Name: improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps
Uploaded: 2019-07-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of

Gli autori ringraziano tutti i membri del laboratorio Ito, in particolare K Ito e H Sato, e l'Einstein Stem Cell Institute per i commenti e le strutture centrali di Einstein Flow Cytometry and Analytical Imaging (finanziate dalla sovvenzione P30 CA013330 del National Cancer Institute) per contribuire a condurre gli esperimenti. K.I. è supportato da sovvenzioni del National Institutes of Health (R01DK98263, R01DK115577 e R01DK100689) e del Dipartimento della Salute dello Stato di New York come direttore centrale di Einstein Single-Cell Genomics/Epigenomics (C029154). K.I. Ito è uno studioso di ricerca della Leucemia e della Lymphoma Society.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Albert Einstein College of Medicine.
1. Preparazione delle soluzioni
<ol><li>Coloring Buffer (PBS) con buffer di fosfato - siero bovino fetale (FBS) del 2%: aggiungere 10 mL di FBS in 500 mL di una soluzione PBS sterile. NOT:</</c0> Questa soluzione può essere conservata a 4 gradi centigradi per almeno un mese in condizioni sterili. Prima di iniziare le seguenti proced...

<ol>
	<li>Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+progenitor+cells:+origins,+phenotypes,+lineage+commitments,+and+transdifferentiations.">Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).</li><li>Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+stem+cell+biology.">Regulatory mechanisms in stem cell biology.</a> Cell. 88 (3), 287-298 (1997).</li><li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li><li>Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell:+keystone+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+and+a+stepping-stone+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine.</a> Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).</li><li>Ito, K., Bonora, M., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+as+master+of+hematopoietic+stem+cell+fate.">Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate.</a> International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+a+purified+Tie2++hematopoietic+stem+cell+population+relies+on+mitochondrial+clearance.">Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance.</a> Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).</li><li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthesis+and+storage.">ATP synthesis and storage.</a> Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).</li><li>Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+catalysis+in+ATP+synthase.">The regulation of catalysis in ATP synthase.</a> Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).</li><li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment.">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li><li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+efflux+studies+suggest+that+hematopoietic+stem+cells+expressing+low+or+undetectable+levels+of+CD34+antigen+exist+in+multiple+species.">Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species.</a> Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).</li><li>Spangrude, G. J., Johnson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+and+activated+subsets+of+mouse+multipotent+hematopoietic+stem+cells.">Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).</li><li>Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABCG2+transporter+is+an+efficient+Hoechst+33342+efflux+pump+and+is+preferentially+expressed+by+immature+human+hematopoietic+progenitors.">The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors.</a> Blood. 99 (2), 507-512 (2002).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+transporter+Bcrp1/ABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype.">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, 13125 (2016).</li><li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress.">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+imaging+of+mitochondrial+structure+and+function+during+acute+kidney+injury.">In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury.</a> Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cyclophilin+with+the+mitochondrial+inner+membrane+and+regulation+of+the+permeability+transition+pore,+and+cyclosporin+A-sensitive+channel.">Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance.">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).</li></ol>

La misurazione potenziale della membrana mitocondriale è una pietra angolare dell'analisi e della valutazione dei mitocondri, che sono fondamentali per lo stato metabolico della cellula. In questo caso, descriviamo un protocollo per l'analisi della colorazione TMRM. TMRM è un colorante fluorescente per meant cellulare che si accumula nei mitocondri attivi a causa di m, e i suoi rispettivi livelli rimangono in equilibrio tra i compartimenti extracellulari, citoplasma e mitocondriali10. Questo pro...

Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono auto-rinnovanti, multi-potenti e in grado di dare origine a tutte le cellule del sangue1,2. Il metabolismo cellulare è un regolatore chiave della manutenzione HSC, insieme a fattori trascrizionali, segnali intrinseci e il microambiente3,4,5. Il corretto controllo della funzione mitocondriale e della qualità è quindi fondamentale per la manutenzione HSC6,7.
Il potenziale della membrana mitocondriale è un parametro chiave nella valutazione dei mitocondri in quanto riflette direttamente la loro funzionalità, che deriva dall'equilibrio dell'attività di pompaggio dei protoni nella catena di trasporto degli elettroni e il flusso di protoni attraverso F 1/FO ATP synthase. Questi sono entrambi necessari (a seconda dell'espressione genica e della disponibilità di substrato) per la fosforodipendente dall'ossigeno di ADP a ATP8,9. Approfittando dell'elettronegatività del compartimento mitocondriale, sono stati sviluppati vari coloranti potentiometrici per misurare il sistema . Uno di questi è il perclorato di estere di tetrametilholhodamine (TMRM), che è stato ampiamente utilizzato per misurare la citometria di flusso in una varietà di cellule10, comprese le cellule staminali ematopoietiche e progenitrici11.
Coloranti mitocondriali devono essere utilizzati con una certa cautela in HSC, tuttavia, perché l'alta attività delle pompe di efflusso xenobiotico di queste cellule può provocare estrusione colorante12. Infatti, l'estrusione di coloranti mitocondriali come Rhodamine 123 ha permesso ai ricercatori di isolare gli HSC13 o identificare le "popolazioni laterali" di HSC sfruttando l'estrusione differenziale dei coloranti Hoechst Blue e Hoechst Red14, 15.È stato anche dimostrato che Fumitremorgin C, un blocco specifico della sottofamiglia ad associazione ATP G membro 2 (ABCG2), non influisce sul modello di colorazione di MitoTracker in HSPC16. Dopo la pubblicazione di questi risultati, sono stati effettuati più studi utilizzando coloranti mitocondriali in assenza di inibitori della pompa di efflusso xenobiotico, portando alla diffusa impressione che gli HSC abbiano solo un piccolo numero di mitocondri con basso , 17 mi lato , 18.
Recentemente, è stato dimostrato, tuttavia, che Verapamil, un inibitore ad ampio spettro delle pompe di flusso di efflusso, modifica significativamente il modello di colorazione del mitocondriale MitoTracker Green19. Questa discrepanza è probabilmente dovuta al fatto che fumitremorgin C è altamente selettivo per Abcg2, mentre gli HSC esprimono anche altri trasportatori come Abcb1a (che è solo debolmente sensibile a Fumitremorgin C)19. Abbiamo anche riferito che altri coloranti mitocondriali, come TMRM, Nonyl acridine orange, e Mitotracker Orange (MTO) presentano gli stessi modelli di Mitotracker Green. Ancora più importante, abbiamo osservato che i modelli citometrici di flusso degli HPC riflettono il loro zm in aggiunta alla massa mitocondriale11.
L'assunzione di tinture TMRM dipende strettamente dalla carica negativa dei mitocondri, ma il conseguente accumulo di tinture è in costante equilibrio tra la sua assunzione e l'eliminazione da pompe di efflusso20. La differenza nell'espressione della pompa di efflusso xenobiotica tra HSC e popolazioni di cellule mature influisce su questo equilibrio e può portare a risultati di parte. L'uso di inibitori dedicati come il Verapamil deve essere considerato nell'analisi di zm da coloranti potentiometrici. Qui descriviamo un protocollo modificato per la misurazione accurata di zm da parte della citometria di flusso basata su TMRM che corregge l'attività del trasportatore xenobiotico attraverso l'uso di inibitori dedicati.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3e-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0031-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD48-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0481-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD135-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1351-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150-PerCP/Cy5.5&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-kit-APC/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporin H</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1575-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr1-biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-5790-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Il7R&#945;-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1271-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nk1.1-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca-1-PE/Cy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF murine</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>250-03-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM medium</td>
			<td>STEMCELL technologies</td>
			<td>9605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Pacific Blue</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5428-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-14-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>V4629-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps

Poiché il metabolismo cellulare è un regolatore chiave dell'autorinnovamento delle cellule staminali ematopoietiche (HSC), i vari ruoli svolti dai mitocondri nell'omeostasi ematopoietica sono stati ampiamente studiati dai ricercatori dell'HSC. I livelli di attività mitocondriale si riflettono nei loro potenziali della membrana, che possono essere misurati da coloranti cationici per meant delle cellule come TMRM (tetramethylrhodamine, ester metilico). La capacità di pompe di efflusso di estrudere questi coloranti dalle cellule può limitare la loro utilità, tuttavia. La distorsione di misurazione risultante è particolarmente critica nella valutazione degli HSC, poiché i trasportatori xenobiotici presentano livelli di espressione e attività più elevati nelle HSC rispetto alle cellule differenziate. Qui, descriviamo un protocollo che utilizza Verapamil, un inibitore della pompa di efflusso, per misurare con precisione la z -m in più popolazioni di midollo osseo. L'inibizione risultante dell'attività della pompa è indicato per aumentare l'intensità TMRM nelle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HPC), lasciandolo relativamente invariato in frazioni mature. Ciò evidenzia la particolare attenzione all'attività di tinge-efflux che è necessaria quando si utilizzano coloranti dipendenti da zm, e come scritto e visualizzato, questo protocollo può essere utilizzato per confrontare con precisione diverse popolazioni all'interno del midollo osseo, o la stessa popolazione diversi modelli sperimentali.

Il protocollo descritto in precedenza consente di semplificare l'isolamento dei BM-MNC da un modello di mouse. La figura 1 riassume i passaggi principali del protocollo: isolamento osseo, fuoriscono dal midollo osseo, lisi dei globuli rossi e colorazione degli anticorpi seguita dalla colorazione TMRM per misurare il potenziale della membrana mitocondriale in una popolazione ematopoietica specifica .
BM-MNC contengono diverse popolazioni di cellule, tra cui HSC. I ...

Watch this Scientific Journal Video about Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of 

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

Le pompe di efflusso xenobiotico sono altamente attive nelle cellule staminali esemiche e progenitrici (HSPC) e causano l'estrusione di TMRM, una membrana mitocondriale potenziale disfunzione fluorescente. Qui, presentiamo un protocollo per misurare con precisione il potenziale della membrana mitocondriale negli HSPC da TMRM in presenza di Verapamil, un inibitore della pompa di efflusso.

Migliorare l'accuratezza del flusso Valutazione citometrica del potenziale della membrana mitocondriale nelle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici attraverso l'inibizione delle pompe di efflusso

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

La funzione mitocondriale è fondamentale per l'autori rinnovamento delle cellule staminali ematopoietiche. L'attività mitocondriale è un riflettore del potenziale della membrana mitocondriale interna, che può essere misurato da TMRM, un colorante cationico fluorescente a cellule permeante. Le pompe efflux xenobiotiche sono altamente attive in HSC e causano l'estrusione TMRM.Il principale vantaggio di questo protocollo, è la correzione di questo effetto, utilizzando Verapamil, un inibitore delle pompe efflux. Inizia isolando il midollo osseo dai femore del topo. Usa un paio di forcep e forbici affilate per tagliare le due zampe posteriori.Quindi fai un piccolo snip nella pelle ventrale del topo e allungalo. Estrarre il femore e la tibia, facendo attenzione a non spodestiare le teste del femore, e posizionare le ossa in una piastra a sei po ', riempita con 1,5 millilitri di tampone di colorazione. Rimuovere i muscoli dalle ossa e tagliare le estremità delle ossa, permettendo al midollo osseo di uscire.Posizionare le ossa pulite in nuovi pozzi, con 1,5 millilitri di tampone di colorazione. Quindi, sciacquare il midollo osseo con una siringa da tre millilitri e un ago calibro 25, fino a quando l'osso diventa bianco. Raccogliere tutte le cellule in un tubo da 1,5 millilitri e centrifugarle per cinque minuti a 180 volte G, quindi scartare il supernatante.Resostigliere con cura il pellet in 300 microlitri di tampone di lisciviamento ACK ghiacciato e mettere le cellule sul ghiaccio per un minuto. Quindi disattivare immediatamente la lisi aggiungendo un millilitro di tampone di colorazione. Centrifugare le cellule per cinque minuti a 180 volte G.Resuspend il pellet cellulare, che dovrebbe apparire bianco, in un millilitro di tampone di colorazione.Filtrare le celle utilizzando un tappo filtrante cellulare, con una rete di nylon da 35 micrometri, per ottenere cellule mononucleari. Inizia preparando il cocktail di lignaggio e gli anticorpi coniugati al fluoroforo, secondo le indicazioni manoscritte. Tieni gli anticorpi sul ghiaccio e protetti dalla luce.Quindi, centrifugare il campione per cinque minuti a 180 volte G e scartare il supernatante. Aggiungere 400 microlitri del cocktail di lignaggio e quattro microlitri di anticorpi biotinilati CD135 al pellet cellulare e vortice la miscela. Quindi incubarlo sul ghiaccio per 30 minuti.Dopo l'incubazione, lavare il campione aggiungendo tre millilitri di tampone di colorazione, facendolo girare per cinque minuti a 180 volte G e scartando il supernatante. Quindi aggiungere 400 microlitri di soluzione anticorpale e vortice la miscela. Incubarlo sul ghiaccio per altri 30 minuti e ripetere il lavaggio con il tampone di colorazione.Per preparare la soluzione di colorazione TMRM, aggiungere 2,2 microlitri di soluzione di stock TMRM e 1,1 microlitri di Verapamil, a 1,1 millilitri di terreno di coltura ematopoietico privo di siero, con trombopoietina e fattore di cellule staminali. Riprendono il midollo osseo in un millilitro della soluzione di colorazione TMRM, vortice rapidamente e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius. Filtrare il campione utilizzando un tappo filtrante cellulare, con una rete di nylon da 35 micrometri, per evitare di intasare il citometro a flusso.Quindi aggiungere un microlitro di DAPI e procedere con la citometria del flusso. Eseguire il campione di midollo osseo e acquisire almeno un milione di eventi. Quindi mostra le cellule mononucleari del midollo osseo vivo in un grafico per il blu pacifico, per identificare le frazioni lin-negative e lin-positive CD135.Tracciate la frazione lin-negativa per APC/Cy7 rispetto a PE/Cy7 per identificare il progenitore multipotente o la frazione MPP. Quindi tracciare la frazione MPP per APC rispetto a PerCP/Cy5.5, per identificare la cellula staminale ematopoietica o la frazione HSC. Visualizzate la frazione HSC per FITC, o CD34, per dividerla in frazioni HSC e CD34 positive HSC e CD34 positive di CD34.Infine acquisire l'intensità TMRM in ogni popolazione. Per assicurarsi che la colorazione TMRM abbia funzionato correttamente, aggiungere un microlitro di FCCP al campione, per una concentrazione finale di un millimolare, e incubarlo a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi acquisire un milione di eventi.Dopo l'aggiunta di FCCP, l'intensità TMRM dovrebbe essere drasticamente aumentata. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per quantificare il potenziale della membrana mitocondriale in varie popolazioni cellulari, con colorante TMRM. È stato dimostrato che la presenza di PBS e FBS nel mezzo di coltura influisce sull'intensità del segnale TMRM.Quindi è importante eseguire la colorazione TMRM in un mezzo di espansione privo di siero. Le cellule staminali ematopoietiche esprimono alti livelli di attività delle pompe efflux xenobiotiche che estrudono il colorante TMRM. Quindi i profili TMRM variano anche in presenza di Verapamil o Cyclosporin H, che bloccano le pompe.Per verificare l'accuratezza della colorazione TMRM, FCCP può essere quello di depolarizzare i mitocondri e ridurre l'intensità TMRM. Questo protocollo può essere facilmente adattato per lo studio dell'HSC con un diverso colorante potenziale a membrana mitocondriale, tra cui TMRE o JC-1. Così come altri coloranti mitocondriali come MitoTracker o MitoSOX.Le criticità ereditate dalla diversa attività delle pompe efflux tra la popolazione di midollo osseo sono state evidenziate solo di recente. Questo protocollo mira quindi a ridurre la discrepanza tra i risultati precedenti.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Isolamento e analisi delle cellule staminali ematopoietiche dalla placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Ricerca

Biologia

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Purificazione Citometria a flusso di cellule di topo Meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentivirali-mediata Knockdown Durante Ex Vivo</emEritropoiesi> di cellule staminali emopoietiche

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Identificazione dei fattori chiave di regolazione auto-rinnovamento e differenziazione in cellule ematopoietiche precursori EML da Analysis RNA-sequencing

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Misurazione simultanea di mitocondriale calcio e mitocondriale potenziale di membrana in cellule vive di Microscopia fluorescente

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Misurazione della massa mitocondriale e del potenziale della membrana nelle cellule staminali ematopoietiche e t-cellule da parte della citometria di flusso

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Valutazione della bioenergetica cellulare in cellule staminali ematopoietiche di topo e progenitrici primitive utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Valutazione funzionale della kinesina-7 CENP-E negli spermatociti mediante inibizione in vivo , immunofluorescenza e citometria a flusso

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...