Name: improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps
Uploaded: 2019-07-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of

Авторы благодарят всех членов лаборатории Ито, особенно K Ито и H Sato, и Институт стволовых клеток Эйнштейна за комментарии и Эйнштейна потока Цитометрии и аналитической визуализации основных объектов (финансируется Национальным институтом рака грант P30 CA013330) для помочь проводить эксперименты. K.I. поддерживается грантами Национальных институтов здравоохранения (R01DK98263, R01DK115577 и R01DK100689) и Департамента здравоохранения штата Нью-йорк в качестве основного директора одноклеточной геномики Эйнштейна/Эпигеномики (C029154). К.И. Ито является научным сотрудником Общества лейкемии и лимфомы.

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Медицинского колледжа Альберта Эйнштейна.
1. Подготовка решений
<ol><li>Окрашивающий буфер (фосфат-буферный солен (PBS) - 2% сыворотки крупного рогатого скота пло?...

<ol>
	<li>Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+progenitor+cells:+origins,+phenotypes,+lineage+commitments,+and+transdifferentiations.">Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).</li><li>Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+stem+cell+biology.">Regulatory mechanisms in stem cell biology.</a> Cell. 88 (3), 287-298 (1997).</li><li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li><li>Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell:+keystone+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+and+a+stepping-stone+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine.</a> Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).</li><li>Ito, K., Bonora, M., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+as+master+of+hematopoietic+stem+cell+fate.">Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate.</a> International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+a+purified+Tie2++hematopoietic+stem+cell+population+relies+on+mitochondrial+clearance.">Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance.</a> Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).</li><li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthesis+and+storage.">ATP synthesis and storage.</a> Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).</li><li>Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+catalysis+in+ATP+synthase.">The regulation of catalysis in ATP synthase.</a> Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).</li><li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment.">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li><li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+efflux+studies+suggest+that+hematopoietic+stem+cells+expressing+low+or+undetectable+levels+of+CD34+antigen+exist+in+multiple+species.">Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species.</a> Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).</li><li>Spangrude, G. J., Johnson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+and+activated+subsets+of+mouse+multipotent+hematopoietic+stem+cells.">Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).</li><li>Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABCG2+transporter+is+an+efficient+Hoechst+33342+efflux+pump+and+is+preferentially+expressed+by+immature+human+hematopoietic+progenitors.">The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors.</a> Blood. 99 (2), 507-512 (2002).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+transporter+Bcrp1/ABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype.">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, 13125 (2016).</li><li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress.">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+imaging+of+mitochondrial+structure+and+function+during+acute+kidney+injury.">In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury.</a> Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cyclophilin+with+the+mitochondrial+inner+membrane+and+regulation+of+the+permeability+transition+pore,+and+cyclosporin+A-sensitive+channel.">Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance.">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).</li></ol>

Измерение потенциала митохондриальной мембраны является краеугольным камнем анализа и оценки митохондрий, которые имеют решающее значение для метаболического состояния клетки. Здесь мы описываем протокол для анализа ам по окрашиванию TMRM. TMRM является клеточной люминесцентной красит...

Гематопоитические стволовые клетки (ГСК) являются самообновляющимися, мультимощными и способными дать начало всем клеткам крови1,2. Клеточный метаболизм является ключевым регулятором обслуживания HSC, наряду с транскрипционнымифакторами, интродуциальными сигналами и микросредой 3,4,5. Надлежащий контроль митохондриальной функции и качества, следовательно, имеет решающее значение для hSC обслуживания6,7.
Митохондриальный мембранный потенциал (ЗМ) является ключевым параметром в оценке митохондрий, поскольку он непосредственно отражает их функциональность, которая вытекает из равновесия протонной насосной активности в цепочке транспортировки электронов и протонного потока через F 1/FO СПФ синтаза. Они оба необходимы (в зависимости от экспрессии генов и наличия субстрата) для кислородозависимого фосфорилирования ADP до АТФ8,9. Воспользовавшись электроотрицательностью митохондриального отсека, были разработаны различные потентиометрические красители для измерения м. Одним из них является тетраметилметилродамин метил-эфирпер перхлорат (TMRM), который широко используется для измерения цитометрии потока в различных клетках10, включая гематопоитический стебель и клетки-предтечи11.
Митохондриальные красители должны быть использованы с некоторой осторожностью в HSCs, однако, потому что высокая активность ксенобиотических насосов efflux этих клеток может привести к экструзии красителя12. Действительно, экструзия митохондриальных красителей, таких как родамин 123 позволило исследователям изолировать HSCs13 или определить HSC "побочных популяций", используя дифференциальной экструзии красителей Hoechst Blue и Hoechst Red14, 15. Было также показано, что Fumitremorgin C, конкретный блокировщик ATP-связывающей кассеты sub-family G member 2 (ABCG2) транспортер, не влияет на шаблон окрашивания MitoTracker в HSPCs16. После публикации этих результатов, несколько исследований были проведены с использованием митохондриальных красителей в отсутствие ингибиторов насоса ксенобиота, что привело к распространенному впечатлению, что HSCs имеют лишь небольшое количество митохондрий с низким , 17 Лет , 18.
Недавно было продемонстрировано, однако, что Verapamil, широкий спектр ингибитор efflux насосов, значительно изменяет окрашивающий шаблон митохондриальной краситель MitoTracker Green19. Это несоответствие, вероятно, связано с тем, что Фумитреморгин C является весьма избирательным для Abcg2, в то время как HSCs также выразить другие транспортеры, такие как Abcb1a (который только слабо чувствительны к Fumitremorgin C)19. Мы также сообщили, что другие митохондриальные красители, такие как TMRM, Nonyl acridine orange и Mitotracker Orange (MTO), демонстрируют те же модели, что и Mitotracker Green. Что еще более важно, мы заметили, что поток цитометрических моделей HSPCs отражают их йм в дополнение к митохондриальной массы11.
Потребление красителя TMRM строго зависит от отрицательного заряда митохондрий, но в результате накопления красителя находится в постоянном балансе между его потреблением и зазором на насосах efflux20. Разница в экспрессии насоса xenobiotic efflux между HSCs и возмужалыми популяциями клетки влияет на этот баланс и может вести к пристрастным результатам. Использование специальных ингибиторов, таких как Верапамил, должно быть рассмотрено при анализе «Мм» помощным красителям. Здесь мы описываем модифицированный протокол для точного измерения цитометрии потока на основе TMRM, который корректирует активность ксенобиотики переносчика с помощью специальных ингибиторов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3e-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0031-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD48-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0481-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD135-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1351-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150-PerCP/Cy5.5&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-kit-APC/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporin H</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1575-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr1-biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-5790-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Il7R&#945;-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1271-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nk1.1-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca-1-PE/Cy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF murine</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>250-03-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM medium</td>
			<td>STEMCELL technologies</td>
			<td>9605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Pacific Blue</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5428-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-14-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>V4629-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps

Поскольку клеточный метаболизм является ключевым регулятором самообновления гематопоитических стволовых клеток (HSC), различные роли, сыгранные митохондриями в гематопоиетическом гомеостазе, были широко изучены исследователями HSC. Уровни митохондриальной активности отражаются в их мембранных потенциалах ( им), которые могут быть измерены клеточными катионными красителями, такими как TMRM (тетраметилродамин, метил-эфир). Способность насосов efflux выдавливать эти красители из клеток может ограничить их полезность, однако. Результирующая смещение измерений особенно критично при оценке ГХК, так как ксенобиотические транспортеры обладают более высоким уровнем экспрессии и активности в ГХС, чем в дифференцированных клетках. Здесь мы описываем протокол, используя Verapamil, ингибитор насоса efflux, чтобы точно измерить м в различных популяциях костного мозга. В результате ингибирование активности насоса показано, что увеличение интенсивности TMRM в гематопоитических стволовых и прародителей клеток (HSPCs), оставляя его относительно неизменным в зрелых фракций. Это подчеркивает пристальное внимание к красителя-эффлюкс деятельности, которая требуется, когда йм-зависимых красителей используются, и, как написано и визуализированы, этот протокол может быть использован для точного сравнения либо различных популяций в костном мозге, или той же популяции различных экспериментальных моделей.

Описанный выше протокол позволяет легко обезобрать БМ-МНК от мышиной модели. Рисунок 1 обобщает основные этапы протокола: костная изоляция, промывка костного мозга, лизис красных кровяных телец и окрашивание антител с последующим окрашиванием TMRM для измерения потенциа...

Watch this Scientific Journal Video about Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of 

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

Насосы Xenobiotic efflux очень активны в гематопоитических стволовых и прародителей (HSPCs) и вызывают экструзию TMRM, митохондриальной мембраны потенциал флуоресцентного красителя. Здесь мы представляем протокол для точного измерения митохондриального мембранного потенциала в HSPCs TMRM в присутствии Verapamil, ингибитор насоса efflux.

Улучшение точности потока цитометрической оценки митохондриальной Мембраны потенциал в гематопоитических стволовых и прародителей клеток через ингибирование Efflux насосов

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Митохондриальная функция имеет решающее значение для гематопоэтического обновления стволовых клеток. Митохондриальная активность является отражателем внутреннего митохондриального мембранного потенциала, который может быть измерен TMRM, клеточным флуоресцентным, клеточным катионическим красителем. Ксенобиотические насосы эффлюкса очень активны в HSC, и вызывают экструзию TMRM.Основным преимуществом этого протокола является коррекция этого эффекта, используя Verapamil, ингибитор насосов эффлюкса. Начните с изоляции костного мозга от бедренной кости мыши. Используйте пару типсов и острые ножницы, чтобы сократить две задние лапы.Затем сделайте небольшой фрагмент в брюшной коже мыши, и растянуть его. Извлекайте бедренную кость и голени, при этом заботясь, чтобы не выбить головы бедренной кости, и поместите кости в шести-хорошо пластины, наполненные 1,5 миллилитров окрашивания буфера. Удалить мышцы из костей, и сократить концы костей, что позволяет костного мозга, чтобы выйти.Поместите очищенные кости в новые колодцы, с 1,5 миллилитров окрашивания буфера. Затем вымоййте костный мозг с помощью трехмилилитрового шприца и иглы 25 калибра, пока кость не станет белой. Соберите все клетки в 1,5 миллилитровую трубку, и центрифуга их в течение пяти минут при 180 раз G, а затем отказаться от супернатанта.Тщательно повторно помесить гранулы в 300 микролитров ледяной ACK лизай буфера, и положить клетки на лед в течение одной минуты. Затем немедленно деактивировать лиз, добавив один миллилитр окрашивания буфера. Центрифуга клеток в течение пяти минут в 180 раз G.Resuspend ячейки гранулы, которые должны появиться белые, в один миллилитр окрашивания буфера.Фильтр клетки с помощью крышки ситечко клетки, с 35 микрометровой нейлоновой сеткой, чтобы получить моноядерные клетки. Начните с подготовки линии коктейль, и флюорофор конъюгированных антител, в соответствии с рукописными указаниями. Держите антитела на льду, и защищены от света.Затем центрифуга образец в течение пяти минут при 180 раз G, и отказаться от супернатанта. Добавьте 400 микролитров коктейля линии и четыре микролитера биотинилированных антител CD135 в клеточные гранулы и вихревые смеси. Затем инкубировать его на льду в течение 30 минут.После инкубации, мыть образец, добавив три миллилитров окрашивания буфера, спиннинг его вниз в течение пяти минут при 180 раз G, и отбрасывая супернатант. Затем добавьте 400 микролитров раствора антител и вихрем смеси. Инкубировать его на льду еще 30 минут, и повторить мыть с окрашивания буфера.Для приготовления раствора окрашивания ТМРМ добавьте 2,2 микролитера раствора TMRM и 1,1 микролитров Verapamil к 1,1 миллилитров безотхвисточной гематопоэтической культуры среднего, с тромбопоэтиным и стволовым клеточным фактором. Переподходить костный мозг в один миллилитр раствора окрашивания TMRM, вихрь быстро, и инкубировать в течение одного часа при 37 градусов по Цельсию. Фильтр образца с помощью крышки ситечко клетки, с 35 микрометровой нейлоновой сеткой, чтобы избежать засорения цитометра потока.Затем добавьте один микролитер DAPI и приступайте к цитометрии потока. Вы запустите образец костного мозга, и приобрести по крайней мере один миллион событий. Затем отобразите живые моноядерные клетки костного мозга в участке для тихоокеанского синего цвета, чтобы определить CD135 Lin-отрицательные и лин-положительные фракции.Участок Lin-отрицательная фракция для APC/Cy7 против PE/Cy7 для определения мультипотентного прародителя или фракции MPP. Затем вырисуй фракцию MPP для APC против PerCP/Cy5.5, чтобы определить гематопоэтическую стволовую клетку или фракцию HSC. Отображение фракции HSC для FITC, или CD34, чтобы разделить ее на CD34 отрицательных HSC и CD34 положительных фракций HSC.Окончательно приобретайте интенсивность TMRM в каждой населенности. Чтобы Окрашивание ТМР работало правильно, добавьте в образец один микролитр FCCP для окончательной концентрации одного миллимолара и инкубировать его при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Затем приобрети миллион событий.После добавления FCCP интенсивность ТМРМ должна быть резко увеличена. Этот протокол был успешно использован для количественной оценки митохондриального мембранного потенциала в различных популяциях клеток, с красителем TMRM. Было продемонстрировано, что присутствие PBS и FBS в культурной среде влияет на интенсивность сигнала TMRM.Поэтому важно выполнять Окрашивание TMRM в среде расширения без сыворотки. Гематопоэтические стволовые клетки выражают высокий уровень активности ксенобиотических насосов эффлюкса, которые выдавляют краситель TMRM. Профили TMRM также различаются в присутствии Verapamil или Cyclosporin H, которые блокируют насосы.Чтобы проверить точность окрашивания TMRM, FCCP может быть деполяризировать митохондрии, и уменьшить интенсивность TMRM. Этот протокол может быть легко адаптирован для изучения HSC с различными митохондриальной мембраны потенциального красителя, в том числе TMRE или JC-1. А также другие митохондриальные красители, такие как MitoTracker или MitoSOX.Критические вопросы, унаследованные различной активностью эффлюкс насосов среди популяции костного мозга было отмечено совсем недавно. Таким образом, этот протокол направлен на сокращение расхождения между предыдущими выводами.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Выделение и анализ гемопоэтических стволовых клеток из плаценты

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Проточной цитометрии Очистка мыши мейоза клетки

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Лентивирусов-опосредованной Нокдаун В Ex Vivo Эритропоэз прав гемопоэтических стволовых клеток

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Фенотипический анализ и выделение мышей гемопоэтических стволовых клеток и Lineage, совершенных прародителей

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Определение ключевых факторов, регулирующих самообновлению и дифференцировке в EML гемопоэтических клеток-предшественников по РНК секвенирования анализа

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Одновременное измерение митохондриальной кальция и митохондриальной мембраны Потенциал в живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Измерение митохондриальной массы и мембранного потенциала в гематопоитических стволовых клетках и Т-клетках по цитометрии потока

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Оценка клеточной биоэнергетики в гемопоэтических стволовых клетках мыши и примитивных клетках-предшественниках с помощью анализатора внеклеточного потока

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Функциональная оценка кинезина-7 CENP-E в сперматоцитах с использованием ингибирования, иммунофлюоресценции и проточной цитометрии in vivo

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...