) ואת משרד ניו יורק המדינה לבריאות כמו מנהל ליבה של איינשטיין תא בודד גנומיקה/אפיגנומיקה (C029154). K.I. Ito הוא מלומד מחקר של החברה לוקמיה ולימפומה.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של מכללת אלברט איינשטיין לרפואה.
1. הכנת פתרונות
<ol><li>צביעת מאגר (מלוחים באגירה פוספט (PBS) + 2% סרום של שור עוברי (FBS)): להוסיף 10 מ ל של FBS 500 mL של פתרון PBS סטרילי. הערה: ניתן לאחסן פתרון זה ב -4 ° c למשך ...

<ol>
	<li>Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+progenitor+cells:+origins,+phenotypes,+lineage+commitments,+and+transdifferentiations.">Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).</li><li>Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+stem+cell+biology.">Regulatory mechanisms in stem cell biology.</a> Cell. 88 (3), 287-298 (1997).</li><li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li><li>Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell:+keystone+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+and+a+stepping-stone+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine.</a> Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).</li><li>Ito, K., Bonora, M., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+as+master+of+hematopoietic+stem+cell+fate.">Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate.</a> International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+a+purified+Tie2++hematopoietic+stem+cell+population+relies+on+mitochondrial+clearance.">Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance.</a> Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).</li><li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthesis+and+storage.">ATP synthesis and storage.</a> Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).</li><li>Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+catalysis+in+ATP+synthase.">The regulation of catalysis in ATP synthase.</a> Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).</li><li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment.">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li><li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+efflux+studies+suggest+that+hematopoietic+stem+cells+expressing+low+or+undetectable+levels+of+CD34+antigen+exist+in+multiple+species.">Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species.</a> Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).</li><li>Spangrude, G. J., Johnson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+and+activated+subsets+of+mouse+multipotent+hematopoietic+stem+cells.">Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).</li><li>Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABCG2+transporter+is+an+efficient+Hoechst+33342+efflux+pump+and+is+preferentially+expressed+by+immature+human+hematopoietic+progenitors.">The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors.</a> Blood. 99 (2), 507-512 (2002).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+transporter+Bcrp1/ABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype.">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, 13125 (2016).</li><li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress.">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+imaging+of+mitochondrial+structure+and+function+during+acute+kidney+injury.">In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury.</a> Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cyclophilin+with+the+mitochondrial+inner+membrane+and+regulation+of+the+permeability+transition+pore,+and+cyclosporin+A-sensitive+channel.">Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance.">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).</li></ol>

המדידה הפוטנציאלית של קרום מיטוכונדריאלי היא אבן פינה של ניתוח והערכה של המיטו, אשר הם קריטיים למצב המטבולית של התא. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח של ΔΨm על ידי כתמים TMRM. TMRM הוא צבע הניאון האמור לצבוע אשר מצטבר פעיל המיטומטר בשל ΔΨm, ואת הרמות המתאימות שלה להישאר בשיווי משקל בין מסחטות, cytopl...

תאי גזע המטפאות (HSCs) מחדשים את עצמם, רב-עוצמה, ומסוגלים להצמיח את כל תאי הדם1,2. מטבוליזם הסלולר הוא וסת מפתח של תחזוקה hsc, יחד עם גורמים transcript, אותות פנימיים ומיקרואקולוגיה3,4,5. השליטה הנכונה של תפקוד מיטוכונדריאלי ואיכות הוא אפוא קריטי לתחזוקת hsc6,7.
פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (ΔΨm) הוא פרמטר מפתח להערכת המיטו, כפי שהוא משקף ישירות את הפונקציונליות שלהם, אשר נובעת משיווי משקל של פעילות שאיבה פרוטון בשרשרת התחבורה אלקטרון וזרימת פרוטון דרך F 1/FO ATP סטנדרטים. אלה הן נדרשות (בהתאם לביטוי הגנים וזמינות המצע) עבור זירחון תלוי-החמצן של ADP ל-ATP8,9. לנצל את אלקטרושליליות של תא מיטוכונדריאלי, צבעים שונים בפוטנציאל פותחו כדי למדוד ΔΨm. אחד מהם הוא טטרמתיל מתיל (TMRM), אשר שימש בהרחבה כדי למדוד ΔΨm על ידי זרימה cy, לנסות במגוון של תאים10, כולל גזע המטפאות ובתאי מחולל11.
צבעים מיטוכונדריאלי חייב להיות בשימוש עם כמה זהירות ב HSCs, עם זאת, מכיוון הפעילות הגבוהה של משאבות xenobiotic יוטי של תאים אלה יכול לגרום לצבוע שחול12. אכן, שחול של צבעים מיטוכונדריאלי כגון Rhodamine 123 התיר לחוקרים לבודד HSCs13 או לזהות hsc "אוכלוסיות צד" על ידי ניצול ההבלטה הדיפרנציאלי של הצבעים כחול הכחול האדום14, 15. כמו כן הוכח כי הג ג'ין, חוסם מסוים של ה-ATP-משפחה של הקלטת משנה G-חבר 2 (ABCG2) טרנספורטר, אינו משפיע על דפוס הצביעת של MitoTracker ב HSPCs16. לאחר פרסום של תוצאות אלה, מחקרים מרובים בוצעו באמצעות צבעים מיטוכונדריאלי בהעדר מעכבי משאבת xenobiotic יוטי, המוביל הרושם הנרחב כי HSCs יש רק מספר קטן של המיטולוגיה עם נמוך ΔΨm16 , מיכל בן 17 , . שמונה עשרה
לאחרונה, זה הוכח, עם זאת, כי Verapamil, מעכב ספקטרום רחב של משאבות אפלוקס, משנה באופן משמעותי את דפוס הצביעת של מיטוכונדריאל מימעקב ירוק19. פער זה סביר בגלל העובדה כי FumitAbcg2 ג ' ין הוא סלקטיבי מאוד עבור, בעוד HSCs גם לבטא מובילים אחרים כגון Abcb1a (אשר רק רגיש חלש כדי Fumit, ג'ין ג)19. אנו דיווחו גם כי צבעים מיטוכונדריאלי אחרים, כגון TMRM, Nonyl כתומה כתום, ו Mitotracker אורנג ' (MTO) התערוכה דפוסים כמו מיטומו גרין. חשוב מכך, הבחנו בכך שדפוסי הזרימה של HSPCs משקפים את ΔΨm בנוסף למסה מיטוכונדריאלי11.
צריכת הצבע TMRM תלוי בקפדנות על המטען השלילי של המיטומטר, אבל הצטברות של צבע כתוצאה מכך הוא באיזון תמידי בין צריכת והסיווג שלה על ידי משאבות אפלוקס20. ההבדל בביטוי xenobiotic יוטי משאבת בין HSCs ואוכלוסיות תאים בוגרים משפיע על איזון זה יכול להוביל לתוצאות מוטה. השימוש של מעכבי ייעודי כגון Verapamil צריך להיחשב ניתוח של ΔΨm על ידי צבעים בעלי פוטנציאל ממטרי. כאן אנו מתארים פרוטוקול שונה עבור מדידה ΔΨm מדויקת על ידי מבוססי TMRM הזרימה cy try אשר מתקן עבור פעילות השיגור xenobiotic יוטי באמצעות מעכבי ייעודי.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3e-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0031-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD48-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0481-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD135-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1351-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150-PerCP/Cy5.5&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-kit-APC/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporin H</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1575-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr1-biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-5790-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Il7R&#945;-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1271-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nk1.1-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca-1-PE/Cy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF murine</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>250-03-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM medium</td>
			<td>STEMCELL technologies</td>
			<td>9605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Pacific Blue</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5428-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-14-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>V4629-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps

כמו חילוף החומרים הסלולר הוא וסת המפתח של תא גזע המטבית (HSC) התחדשות עצמית, התפקידים השונים שיחק על ידי המיטואיטין הומאוסטזיס ההטיות כבר נחקרו בהרחבה על ידי חוקרים HSC. רמות פעילות מיטוכונדריאלי משתקפות בפוטנציאל הממברנה שלהם (ΔΨm), שניתן למדוד אותם על-ידי שלבים העלולים להיות מיועדים לצבעים כגון TMRM (טטרמתיל, מתיל אסתר). היכולת של משאבות אפלוקס להבלטת צבעים אלה מתאים יכולים להגביל את התועלת שלהם, עם זאת. הטיית המדידה המתקבלת היא קריטית במיוחד בעת הערכת HSCs, כשטרנספורטי מובילים מציגים רמות גבוהות יותר של ביטוי ופעילות ב-HSCs מאשר בתאים המובחנים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ניצול Verapamil, מעכב משאבת משאבה, כדי למדוד במדויק ΔΨm על פני אוכלוסיות מרובות מח עצם. העיכוב כתוצאה של פעילות המשאבה מוצג כדי להגביר את עוצמת TMRM בתוך המטפאות גזע ומחולל קדמון (HSPCs), תוך השארת אותו ללא שינוי יחסית בשברים בוגרים. פעולה זו מדגישה את תשומת הלב הקרובה לפעילות צבען-אפלוקס הדרושה כאשר משתמשים בצבעים תלויי-ΔΨm, וכמו שכתוב ודמיינו, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי להשוות בין אוכלוסיות שונות בתוך מח העצם, או באותה אוכלוסייה על-פני דגמים ניסיוניים שונים.

הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר בידוד קל של BM-MNCs ממודל העכבר. איור 1 מסכם את השלבים העיקריים של הפרוטוקול: בידוד עצם, הריקון מתוך מח העצם, לפירוק תא דם אדום, וכתמים נוגדן ואחריו tmrm כתמים כדי למדוד פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי באוכלוסיה מסוימת המטתית .
BM-MNCs מכילים מ?...

Watch this Scientific Journal Video about Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of 

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

משאבות xenoביוטיקה פעילים מאוד בתאי גזע ומחולל קדמון (HSPCs) ולגרום שחול TMRM, קרום מיטוכונדריאלי פוטנציאל לצבוע פלורסנט. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד במדויק פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי ב HSPCs על ידי TMRM בנוכחות Verapamil, מדכא משאבת משאבה.

שיפור הדיוק של הערכה להערכת הזרימה של הפוטנציאל לממברנה מיטוכונדריאלי בתאי המטפאות ובתאים באמצעות עיכוב של משאבות אפלוקס

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

תפקוד המיטוכונדריאלי הוא קריטי להתחדשות עצמית של תאי גזע hematopoietic. פעילות מיטוכונדרית היא רפלקטור של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלי הפנימי, אשר ניתן למדוד על ידי TMRM, פלואורסצנט תא, צבע קטורתי מחלחל לתא. משאבות אפלוקס קסנוביוטיות פעילות מאוד ב- HSC, וגורם לבלט TMRM.היתרון העיקרי של פרוטוקול זה, הוא התיקון של אפקט זה, ניצול Verapamil, מעכב של משאבות efflux. התחל על ידי בידוד מח עצם מעצם הירך של העכבר. השתמש בזוג מדפים ומספריים חדים כדי לחתוך את שתי כפות הרגליים האחוריות.ואז לעשות גפיים קטנות בעור הגחוני של העכבר, ולמתח אותו. מוציאים את עצם הירך ואת השוקה, תוך כדי טיפול לא לנתק את ראשי עצם הירך, ולמקם את העצמות בצלחת שש בארות, מלא 1.5 מיליליטר של חיץ מכתים. הסר את השרירים מן העצמות, לחתוך את הקצוות של העצמות, המאפשר מח עצם לצאת.מניחים את העצמות ניקה בארות חדשות, עם 1.5 מיליליטר של חיץ כתמים. לאחר מכן, לשטוף את מח העצם עם מזרק שלושה מיליליטר ומחט 25 מד, עד העצם הופכת לבנה. לאסוף את כל התאים בצינור 1.5 מיליליטר, צנטריפוגה אותם במשך חמש דקות ב 180 פעמים G, ואז להשליך את העל טבעי.בזהירות resuspend את גלולה ב 300 microliters של קרח קר ACK lysing חיץ, ולשים את התאים על הקרח במשך דקה אחת. לאחר מכן בטל מיד את הפעלת התזה על-ידי הוספת מיליליטר אחד של מאגר כתמים. צנטריפוגה התאים במשך חמש דקות ב 180 פעמים G.Resuspend גלולת התא, אשר אמור להיראות לבן, במיליליטר אחד של חיץ מכתים.סנן את התאים באמצעות מכסה מסננת תאים, עם רשת ניילון 35 מיקרומטר, כדי להשיג תאים mononuclear. התחל על ידי הכנת קוקטייל שושלת היוחסין, ונוגדנים נדנים פלואורופור, על פי הוראות כתב היד. שמור את הנוגדנים על קרח, ומוגן מפני אור.לאחר מכן, צנטריפוגה המדגם במשך חמש דקות ב 180 פעמים G, ולהשליך את supernatant. מוסיפים 400 מיקרוליטרים של קוקטייל השושלת, וארבעה מיקרוליטרים של נוגדנים BIOTINYLATED CD135 לכדור התא, ומערבולת את התערובת. ואז להחגירה אותו על קרח במשך 30 דקות.לאחר הדגירה, לשטוף את המדגם על ידי הוספת שלושה מיליליטר של חיץ כתמים, לסובב אותו במשך חמש דקות ב 180 פעמים G, והשליכת supernatant. לאחר מכן מוסיפים 400 מיקרוליטרים של תותב נוגדנים, ומערבולת את התערובת. דגירה אותו על קרח במשך 30 דקות נוספות, ולחזור על לשטוף עם חיץ הכתמים.כדי להכין את פתרון הכתמים TMRM, להוסיף 2.2 microliters של פתרון מלאי TMRM, ו 1.1 microliters של Verapamil, כדי 1.1 מיליליטר של מדיום תרבות hematopoietic ללא סרום, עם תרומבופויטין וגורם תאי גזע. תן מחדש את מח העצם במיליליטר אחד של תסנובת הכתמים של TMRM, מערבולת במהירות, ותדחק במשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס. סנן את הדגימה באמצעות כובע מסננת תאים, עם רשת ניילון 35 מיקרומטר, כדי למנוע סתימת ציטומטר הזרימה.לאחר מכן הוסף מיקרוליטר אחד של DAPI והמשך עם ציטומטריית זרימה. הפעל את דגימת מח העצם, ולרכוש לפחות מיליון אירועים. לאחר מכן הציגו את התאים המונונוקלאריים של מח העצם החי בעלילה של כחול האוקיינוס השקט, כדי לזהות שברי CD135 Lin-negative ו-Lin חיוביים.התווה את השבר ה-Lin-שלילי עבור APC/Cy7 לעומת PE/Cy7 כדי לזהות את הצאצא הרב-תכליתי או את שבר MPP. לאחר מכן התווה את שבר MPP עבור APC לעומת PerCP/Cy5.5, כדי לזהות את תא הגזע hematopoietic או שבר HSC. הצג את שבר HSC עבור FITC, או CD34, כדי לחלק אותו לשברים HSC שליליים של CD34 ו- CD34 חיוביים HSC.לבסוף לרכוש את עוצמת TMRM בכל אוכלוסייה. כדי להבטיח כי כתמי TMRM פעלו כראוי, להוסיף מיקרוליטר אחד של FCCP לדגימה, לריכוז סופי של מילימולר אחד, ולהדגיר אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. אז תרכוש מיליון אירועים.לאחר הוספת FCCP, יש להגדיל באופן דרסטי את עוצמת TMRM. פרוטוקול זה שימש בהצלחה לכימות פוטנציאל קרום המיטוכונדריאלי באוכלוסיות תאים שונות, עם צבע TMRM. הוכח כי נוכחותם של PBS ו- FBS במדיום התרבות משפיעה על עוצמת האות TMRM.ולכן חשוב לבצע כתמי TMRM במדיום הרחבה ללא סרום. תאי גזע hematopoietic לבטא רמות פעילות גבוהות של משאבות פלקס קסנוביוטי כי להחדיר צבע TMRM. אז פרופילי TMRM משתנים גם בנוכחות Verapamil או Cyclosporin H, אשר חוסמים את המשאבות.כדי לאמת את הדיוק של כתמי TMRM, FCCP יכול להיות depolarize המיטוכונדריה, ולהפחית את עוצמת TMRM. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות לחקר HSC עם צבע פוטנציאלי ממברנה מיטוכונדריאלי שונה, כולל TMRE או JC-1. כמו גם צבעים מיטוכונדריאליים אחרים כגון MitoTracker או MitoSOX.הנושאים הקריטיים שירשו הפעילות השונה של משאבות אפלוקס בקרב אוכלוסיית מח העצם הצביעו רק לאחרונה. אז פרוטוקול זה נועד להפחית את הפער בין ממצאים קודמים.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

בידוד ניתוח בתאי גזע hematopoietic מן השליה

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

זיהוי של גורמי מפתח עם הרגולציה עצמית התחדשות והתמיינות בתאי EML המטופואטיות מבשר על ידי ניתוח RNA-רצף

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

מדידת מיסת מיטוכונדריאלי ופוטנציאל ממברנה בתאי גזע ותאי T-תאים על ידי זרימה Cy,

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

הערכה של ביו-אנרגיה תאית בגזע המטופויאטי של עכברים ובתאי אב פרימיטיביים באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

הערכה תפקודית של קינזין-7 CENP-E בזרעונים באמצעות עיכוב Vivo , אימונופלואורסנציה וציטומטריית זרימה

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...