Name: improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps
Uploaded: 2019-07-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of

लेखकों Ito प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवाद, विशेष रूप से कश्मीर Ito और एच Sato, और आइंस्टीन स्टेम सेल संस्थान टिप्पणियों के लिए और आइंस्टीन फ्लो साइटोमेट्री और विश्लेषणात्मक इमेजिंग कोर सुविधाओं (राष्ट्रीय कैंसर संस्थान अनुदान P30 CA013330 द्वारा वित्त पोषित) के लिए प्रयोगों को पूरा करने में मदद. के.आई. स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R01DK98263, R01DK115577, और R01DK100689) और आइंस्टीन एकल सेल जीनोमिक्स के कोर निदेशक के रूप में स्वास्थ्य के न्यूयॉर्क राज्य विभाग से अनुदान द्वारा समर्थित है / के.आई. इतो ल्यूकेमिया और लिंफोमा सोसायटी के एक रिसर्च स्कॉलर हैं।

यहाँ वर्णित सभी तरीकों को अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज ऑफ मेडिसिन के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है।
1. समाधान की तैयारी
<ol><li>दाग बफर (फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) + 2% ...

<ol>
	<li>Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+progenitor+cells:+origins,+phenotypes,+lineage+commitments,+and+transdifferentiations.">Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).</li><li>Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+stem+cell+biology.">Regulatory mechanisms in stem cell biology.</a> Cell. 88 (3), 287-298 (1997).</li><li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li><li>Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell:+keystone+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+and+a+stepping-stone+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine.</a> Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).</li><li>Ito, K., Bonora, M., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+as+master+of+hematopoietic+stem+cell+fate.">Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate.</a> International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+a+purified+Tie2++hematopoietic+stem+cell+population+relies+on+mitochondrial+clearance.">Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance.</a> Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).</li><li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthesis+and+storage.">ATP synthesis and storage.</a> Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).</li><li>Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+catalysis+in+ATP+synthase.">The regulation of catalysis in ATP synthase.</a> Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).</li><li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment.">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li><li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+efflux+studies+suggest+that+hematopoietic+stem+cells+expressing+low+or+undetectable+levels+of+CD34+antigen+exist+in+multiple+species.">Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species.</a> Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).</li><li>Spangrude, G. J., Johnson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+and+activated+subsets+of+mouse+multipotent+hematopoietic+stem+cells.">Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).</li><li>Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABCG2+transporter+is+an+efficient+Hoechst+33342+efflux+pump+and+is+preferentially+expressed+by+immature+human+hematopoietic+progenitors.">The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors.</a> Blood. 99 (2), 507-512 (2002).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+transporter+Bcrp1/ABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype.">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, 13125 (2016).</li><li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress.">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+imaging+of+mitochondrial+structure+and+function+during+acute+kidney+injury.">In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury.</a> Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cyclophilin+with+the+mitochondrial+inner+membrane+and+regulation+of+the+permeability+transition+pore,+and+cyclosporin+A-sensitive+channel.">Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance.">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).</li></ol>

Mitochondrial झिल्ली संभावित माप विश्लेषण और mitochondria के आकलन की एक आधारशिला है, जो कोशिका की चयापचय राज्य के लिए महत्वपूर्ण हैं. यहाँ, हम TMRM धुंधला द्वारा $ m के विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. टीएमआरएम एक सेल-प?...

Hematopoietic स्टेम सेल (HSCs) स्वयं नवीनीकरण कर रहे हैं, बहु शक्तिशाली, और रक्त के सभी कोशिकाओं को जन्म देने में सक्षम1,2. सेलुलर चयापचय एचएससी रखरखाव का एक प्रमुख नियामक है, साथ ही ट्रांसक्रिप्शनल कारक, आंतरिक संकेतों और सूक्ष्म पर्यावरण3,4,5. माइटोकोंड्रियाल कार्य और गुणवत्ता का उचित नियंत्रण इसलिए एचएससी रखरखाव6,7के लिए महत्वपूर्ण है .
माइटोकोंड्रिया झिल्ली विभव (जेडएम) माइटोकोंड्रिया के मूल्यांकन में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है क्योंकि यह सीधे उनकी कार्यक्षमता को दर्शाता है, जो इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला में प्रोटॉन पंपिंग गतिविधि के संतुलन से प्राप्त होता है और एफ के माध्यम से प्रोटॉन प्रवाह 1/एफओ एटीपी synthase. ये दोनों आवश्यक हैं (जीन अभिव्यक्ति और सब्सट्रेट उपलब्धता के आधार पर) एडीपी के एटीपी8,9के लिए ऑक्सीजन पर निर्भर फॉस्फोरिलेशन के लिए। माइटोकोंड्रियाल कम्पार्टमेंट की इलेक्ट्रोनेगेटिविटी का लाभ उठाते हुए, विभिन्न potentiometric रंगों को मापने के लिए विकसित किया गया है। उनमें से एक टेट्रामेथिलहोडामाइन मिथाइल एस्टर परक्लोरेट (टीएमआरएम) है, जिसका उपयोग विभिन्न कोशिकाओंमेंप्रवाह साइटोमेट्री द्वारा 10, हेमेटोपोएटिक स्टेम और संतति कोशिकाओं11सहित , प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मापने के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है।
Mitochondrial रंगों HSCs में कुछ सावधानी के साथ इस्तेमाल किया जाना चाहिए, तथापि, क्योंकि इन कोशिकाओं के विदेशी बायोटिक efflux पंप की उच्च गतिविधि डाई बाहर निकालना में परिणाम कर सकते हैं12. वास्तव में, ऐसे Rhodamine 123 के रूप में mitochondrial रंगों के बाहर निकालना शोधकर्ताओं HSCs को अलग करने की अनुमति दी है13 या HSC की पहचान "साइड आबादी" रंगों के अंतर बाहर निकालना शोषण द्वारा Hoechst ब्लू और Hoechst लाल14, 15यह भी दिखाया गया है कि FUmitremorgin सी, एटीपी बाध्यकारी कैसेट उप परिवार जी सदस्य 2 (ABCG2) ट्रांसपोर्टर के एक विशिष्ट अवरोधक, HSPCs16में MitoTracker के धुंधला पैटर्न को प्रभावित नहीं करता है . इन परिणामों के प्रकाशन के बाद, कई अध्ययन ों exobiotic efflux पंप inhibitors के अभाव में mitochondrial रंगों का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया, व्यापक धारणा है कि HSCs कम के साथ mitochondria की केवल एक छोटी संख्या है के लिए अग्रणी $ m16 , 17 , 18.
हाल ही में, यह प्रदर्शन किया गया था, तथापि, कि Verapamil, efflux पंपों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम अवरोध करनेवाला, काफी mitochondrial डाई MitoTracker ग्रीन19के दाग पैटर्न को संशोधित करता है. इस विसंगति तथ्य यह है कि Fumitremorgin सी Abcg2 के लिए अत्यधिक चयनात्मक है की वजह से होने की संभावना है, जबकि HSCs भी ऐसे Abcb1a के रूप में अन्य ट्रांसपोर्टरों व्यक्त (जो केवल कमजोर Fumitremorgin सी के प्रति संवेदनशील है)19. हमने यह भी सूचित किया है कि अन्य mitochondrial रंगों, जैसे TMRM, Nonyl acridine नारंगी, और Mitotracker ऑरेंज (MTO) Mitotracker ग्रीन के रूप में एक ही पैटर्न प्रदर्शन. इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि हमने देखा है कि एच एसपीसी के प्रवाह साइटोमेट्रिक पैटर्न माइटोकोंड्रियाल द्रव्यमान11के अतिरिक्त उनके $m को प्रतिबिंबित करते हैं।
टीएमआरएम डाई का सेवन सख्ती से माइटोकोंड्रिया के ऋणात्मक आवेश पर निर्भर करता है, लेकिन डाई का परिणामी संचय इसके सेवन और प्रवाह के बीच लगातार संतुलन में है जो कि एफलक्स पंप20द्वारा होता है। एचएससी और परिपक्व कोशिका आबादी के बीच विदेशी बायोटिक efflux पंप अभिव्यक्ति में अंतर इस संतुलन को प्रभावित करता है और पक्षपाती परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. Verapamil जैसे समर्पित inhibitors के उपयोग potentiometric रंगों द्वारा $ m के विश्लेषण में विचार किया जाना चाहिए. यहाँ हम टीएमआरएम-आधारित प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा सटीक माप के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो समर्पित अवरोधकों के उपयोग के माध्यम से विदेशी जीवीय ट्रांसपोर्टर गतिविधि को सही करता है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3e-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0031-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD48-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0481-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD135-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1351-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150-PerCP/Cy5.5&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-kit-APC/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporin H</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1575-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr1-biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-5790-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Il7R&#945;-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1271-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nk1.1-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca-1-PE/Cy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF murine</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>250-03-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM medium</td>
			<td>STEMCELL technologies</td>
			<td>9605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Pacific Blue</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5428-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-14-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>V4629-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps

सेलुलर चयापचय के रूप में hematopoietic स्टेम सेल (HSC) आत्म नवीकरण के एक प्रमुख नियामक है, hematopoietic homeostasis में mitochondria द्वारा निभाई विभिन्न भूमिकाओं बड़े पैमाने पर एचएससी शोधकर्ताओं द्वारा अध्ययन किया गया है. Mitochondrial गतिविधि के स्तर उनकी झिल्ली क्षमता में परिलक्षित होते हैं (जेडएम), जो इस तरह के TMRM (tetramethylrhodamine, मिथाइल एस्टर) के रूप में सेल-परमेन्टिक धनानिक रंगों द्वारा मापा जा सकता है। efflux पंप की क्षमता कोशिकाओं से इन रंगों को बाहर निकालने के लिए उनकी उपयोगिता को सीमित कर सकते हैं, तथापि. परिणामस्वरूप माप पूर्वाग्रह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब एचएससी का आकलन, के रूप में विदेशी ट्रांसपोर्टरों अलग कोशिकाओं की तुलना में एचएससी में अभिव्यक्ति और गतिविधि के उच्च स्तर का प्रदर्शन. यहाँ, हम Verapamil, एक efflux पंप अवरोध करनेवाला का उपयोग एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए सही उपाय करने के लिए - कई अस्थि मज्जा आबादी भर में $m. पंप गतिविधि के परिणामस्वरूप निषेध hematopoietic स्टेम और जनक कोशिकाओं (HSPCs) में TMRM तीव्रता बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, जबकि यह परिपक्व भिन्नों में अपेक्षाकृत अपरिवर्तित छोड़ने. यह डाई-efflux गतिविधि है कि जब $m-निर्भर रंगों का उपयोग किया जाता है की आवश्यकता है के करीब ध्यान पर प्रकाश डाला गया है, और के रूप में लिखा है और visualized, इस प्रोटोकॉल सही अस्थि मज्जा के भीतर या तो अलग आबादी की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या एक ही आबादी विभिन्न प्रयोगात्मक मॉडल भर में।

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल एक माउस मॉडल से बीएम-MNCs के आसान अलगाव सक्षम बनाता है. चित्रा 1 प्रोटोकॉल के मुख्य चरणों को संक्षेप में प्रस्तुत करता है: हड्डी अलगाव, अस्थि मज्जा से बाहर फ्लशिंग, लाल रक्त ?...

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Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

Xenobiotic efflux पंप हेमेटोपोएटिक स्टेम और संतति कोशिकाओं (HSPCs) में अत्यधिक सक्रिय हैं और TMRM के बाहर निकालना कारण, एक mitochondrial झिल्ली संभावित फ्लोरोसेंट डाई. यहाँ, हम Verapamil, एक efflux पंप अवरोध करनेवाला की उपस्थिति में TMRM द्वारा HSPCs में mitochondrial झिल्ली क्षमता को सही ढंग से मापने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं.

Efflux पंप्स के निषेध के माध्यम से Hematopoietic स्टेम और जनक कोशिकाओं में Mitochondrial झिल्ली क्षमता के प्रवाह Cytometric आकलन की सटीकता में सुधार

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल स्व नवीकरण के लिए महत्वपूर्ण है। माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता का एक रिफ्लेक्टर है, जिसे टीएमआरएम, एक सेल फ्लोरोसेंट, सेल-परमींत ेक्टिक डाई द्वारा मापा जा सकता है। Xenobiotic efflux पंप एचएससी में अत्यधिक सक्रिय हैं, और TMRM बहिर्गमन का कारण बनते हैं।इस प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ, इस प्रभाव का सुधार है, जो वेरापामिल का उपयोग करता है, जो एफ्लक्स पंपों का अवरोधक है। माउस फीमर से बोन मैरो को अलग करके शुरू करें। दो पीछे के पंजे को काटने के लिए संदंश और तेज कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें।इसके बाद माउस की वेंट्रल स्किन में एक छोटा सा स्निप बनाएं और उसे स्ट्रेच करें। फीमर और टिबिया निकालें, ध्यान रखते हुए फीमर के सिर को उखाड़ फेंकना नहीं, और हड्डियों को छह अच्छी तरह की प्लेट में रखें, जो 1.5 मिलीलीटर धुंधला बफर से भरा हुआ है। हड्डियों से मांसपेशियों को हटा दें, और हड्डियों के सिरों को काट लें, जिससे बोन मैरो बाहर निकल सके।साफ हड्डियों को नए कुओं में रखें, जिसमें 1.5 मिलीलीटर धुंधला बफर हो। फिर, तीन मिलीलीटर सिरिंज और एक 25 गेज सुई के साथ अस्थि मज्जा बाहर निकलें, जब तक कि हड्डी सफेद न हो जाए। एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और उन्हें 180 बार जी पर पांच मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें, फिर सुपरनेट को त्यागें।सावधानी से बर्फ ठंड ACK lysing बफर के 300 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से खर्च करें, और कोशिकाओं को एक मिनट के लिए बर्फ पर रखें। फिर तुरंत धुंधला बफर के एक मिलीलीटर जोड़कर लाइसिस को निष्क्रिय करें। सेंटीफ्यूज पांच मिनट के लिए कोशिकाओं को १८० बार G.Resuspend सेल गोली है, जो सफेद दिखाई देना चाहिए, दाग बफर के एक मिलीलीटर में ।मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए 35 माइक्रोमीटर नायलॉन जाल के साथ कोशिका छन्नी टोपी का उपयोग करके कोशिकाओं को फ़िल्टर करें। पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार, वंश कॉकटेल, और फ्लोरोफोर कंजूस एंटीबॉडी तैयार करके शुरू करें। बर्फ पर एंटीबॉडी रखें, और प्रकाश से संरक्षित करें।फिर, 180 बार जी पर पांच मिनट के लिए नमूना अपकेंद्रित्र, और सुपरनैंट त्यागें। वंश कॉकटेल के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें, और सेल पेलेट में सीडी 135 बायोटिनाइलेटेड एंटीबॉडी के चार माइक्रोलीटर, और मिश्रण को भंवर दें। फिर इसे 30 मिनट तक बर्फ पर इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के बाद, तीन मिलीलीटर धुंधला बफर जोड़कर नमूना धोएं, इसे 180 बार जी पर पांच मिनट के लिए नीचे कताई करें, और सुपरनैंट को त्याग दें। फिर एंटीबॉडी समाधान के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें, और मिश्रण भंवर। इसे एक और 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें, और धुंधला बफर के साथ धोने को दोहराएं।टीएमआरएम स्टेनिंग समाधान तैयार करने के लिए, थ्रोम्बोपिटिन और स्टेम सेल फैक्टर के साथ, टीएमआरएम स्टॉक समाधान के 2.2 माइक्रोलीटर और वेरापामिल के 1.1 माइक्रोलीटर, सीरम-मुक्त हेमेटोपोइटिक कल्चर माध्यम में जोड़ें। टीएमआरएम धुंधला समाधान के एक मिलीलीटर में अस्थि मज्जा को फिर से खर्च करें, भंवर जल्दी से, और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। प्रवाह साइटोमीटर को बंद करने से बचने के लिए, 35 माइक्रोमीटर नायलॉन जाल के साथ सेल छन्नी टोपी का उपयोग करके नमूने को फ़िल्टर करें।फिर DAPI का एक माइक्रोलीटर जोड़ें और प्रवाह साइटोमेट्री के साथ आगे बढ़ें। बोन मैरो का नमूना चलाएं, और कम से कम दस लाख घटनाओं का अधिग्रहण करें। फिर सीडी 135 लिन-नकारात्मक और लिन-सकारात्मक अंशों की पहचान करने के लिए, प्रशांत नीले रंग के लिए एक भूखंड में लाइव बोन मैरो मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को प्रदर्शित करें।मल्टीपॉटेंट जनक या एमपीपी अंश की पहचान करने के लिए एपीसी/Cy7 बनाम पीई/Cy7 के लिए लिन-निगेटिव अंश की साजिश करें । फिर पीपीसी बनाम PerCP/Cy5.5 के लिए एमपीपी अंश की साजिश, हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल या एचएससी अंश की पहचान करने के लिए । इसे सीडी 34 नकारात्मक एचएससी और सीडी 34 सकारात्मक एचएससी अंशों में विभाजित करने के लिए फिटसी, या सीडी 34 के लिए एचएससी अंश प्रदर्शित करें।अंत में प्रत्येक आबादी में TMRM तीव्रता प्राप्त करते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि टीएमआरएम धुंधला सही ढंग से काम करता है, एक मिलीमोलर की अंतिम एकाग्रता के लिए, नमूने में एफसीसीपी का एक माइक्रोलीटर जोड़ें, और इसे पांच मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर दस लाख घटनाओं का अधिग्रहण।एफसीसीपी इसके अलावा के बाद, टीएमआरएम तीव्रता में भारी वृद्धि की जानी चाहिए। इस प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग विभिन्न कोशिका आबादी में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया है, जिसमें टीएमआरएम डाई है। यह प्रदर्शित किया गया है कि संस्कृति माध्यम में पीबीएस और एफबीएस की उपस्थिति टीएमआरएम सिग्नल तीव्रता को प्रभावित करती है।इसलिए सीरम मुक्त विस्तार माध्यम में टीएमआरएम धुंधला करना महत्वपूर्ण है। हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल ज़ेनोबायोटिक एफ्लक्स पंपों के उच्च गतिविधि स्तर को व्यक्त करते हैं जो टीएमआरएम डाई को बाहर निकालते हैं। इसलिए टीएमआरएम प्रोफाइल वेरापमिल या साइक्लोस्पोरिन एच की उपस्थिति में भी भिन्न होते हैं, जो पंपों को अवरुद्ध करते हैं।टीएमआरएम धुंधला की सटीकता को सत्यापित करने के लिए, एफसीसीपी माइटोकॉन्ड्रिया को डीपोलराइज करने और टीएमआरएम तीव्रता को कम करने के लिए हो सकता है। इस प्रोटोकॉल को आसानी से टीएमआरई या जेसी-1 सहित एक अलग माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संभावित डाई के साथ एचएससी का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। साथ ही अन्य माइटोकॉन्ड्रियल रंग जैसे मिटोट्रैकर या मिटोसॉक्स।बोन मैरो आबादी के बीच efflux पंपों की विभिन्न गतिविधि से विरासत में मिली महत्वपूर्ण मुद्दों को हाल ही में बताया गया था । तो इस प्रोटोकॉल के लिए पिछले निष्कर्षों के बीच विसंगति को कम करने के उद्देश्य से है ।

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

अलगाव और अपरा से hematopoietic स्टेम सेल का विश्लेषण

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

माउस meiotic कक्ष का फ्लो Cytometry शोधन

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral - मध्यस्थता नॉकडाउन के दौरान पूर्व vivo</emमानव hematopoietic स्टेम सेल के> erythropoiesis

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

प्ररूपी और murine hematopoietic स्टेम सेल और वंश प्रतिबद्ध progenitors के विश्लेषण से अलगाव

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

वयस्क माउस Calvarial अस्थि मज्जा में hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के Vivo 4 आयामी ट्रैकिंग में

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

शाही सेना अनुक्रमण विश्लेषण द्वारा EML Hematopoietic अग्रदूत साबित कोशिकाओं में आत्म नवीकरण और भेदभाव विनियमन मुख्य कारक की पहचान

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Mitochondrial कैल्शियम और mitochondrial झिल्ली के साथ माप फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा जीवित कोशिकाओं में संभावित

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

फ्लो साइटोमेट्री द्वारा हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल और टी-सेल में माइटोकॉन्ड्रियल मास और झिल्ली क्षमता का मापन

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

माउस हेमटोपोइएटिक स्टेम और आदिम पूर्वज कोशिकाओं में सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स का मूल्यांकन बाह्य कोशिकीय फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

विवो निषेध, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके शुक्राणुकोशिकाओं में काइन्सिन -7 सीईएनपी-ई का कार्यात्मक मूल्यांकन

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...