Name: improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps
Uploaded: 2019-07-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of

Los autores agradecen a todos los miembros del laboratorio Ito, especialmente K Ito y H Sato, y al Instituto de Células Madre Einstein por sus comentarios y a las instalaciones básicas de Citometría e Imágenes Analíticas de Einstein Flow (financiadas por el Instituto Nacional del Cáncer P30 CA013330) ayudar a llevar a cabo los experimentos. K.I. cuenta con el apoyo de subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R01DK98263, R01DK115577 y R01DK100689) y del Departamento de Salud del Estado de Nueva York como Director Principal de Genómica/Eyómica de Células Simples de Einstein (C029154). K.I. Ito es un estudioso de investigación de la Sociedad de Leucemia y Linfoma.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Albert Einstein College of Medicine.
1. Preparación de soluciones
<ol><li>Tampón de tinción (solución salina tamponada con fosfato (PBS) + 2% de suero bovino fetal (FBS)): Añadir 10 ml de FBS en 500 ml de una solución estéril de PBS. NOTA: Esta solución se puede almacenar a 4 oC durante al menos un mes en estado estéril. Antes de iniciar los...

<ol>
	<li>Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+progenitor+cells:+origins,+phenotypes,+lineage+commitments,+and+transdifferentiations.">Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).</li><li>Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+stem+cell+biology.">Regulatory mechanisms in stem cell biology.</a> Cell. 88 (3), 287-298 (1997).</li><li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li><li>Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell:+keystone+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+and+a+stepping-stone+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine.</a> Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).</li><li>Ito, K., Bonora, M., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+as+master+of+hematopoietic+stem+cell+fate.">Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate.</a> International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+a+purified+Tie2++hematopoietic+stem+cell+population+relies+on+mitochondrial+clearance.">Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance.</a> Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).</li><li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthesis+and+storage.">ATP synthesis and storage.</a> Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).</li><li>Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+catalysis+in+ATP+synthase.">The regulation of catalysis in ATP synthase.</a> Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).</li><li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment.">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li><li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+efflux+studies+suggest+that+hematopoietic+stem+cells+expressing+low+or+undetectable+levels+of+CD34+antigen+exist+in+multiple+species.">Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species.</a> Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).</li><li>Spangrude, G. J., Johnson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+and+activated+subsets+of+mouse+multipotent+hematopoietic+stem+cells.">Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).</li><li>Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABCG2+transporter+is+an+efficient+Hoechst+33342+efflux+pump+and+is+preferentially+expressed+by+immature+human+hematopoietic+progenitors.">The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors.</a> Blood. 99 (2), 507-512 (2002).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+transporter+Bcrp1/ABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype.">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, 13125 (2016).</li><li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress.">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+imaging+of+mitochondrial+structure+and+function+during+acute+kidney+injury.">In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury.</a> Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cyclophilin+with+the+mitochondrial+inner+membrane+and+regulation+of+the+permeability+transition+pore,+and+cyclosporin+A-sensitive+channel.">Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance.">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).</li></ol>

La medición del potencial de la membrana mitocondrial es una piedra angular del análisis y evaluación de las mitocondrias, que son críticas para el estado metabólico de la célula. Aquí, describimos un protocolo para el análisis de la tinción de TMRM. TMRM es un tinte fluorescente permeado por células que se acumula en las mitocondrias activas debido a los compartimentos extracelulares, citoplasmáticos y mitocondriales10. Este protocolo se puede adaptar para varios colorantes, incluyendo...

Las células madre hematopoyéticas (HSC) son auto-renovadas, multipotentes, y capaces de dar lugar a todas las células de la sangre1,2. El metabolismo celular es un regulador clave del mantenimiento de HSC, juntocon factores transcripcionales, señales intrínsecas y el microambiente 3,4,5. Por lo tanto, el control adecuado de la función y la calidad mitocondriales es fundamental para el mantenimiento de HSC6,7.
El potencial de la membrana mitocondrial es un parámetro clave en la evaluación de las mitocondrias, ya que refleja directamente su funcionalidad, que deriva del equilibrio de la actividad de bombeo de protones en la cadena de transporte de electrones y el flujo de protones a través de F 1/FO ATP sintasa. Ambos son necesarios (dependiendo de la expresión génica y la disponibilidad del sustrato) para la fosforilación dependiente del oxígeno de ADP a ATP8,9. Aprovechando la electronegatividad del compartimiento mitocondrial, se han desarrollado varios colorantes potenciométricos para medir el sistema. Uno de ellos es el perclorato de éster metílico de tetrametilrhodamina (TMRM), que se ha utilizado ampliamente para medir la citometría de flujo en una variedad de células10,incluyendo el tallo hematopoyético y las células progenitoras11.
Los tintes mitocondriales deben utilizarse con cierta precaución en los HSC, sin embargo, porque la alta actividad de las bombas de eflujo xenobiótico de estas células puede dar lugar a la extrusión de tinte12. De hecho, la extrusión de tintes mitocondriales como Rhodamine 123 ha permitido a los investigadores aislar los HSC13 o identificar las "poblaciones laterales" de HSC explotando la extrusión diferencial de los tintes Hoechst Blue y Hoechst Red14, 15. También se ha demostrado que Fumitremorgin C, un bloqueador específico del transportador de la subfamilia G de casete de unión ATP G (ABCG2), no afecta al patrón de tinción de MitoTracker en HSPCs16. Después de la publicación de estos resultados, se realizaron múltiples estudios utilizando desies mitocondriales en ausencia de inhibidores de la bomba de eflujo xenobiótico, lo que llevó a la impresión generalizada de que los HSC tienen sólo un pequeño número de mitocondrias conbajo , 17 , 18.
Recientemente, se demostró, sin embargo, que Verapamil, un inhibidor de amplio espectro de bombas de eflujo, modifica significativamente el patrón de tinción del tinte mitocondrial MitoTracker Green19. Esta discrepancia es probablemente debido al hecho de que Fumitremorgin C es altamente selectivo para Abcg2, mientras que los HSC también expresan otros transportadores como Abcb1a (que sólo es débilmente sensible a Fumitremorgin C)19. También hemos informado de que otros colorantes mitocondriales, como TMRM, Naranja acridina Nonyl y Naranja Mitotracker (MTO) exhiben los mismos patrones que Mitotracker Green. Lo que es más importante, hemos observado que los patrones citométricos de flujo de los HSCCP reflejan su m, además de la masa mitocondrial11.
La ingesta de tinte TMRM depende estrictamente de la carga negativa de las mitocondrias, pero la acumulación resultante de tinte está en equilibrio constante entre su ingesta y el aclaramiento por las bombas de eflujo20. La diferencia en la expresión de la bomba de eflujo xenobiótico entre los HSC y las poblaciones de células maduras afecta este equilibrio y puede conducir a resultados sesgados. El uso de inhibidores específicos como Verapamil debe ser considerado en el análisis de los diques potenciométricos. Aquí describimos un protocolo modificado para la medición precisa de m-m por citometría de flujo basada en TMRM que corrige la actividad del transportador xenobiótico mediante el uso de inhibidores dedicados.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3e-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0031-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD48-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0481-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD135-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1351-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150-PerCP/Cy5.5&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-kit-APC/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporin H</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1575-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr1-biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-5790-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Il7R&#945;-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1271-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nk1.1-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca-1-PE/Cy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF murine</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>250-03-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM medium</td>
			<td>STEMCELL technologies</td>
			<td>9605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Pacific Blue</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5428-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-14-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>V4629-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps

Como el metabolismo celular es un regulador clave de la auto-renovación de células madre hematopoyéticas (HSC), los diversos papeles desempeñados por las mitocondrias en la homeostasis hematopoyética han sido ampliamente estudiados por los investigadores de HSC. Los niveles de actividad mitocondrial se reflejan en sus potenciales de membrana ( , que se pueden medir mediante colores catiónicos persignificados por células como TMRM (tetrametilrhodamina, éster metílico). Sin embargo, la capacidad de las bombas de eflujo para extruir estos tendededores de las células puede limitar su utilidad. El sesgo de medición resultante es particularmente crítico al evaluar los HSC, ya que los transportadores xenobióticos presentan niveles más altos de expresión y actividad en los HSC que en las células diferenciadas. Aquí, describimos un protocolo que utiliza Verapamil, un inhibidor de la bomba de eflujo, para medir con precisión a través de múltiples poblaciones de médula ósea. Se ha demostrado que la inhibición resultante de la actividad de la bomba aumenta la intensidad de la TMRM en las células hematopoyéticas del tallo y del progenitor (HSPC), mientras que la deja relativamente sin cambios en fracciones maduras. Esto pone de relieve la atención cercana a la actividad de colorante-eflujo que se requiere cuando se utilizan tintes dependientes de la m, y según lo escrito y visualizado, este protocolo se puede utilizar para comparar con precisión diferentes poblaciones dentro de la médula ósea, o la misma población en diferentes modelos experimentales.

El protocolo descrito anteriormente permite el fácil aislamiento de los BMC de un modelo de ratón. La Figura 1 resume los principales pasos del protocolo: aislamiento óseo, eliminación de la médula ósea, lisis de glóbulos rojos y tinción de anticuerpos seguida de tinción TMRM para medir el potencial de la membrana mitocondrial en una población hematopoyética específica .
Los BM-MNC contienen varias poblaciones celulares, incluyendo HSCs. Los cócteles ...

Watch this Scientific Journal Video about Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of 

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

Las bombas de eflujo xenobiótico son muy activas en células hematopoyéticas madre y progenitoras (HSCCP) y causan extrusión de TMRM, un tinte fluorescente potencial de membrana mitocondrial. Aquí, presentamos un protocolo para medir con precisión el potencial de la membrana mitocondrial en los HSCCP por TMRM en presencia de Verapamil, un inhibidor de la bomba de eflujo.

Mejorar la precisión de la evaluación citométrica de flujo del potencial de la membrana mitocondrial en células hematopoyéticas de tallo y progenitor a través de la inhibición de las bombas de eflujo

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

La función mitocondrial es fundamental para la autoexaprobación de células madre hematopoyéticas. La actividad mitocondrial es un reflector del potencial interno de la membrana mitocondrial, que puede medirse mediante TMRM, un colorante catiónico fluorescente celular y permeante. Las bombas de eflujo xenobiótico son altamente activas en HSC y causan extrusión TMRM.La principal ventaja de este protocolo, es la corrección de este efecto, utilizando Verapamil, un inhibidor de las bombas de eflujo. Comience por aislar la médula ósea de los fémures de ratón. Usa un par de fórceps y tijeras afiladas para cortar las dos patas posteriores.Luego haz un pequeño recorte en la piel ventral del ratón, y estírala. Extraiga el fémur y la tibia, teniendo cuidado de no desalojar las cabezas del fémur, y coloque los huesos en una placa de seis pozos, llena de 1,5 mililitros de tampón de tinción. Retire los músculos de los huesos y corte los extremos de los huesos, permitiendo que la médula ósea salga.Coloque los huesos limpios en pozos nuevos, con 1,5 mililitros de tampón de tinción. Luego, enjuague la médula ósea con una jeringa de tres mililitros y una aguja de calibre 25, hasta que el hueso se vuelva blanco. Recoger todas las células en un tubo de 1,5 mililitros, y centrifugarlas durante cinco minutos a 180 veces G, luego deseche el sobrenadante.Resuspender cuidadosamente el pellet en 300 microlitros de tampón de colorante ACK helado, y poner las células en hielo durante un minuto. A continuación, desactive inmediatamente la lysis añadiendo un mililitro de tampón de tinción. Centrifugar las células durante cinco minutos a 180 veces G.Resuspend el pellet celular, que debe aparecer blanco, en un mililitro de tampón de tinción.Filtrar las células utilizando una tapa de colador celular, con una malla de nylon de 35 micrómetros, para obtener células mononucleares. Comience preparando el cóctel de linaje y anticuerpos conjugados con fluoróforos, de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Mantenga los anticuerpos sobre hielo y protegidos de la luz.Luego, centrifuga la muestra durante cinco minutos a 180 veces G, y deseche el sobrenadante. Añadir 400 microlitros del cóctel de linaje, y cuatro microlitros de anticuerpos biotinilados CD135 al pellet celular, y vórtice la mezcla. Luego incubarlo sobre hielo durante 30 minutos.Después de la incubación, lave la muestra añadiendo tres mililitros de tampón de tinción, girando hacia abajo durante cinco minutos a 180 veces G, y descartando el sobrenadante. A continuación, agregue 400 microlitros de solución de anticuerpos y vórtice la mezcla. Incubarlo sobre hielo durante otros 30 minutos, y repetir el lavado con el tampón de tinción.Para preparar la solución de tinción TMRM, agregue 2,2 microlitros de solución de material TMRM, y 1,1 microlitros de Verapamil, a 1,1 mililitros de medio de cultivo hematopoyético sin suero, con trombopoyetina y factor de células madre. Resuspender la médula ósea en un mililitro de la solución de tinción TMRM, vórtice rápidamente e incubar durante una hora a 37 grados centígrados. Filtre la muestra con una tapa de colador celular, con una malla de nylon de 35 micrómetros, para evitar obstruir el citómetro de flujo.A continuación, agregue un microlitro de DAPI y proceda con la citometría de flujo. Ejecuta la muestra de médula ósea y adquiere al menos un millón de eventos. A continuación, muestre las células mononucleares de médula ósea viva en una gráfica para el azul pacífico, para identificar fracciones CD135 Lin-negativas y Lin-positivas.Trazar la fracción Lin-negativa para APC/Cy7 frente a PE/Cy7 para identificar el progenitor multipotente o la fracción MPP. A continuación, trace la fracción MPP para APC frente a PerCP/Cy5.5, para identificar la célula madre hematopoyética o la fracción HSC. Visualice la fracción HSC para FITC, o CD34, para dividirla en fracciones HSC negativas CD34 y HSC positivas CD34.Finalmente adquirir la intensidad TMRM en cada población. Para asegurarse de que la tinción TMRM funcionó correctamente, agregue un microlitro de FCCP a la muestra, para una concentración final de un milimolar, e incubarlo a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Luego adquiere un millón de eventos.Después de la adición de FCCP, la intensidad TMRM debe aumentarse drásticamente. Este protocolo se ha utilizado con éxito para cuantificar el potencial de la membrana mitocondrial en varias poblaciones celulares, con tinte TMRM. Se ha demostrado que la presencia de PBS y FBS en el medio de cultivo afecta a la intensidad de la señal TMRM.Por lo tanto, es importante realizar la tinción TMRM en un medio de expansión sin suero. Las células madre hematopoyéticas expresan altos niveles de actividad de bombas de eflujo xenobiótico que extruyen el tinte TMRM. Así que los perfiles TMRM también varían en presencia de Verapamil o Ciclosporina H, que bloquean las bombas.Para verificar la exactitud de la tinción TMRM, FCCP puede ser despolarizar las mitocondrias, y reducir la intensidad TMRM. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar HSC con un tinte potencial de membrana mitocondrial diferente, incluyendo TMRE o JC-1. Así como otros tintes mitocondriales como MitoTracker o MitoSOX.Los problemas críticos heredados por la diferente actividad de las bombas de eflujo entre la población de médula ósea se señalaron recientemente. Por lo tanto, este protocolo tiene como objetivo reducir la discrepancia entre los hallazgos anteriores.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Aislamiento y análisis de las células madre hematopoyéticas de la placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Investigación

Biología

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral mediada por derribo Durante Ex Vivo Eritropoyesis de las células estaminales hematopoyéticas

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Identificación de los factores clave que regula la auto-renovación y diferenciación de las células precursoras hematopoyéticas EML por análisis de secuenciación de ARN-

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Medición simultánea de calcio mitocondrial y mitocondrial potencial de membrana en células vivas por microscopía fluorescente

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Medición de la masa mitocondrial y el potencial de la membrana en células madre hematopoyéticas y células T por citometría de flujo

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Evaluación de la bioenergética celular en células madre hematopoyéticas de ratón y células progenitoras primitivas utilizando el analizador de flujo extracelular

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Evaluación funcional de la quinesina-7 CENP-E en espermatocitos mediante inhibición in vivo , inmunofluorescencia y citometría de flujo

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...