Name: improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps
Uploaded: 2019-07-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of

저자는 이토 실험실의 모든 구성원을 감사, 특히 K 이토와 H 사토, 의견과 아인슈타인 흐름 세포 분석 및 분석 이미징 핵심 시설에 대한 아인슈타인 줄기 세포 연구소 (국립 암 연구소 보조금 P30 CA013330)에 대한 실험을 수행하는 데 도움이됩니다. K.I.는 아인슈타인 단세포 유전체학/후성유전체학(C029154)의 핵심 이사로서 국립보건원(R01DK98263, R01DK115577 및 R01DK100689)과 뉴욕 주 보건부의 보조금으로 지원됩니다. K.I. 이토는 백혈병과 림프종 학회의 연구 학자입니다.

여기에 설명 된 모든 방법은 의학의 알버트 아인슈타인 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 솔루션 준비
<ol><li>염색 완충제 (인산 완충 식염수 (PBS) + 2 % 태아 소 혈청 (FBS)): 멸균 PBS 용액의 500 mL에 FBS 10 mL을 추가하십시오. 참고: 이 용액은 멸균 상태에서 적어도 1 개월 동안 4 °C에서 보관될 수 있다. 다음 절차를 시작하기 전에...

<ol>
	<li>Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+progenitor+cells:+origins,+phenotypes,+lineage+commitments,+and+transdifferentiations.">Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).</li><li>Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li><li>Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell:+keystone+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+and+a+stepping-stone+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine.</a> Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).</li><li>Ito, K., Bonora, M., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+as+master+of+hematopoietic+stem+cell+fate.">Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate.</a> International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+a+purified+Tie2++hematopoietic+stem+cell+population+relies+on+mitochondrial+clearance.">Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance.</a> Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).</li><li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthesis+and+storage.">ATP synthesis and storage.</a> Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).</li><li>Walker, J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+efflux+studies+suggest+that+hematopoietic+stem+cells+expressing+low+or+undetectable+levels+of+CD34+antigen+exist+in+multiple+species.">Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species.</a> Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).</li><li>Spangrude, G. J., Johnson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+and+activated+subsets+of+mouse+multipotent+hematopoietic+stem+cells.">Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).</li><li>Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABCG2+transporter+is+an+efficient+Hoechst+33342+efflux+pump+and+is+preferentially+expressed+by+immature+human+hematopoietic+progenitors.">The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors.</a> Blood. 99 (2), 507-512 (2002).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+transporter+Bcrp1/ABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype.">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, 13125 (2016).</li><li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress.">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+imaging+of+mitochondrial+structure+and+function+during+acute+kidney+injury.">In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury.</a> Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cyclophilin+with+the+mitochondrial+inner+membrane+and+regulation+of+the+permeability+transition+pore,+and+cyclosporin+A-sensitive+channel.">Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance.">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).</li></ol>

미토콘드리아 막 전위 측정은 세포의 대사 상태에 중요한 미토콘드리아의 분석 그리고 평가의 초석입니다. 여기서, TMRM 염색에 의한 ΔΘm의 분석을 위한 프로토콜을 설명한다. TMRM은 ΔΘm으로 인해 활성 미토콘드리아에 축적되는 세포-천형형 염료이며, 각각의 수준은 세포외, 세포질 및 미토콘드리아구획(10)사이의 평형 상태로 유지된다. 이 프로토콜은 테트라메틸호다민, 에틸 에...

조혈 줄기 세포 (HSC)는 자가 갱신, 다중 강력하며 혈액의 모든 세포를 발생시킬 수있습니다 1,2. 세포 대사는 전사 인자, 본질적인 신호 및 미세 환경3,4,5와함께 HSC 유지 보수의 주요 조절제입니다. 따라서 미토콘드리아 기능 및 품질의 적절한 제어는HSC 유지 보수 6,7에매우 중요합니다.
미토콘드리아 멤브레인 전위(ΔΘm)는 미토콘드리아의 기능을 직접 반영하기 때문에 미토콘드리아의 평가에서 핵심 적인 매개 변수이며, 이는 전자 수송 사슬에서 양성자 펌핑 활성의 평형과 F를 통한 양성자 흐름에서 파생됩니다. 1/FO ATP 신디사이저. 이들은 모두 ATP8,9에대한 ADP의 산소 의존성 인산화에 대해 (유전자 발현 및 기질 가용성에 따라 다름)이 요구된다. 미토콘드리아 구획의 전기적 성전성을 활용하여, ΔΘm을 측정하기 위해 다양한 전위성 염료가 개발되었습니다. 그 중 하나는 테트라메틸호다민 메틸에스테르 과염소산염(TMRM)으로, 이는 조혈줄기 및 전구세포(11)를포함하는 다양한 세포에서 유세포분석에 의해 ΔΔm을 측정하는데 광범위하게 사용되고 있다.
미토콘드리아 염료는 이러한 세포의 엑세바이오틱 액피펌프의 높은 활성이 염료 압출(12)을 초래할 수 있기때문에, HSC에서 몇 가지 주의를 기울여 사용해야 한다. 실제로, 로다민 123과 같은 미토콘드리아 염료의 압출은 연구원이 HSCs13을 격리하거나 염료 Hoechst Blue 및 Hoechst Red14의 차동 압출을 이루에 의해 HSC "측군수"를 식별할 수 있게 해 주었습니다. 도 15. 또한 FUmitremorgin C, ATP 결합 카세트 하위 패밀리 G 부재 2 (ABCG2) 수송의 특정 차단제, HSPC16에서미토 트래커의 염색 패턴에 영향을미치지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과의 출판 후, 여러 연구는 xenobiotic 유출 펌프 억제제의 부재에 미토콘드리아 염료를 사용하여 수행되었다, HSC는 낮은 Δm 16미토콘드리아의 소수만 가지고 있다는 광범위한 인상으로 이어지는 , 17세 , 18.
그러나 최근에는, 프럭스 펌프의 광범위한 스펙트럼 억제제인 베라파밀이 미토콘드리아 염료 미토트래커 그린(MitoTracker Green)의 염색 패턴을 현저하게 수정한다는 것이 입증되었다. 이러한 불일치는 Fumitremorgin C가 Abcg2에 대해 매우 선택적이라는 사실 로 인한 것일 수 있으며, HSC는 또한 Abcb1a (Fumitremorgin C에 약하게 민감함)와 같은 다른 운송업체를 표현합니다19. 우리는 또한 다른 미토 콘 드리 아 염 염 염, TMRM 등, Nonyl 아크리딘 오렌지, 그리고 미토 트래커 오렌지 (MTO) 미토 트래커 그린과 동일한 패턴을 전시. 더 중요한 것은, 우리는 HSPC의 유동 세포 측정 패턴이 미토콘드리아 질량11이외에 그들의 ΔΘm을 반영한다는 것을 관찰했습니다.
TMRM 염료의 섭취는 엄격하게 미토콘드리아의 음전하에 따라 달라지지만, 그 결과 로 인한 염료 축적은 efflux 펌프20에의한 섭취와 클리어런스 사이의 일정한 균형입니다. HSC와 성숙한 세포 집단 사이의 xenobiotic 유출 펌프 발현의 차이는 이 균형에 영향을 미치고 편향된 결과로 이끌어 낼 수 있습니다. Verapamil과 같은 전용 억제제의 사용은 전위성 염료에 의한 ΔΘm의 분석에서 고려되어야 합니다. 여기에서 우리는 전용 억제제의 사용을 통해 xenobiotic 수송기 활동을 정정하는 TMRM 기지를 둔 유량 세포측정에 의하여 정확한 ΔΘm 측정을 위한 수정된 프로토콜을 기술합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3e-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0031-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD48-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0481-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD135-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1351-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150-PerCP/Cy5.5&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-kit-APC/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporin H</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1575-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr1-biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-5790-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Il7R&#945;-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1271-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nk1.1-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca-1-PE/Cy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF murine</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>250-03-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM medium</td>
			<td>STEMCELL technologies</td>
			<td>9605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Pacific Blue</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5428-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-14-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>V4629-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps

세포 대사가 조혈 줄기 세포 (HSC) 자기 갱신의 중요한 레귤레이터이기 때문에, 조혈 항상성에서 미토콘드리아가 하는 다양한 역할은 HSC 연구원에 의해 광범위하게 연구되었습니다. 미토콘드리아 활성 수준은 TMRM(테트라메틸라호다민, 메틸 에스테르)과 같은 세포-식양이온염료로 측정할 수 있는 막 전위(ΔΘm)에 반영됩니다. 그러나 세포에서 이러한 염료를 돌출하는 유출 펌프의 능력은 그 유용성을 제한할 수 있습니다. xenobiotic 수송기는 분화한 세포에서 보다는 HSC에 있는 발현 그리고 활동의 상부를 전시하기 때문에 결과 측정 편향은 HSC를 평가할 때 특히 중요합니다. 여기에서는 여러 골수 집단에서 ΔΘm을 정확하게 측정하기 위해 유출 펌프 억제제인 Verapamil을 활용하는 프로토콜을 설명합니다. 펌프 활동의 결과 억제는 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)에서 TMRM 강도를 증가시키는 것으로 나타났으며 성숙한 분획에서 상대적으로 변하지 않은 채로 남습니다. 이것은 ΔΘm 의존염료가 사용될 때 요구되는 염료-유출 활동에 주의를 강조하고, 서면 및 시각화될 때, 이 프로토콜은 골수 내의 다른 인구, 또는 동일 인구를 정확하게 비교하기 위하여 이용될 수 있습니다 다양한 실험 모델에 걸쳐.

위에서 설명한 프로토콜을 사용하면 마우스 모델에서 BM-MNIC를 쉽게 격리할 수 있습니다. 그림 1은 프로토콜의 주요 단계를 요약합니다: 골수 분리, 골수에서 플러시, 적혈구 포리해, 및 항체 염색 다음에 TMRM 염색은 특정 조혈 집단에서 미토콘드리아 막 전위를 측정하기 위해 .
BM-MNIC는 HSC를 포함하여 몇몇 세포 인구를 포함합니다. 이 프로토콜에 사용되?...

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Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

Xenobiotic efflux 펌프는 조혈 줄기와 전구 세포 (HSPC)에서 매우 활성화되어 미토콘드리아 막 잠재적 형광 염료인 TMRM의 압출을 유발합니다. 여기서, 우리는 유출 펌프 억제제인 Verapamil의 존재 에 있는 TMRM에 의하여 HSPC에 있는 미토콘드리아 막 전위를 정확하게 측정하는 프로토콜을 제시합니다.

에플로프 펌프 억제를 통해 조혈 줄기 및 전조 세포에서 미토콘드리아 막 전위성 유동 세포 측정 평가의 정확도 향상

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

미토콘드리아 기능은 조혈 줄기 세포 자체 재생에 매우 중요합니다. 미토콘드리아 활성은 내부 미토콘드리아 막 전위의 반사약으로, 이는 세포 형광, 세포-퍼큐릭 양이온염인 TMRM에 의해 측정될 수 있다. 제노바이오틱 efflux 펌프는 HSC에서 매우 활발하며 TMRM 압출을 유발합니다.이 프로토콜의 주요 장점은, 베라파밀, efflux 펌프의 억제제를 활용, 이 효과의 보정이다. 마우스 대퇴골에서 골수를 격리하여 시작합니다. 두 개의 후방 발을 잘라 집게와 날카로운 가위를 사용합니다.그런 다음 마우스의 복부 피부에 작은 스니핑을하고 스트레칭합니다. 대퇴골과 경골을 추출하고 대퇴골의 머리를 빼내지 않도록 주의하면서 뼈를 염색 버퍼 1.5 밀리리터로 채워진 6웰 플레이트에 놓습니다. 뼈에서 근육을 제거하고 뼈의 끝을 잘라 골수가 빠져 나갈 수 있도록합니다.1.5 밀리리터의 염색 버퍼로 청소된 뼈를 새 우물에 놓습니다. 그런 다음 뼈가 흰색이 될 때까지 3 밀리리터 주사기와 25 게이지 바늘로 골수를 내뿜습니다. 1.5 밀리리터 튜브에 있는 모든 세포를 수집하고, 180회 G에서 5분 동안 원심분리한 다음, 상퍼를 폐기하십시오.조심스럽게 얼음 차가운 ACK 용해 버퍼의 300 마이크로 리터에 펠릿을 다시 중단하고, 1 분 동안 얼음에 세포를 넣어. 그런 다음 염색 버퍼의 밀리리터 1밀리리터를 추가하여 즉시 리시스를 비활성화합니다. 180회 G.Resuspend에서 5분 동안 세포를 원심분리하여, 이는 염색 버퍼의 1밀리리터에서 흰색으로 나타나야 합니다.세포 스트레이너 캡을 사용하여 세포를 필터링하고 35 마이크로미터 나일론 메쉬를 사용하여 단핵 세포를 얻습니다. 계보 칵테일을 준비하는 것으로 시작하며, 원고 의 지시에 따라 형광소가 항체를 연상시니다. 항체를 얼음 위에 보관하고 빛으로부터 보호합니다.그런 다음 180회 G에서 5분간 시료를 원심분리하고 상체부를 폐기합니다. 리니지 칵테일의 400 마이크로리터와 CD135 바이오티니드 항체 의 4마이크로리터를 세포 펠릿에 추가하고 혼합물을 소용돌이시다. 그런 다음 30 분 동안 얼음에 배양하십시오.인큐베이션 후, 염색 버퍼의 3 밀리리터를 추가하고, 180회 G에서 5분간 회전하고, 상체를 폐기하여 샘플을 세척합니다. 그런 다음 항체 용액의 400 마이크로 리터를 추가하고 혼합물을 소용돌이시다. 얼음에 30분 간 배양하고 염색 버퍼로 세척을 반복합니다.TMRM 염색 용액을 준비하려면 혈청이 없는 혈청 프리 조혈 배양 배지의 1.1 밀리리터에 2.2 마이크로리터의 TMRM 스톡 솔루션과 1.1 마이크로리터를 혈전포이에틴 및 줄기 세포 인자를 첨가하십시오. TMRM 염색 용액의 1 밀리리터에서 골수를 다시 중단하고, 빠르게 소용돌이를 하고, 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 35 마이크로미터 나일론 메쉬를 사용하여 체료를 필터링하여 유동 세포계를 막히는 것을 방지합니다.그런 다음 DAPI의 마이크로 리터 를 추가하고 흐름 세포 측정을 진행합니다. 골수 샘플을 실행하고 적어도 백만 이벤트를 수집합니다. 그런 다음 살아있는 골수 단핵 세포를 태평양 파란색 플롯에 표시하여 CD135 Lin-negative 및 Lin 양성 분획을 식별합니다.APC/Cy7 대 PE/Cy7에 대한 린 음성 분획을 플롯하여 다능성 선조 또는 MPP 분획을 식별합니다. 그런 다음 APC 대 PerCP/Cy5.5에 대한 MPP 분획을 플롯하여 조혈 줄기 세포 또는 HSC 분획을 식별합니다. FITC 또는 CD34에 대한 HSC 분획을 표시하여 CD34 음수 HSC 및 CD34 양수 HSC 분획으로 나눕니다.마지막으로 각 모집단에서 TMRM 강도를 획득합니다. TMRM 염색이 올바르게 작동하는지 확인하려면 샘플에 FCCP 마이크로리터 1개를 추가하고 1 밀리머의 최종 농도를 위해 5분 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 그런 다음 백만 개의 이벤트를 획득합니다.FCCP가 추가된 후 TMRM 강도를 크게 늘려야 합니다. 이 프로토콜은 TMRM 염료를 사용하여 다양한 세포 집단에서 미토콘드리아 막 전위를 정량화하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 배양 배지에서 PBS와 FBS의 존재가 TMRM 신호 강도에 영향을 미친다는 것이 입증되었습니다.따라서 혈청없는 확장 매체에서 TMRM 염색을 수행하는 것이 중요합니다. 조혈 줄기 세포는 TMRM 염료를 돌출하는 xenobiotic efflux 펌프의 높은 활동 수준을 표현합니다. 따라서 TMRM 프로파일은 펌프를 차단하는 베라파밀 또는 사이클로스포린 H의 존재에도 다릅니다.TMRM 염색의 정확도를 확인하기 위해 FCCP는 미토콘드리아를 탈극화하고 TMRM 강도를 감소시킬 수 있습니다. 이 프로토콜은 TMRE 또는 JC-1을 포함하여 다른 미토콘드리아 막 잠재적 염료로 HSC를 연구하기 위해 쉽게 적응될 수 있습니다. 뿐만 아니라 미토트래커 또는 미토삭스와 같은 다른 미토콘드리아 염료.골수 인구 중 efflux 펌프의 다른 활동에 의해 상속 된 중요한 문제는 최근에 지적되었다. 따라서 이 프로토콜은 이전 결과 간의 불일치를 줄이기 위한 것입니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

태반에서 조혈 줄기 세포의 분리 및 분석

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

연구

생물학

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral - 중재 최저 동안 예 VIVO</em인간 조혈 줄기 세포의> 적혈구 조혈

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

RNA 시퀀싱 분석하여 EML 조혈 전구체 세포의자가 재생 (self-renewal)과 분화를 조절하는 중요한 요소의 식별

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

유세포측정에 의한 조혈줄기세포 및 T세포의 미토콘드리아 질량 및 막 전위 측정

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

세포외 플럭스 분석기를 사용한 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포의 세포 생체 에너지 평가

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

In Vivo Inhibition, Immunofluorescence 및 Flow Cytometry를 이용한 정자 세포 내 Kinesin-7 CENP-E의 기능 평가

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...