Name: improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps
Uploaded: 2019-07-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of

Författarna tackar alla medlemmar i Ito laboratorium, särskilt K Ito och H Sato, och Einstein Stem cell Institute for kommentarer och Einstein Flow Cytometry och analytiska Imaging Core faciliteter (finansierat av National Cancer Institute Grant P30 CA013330) för hjälp med att genomföra experimenten. K.I. stöds av bidrag från National Institutes of Health (R01DK98263, R01DK115577 och R01DK100689) och New York State Department of Health som Core Director för Einstein Single-cell Genomics/Epigenomics (C029154). K.I. Ito är en forsknings forskare i leukemi och lymfom samhället.

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av Albert Einstein College of Medicine.
1. beredning av lösningar
<ol><li>Färgbuffert (fosfatbuffrad saltlösning (PBS) + 2% fetalt bovint serum (FBS)): tillsätt 10 mL FBS i 500 mL av en steril PBS-lösning. Anmärkning: Denna lösning kan förvaras vid 4 ° c i minst en månad i sterilt skick. Innan du påbörjar följande procedurer, sätt en alikvot av d...

<ol>
	<li>Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+progenitor+cells:+origins,+phenotypes,+lineage+commitments,+and+transdifferentiations.">Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).</li><li>Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+stem+cell+biology.">Regulatory mechanisms in stem cell biology.</a> Cell. 88 (3), 287-298 (1997).</li><li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li><li>Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell:+keystone+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+and+a+stepping-stone+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine.</a> Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).</li><li>Ito, K., Bonora, M., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+as+master+of+hematopoietic+stem+cell+fate.">Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate.</a> International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+a+purified+Tie2++hematopoietic+stem+cell+population+relies+on+mitochondrial+clearance.">Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance.</a> Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).</li><li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthesis+and+storage.">ATP synthesis and storage.</a> Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).</li><li>Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+catalysis+in+ATP+synthase.">The regulation of catalysis in ATP synthase.</a> Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).</li><li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment.">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li><li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+efflux+studies+suggest+that+hematopoietic+stem+cells+expressing+low+or+undetectable+levels+of+CD34+antigen+exist+in+multiple+species.">Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species.</a> Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).</li><li>Spangrude, G. J., Johnson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+and+activated+subsets+of+mouse+multipotent+hematopoietic+stem+cells.">Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).</li><li>Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABCG2+transporter+is+an+efficient+Hoechst+33342+efflux+pump+and+is+preferentially+expressed+by+immature+human+hematopoietic+progenitors.">The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors.</a> Blood. 99 (2), 507-512 (2002).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+transporter+Bcrp1/ABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype.">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, 13125 (2016).</li><li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress.">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+imaging+of+mitochondrial+structure+and+function+during+acute+kidney+injury.">In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury.</a> Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cyclophilin+with+the+mitochondrial+inner+membrane+and+regulation+of+the+permeability+transition+pore,+and+cyclosporin+A-sensitive+channel.">Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance.">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).</li></ol>

Mitokondriell membran potentiell mätning är en hörnsten i analys och bedömning av mitokona, som är kritiska till det metabola tillståndet i cellen. Här beskriver vi ett protokoll för analys av ΔΨm av TMRM färgning. Tmrm är en cell-permenade fluorescerande färgämne som ackumuleras i aktiva mitokondrier på grund av ΔΨm, och dess respektive nivåer kvar i jämvikt mellan den extracellulära, cytoplasmiska och mitokondriell fack10. Detta protokoll kan anpassas för olika färgämnen, ...

Hematopoietiska stamceller (hscs) är självförnyande, multi-potent, och kan ge upphov till alla celler i blodet1,2. Cellulär metabolism är en viktig regulator av HSC underhåll, tillsammans med transkriptionella faktorer, inneboende signaler och mikromiljö3,4,5. En korrekt kontroll av mitokondriell funktion och kvalitet är därför kritisk till HSC-underhåll6,7.
Mitokondriell membran potential (ΔΨm) är en viktig parameter vid bedömningen av mitokondrien eftersom den direkt återspeglar deras funktion, som härrör från balansen i protonpumpningsaktiviteten i elektrontransportkedjan och protonflödet genom F 1/FO ATP-syntas. Dessa krävs båda (beroende på genuttryck och substrat tillgänglighet) för syre beroende fosforylering av ADP till ATP8,9. Med utnyttjande av elektronegativitet av mitokondriella facket, olika potentiometriska färgämnen har utvecklats för att mäta ΔΨm. En av dem är tetrametylrodamin metylester perklorat (tmrm), som har använts i stor utsträckning för att mäta ΔΨm av flödescytometri i en mängd celler10, inklusive hematopoietiska Stem och stamceller11.
Mitokondriella färgämnen måste användas med viss försiktighet i hscs, dock, eftersom den höga aktiviteten av xenobiotiska effluxpumpar av dessa celler kan resultera i färg extrudering12. Faktum är att extrudering av mitokondriella färgämnen som Rhodamine 123 har tillåtit forskare att isolera HSCs13 eller identifiera HSC "sida populationer" genom att utnyttja differential extrudering av färgämnen Hoechst blå och Hoechst röd14, 15. det har också visats att Fumitremorgin C, en specifik blockerare av den ATP-bindande kassett underfamiljen G member 2 (ABCG2) transportör, påverkar inte infärgning mönstret av MitoTracker i HSPCs16. Efter offentliggörandet av dessa resultat, flera studier utfördes med hjälp av mitokondriella färgämnen i avsaknad av xenobiotiska effluxpumpshämmare, vilket leder till det utbredda intrycket att hscs har endast ett litet antal av mitokondrier med låg ΔΨm16 , 17 , 18.
Nyligen, det visades dock att verapamil, en bredspektrum hämmare av effluxpumpar, signifikant ändrar infärgning mönstret av mitokondriella Dye MitoTracker grön19. Denna avvikelse är sannolikt på grund av det faktum att Fumitremorgin C är mycket selektiv för Abcg2, medan HSCs också uttrycka andra transportörer som Abcb1a (som endast svagt känslig för Fumitremorgin C)19. Vi har också rapporterat att andra mitokondriella färgämnen, såsom tmrm, nonyl akridin orange, och mitotracker orange (MTO) uppvisar samma mönster som mitotracker Green. Ännu viktigare, vi har observerat att flödet korsmönster av hspcs återspeglar deras ΔΨm utöver mitokondriell massa11.
Intaget av TMRM färg beror strikt på den negativa laddningen av mitokonbruen, men den resulterande ansamling av färgämne är i konstant balans mellan dess intag och clearance av efflux pumpar20. Skillnaden i xenobiotiska effluxpumpens uttryck mellan hscs och mogna cellpopulationer påverkar denna balans och kan leda till partiska resultat. Användning av särskilda hämmare såsom verapamil bör övervägas i analysen av ΔΨm av potentiometriska färgämnen. Här beskriver vi ett modifierat protokoll för noggrann ΔΨm mätning av TMRM-baserad flödescytometri som korrigerar för xenobiotisk transport verksamhet genom användning av dedikerade hämmare.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3e-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0031-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD48-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0481-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD135-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1351-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150-PerCP/Cy5.5&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-kit-APC/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporin H</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1575-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr1-biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-5790-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Il7R&#945;-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1271-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nk1.1-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca-1-PE/Cy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF murine</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>250-03-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM medium</td>
			<td>STEMCELL technologies</td>
			<td>9605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Pacific Blue</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5428-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-14-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>V4629-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps

Som cellulär metabolism är en viktig regulator av hematopoietisk stamcells (HSC) självförnyelse, de olika roller som spelas av mitokonbenerna i hematopoietisk homeostas har studerats utförligt av HSC forskare. Mitokondriella aktivitetsnivåer återspeglas i deras membran potentialer (ΔΨm), som kan mätas genom cell-permenade katjoniska färgämnen såsom TMRM (tetramethylrhodamine, metylester). Förmågan hos efflux pumpar att pressa dessa färgämnen från celler kan begränsa deras användbarhet, dock. Den resulterande mätningen bias är särskilt kritisk vid bedömningen av HSCs, eftersom xenobiotiska transportörer uppvisar högre uttrycks-och aktivitetsnivåer i HSCs än i differentierade celler. Här beskriver vi ett protokoll som utnyttjar verapamil, en effluxpumphämmare, för att exakt mäta ΔΨm över flera benmärgs populationer. Den resulterande hämning av pump aktivitet visas för att öka TMRM intensitet i hematopoietiska stamceller och stamceller (HSPCs), samtidigt som den är relativt oförändrad i mogna fraktioner. Detta belyser den nära uppmärksamhet på Dye-efflux aktivitet som krävs när ΔΨm-beroende färgämnen används, och som skriftliga och visualiseras, detta protokoll kan användas för att exakt jämföra antingen olika populationer i benmärgen, eller samma population olika experimentella modeller.

Protokollet som beskrivs ovan möjliggör enkel isolering av BM-MNCs från en musmodell. Figur 1 sammanfattar de viktigaste stegen i protokollet: Ben isolering, spolning ut ur benmärgen, röda blodkroppar lysis, och antikropps färgning följt av TMRM färgning för att mäta mitokondriell membran potential i en specifik hematopoietisk population .
BM-MNCs innehåller flera cellpopulationer, inklusive HSCs. De antikropps cocktails som används i detta protokoll ?...

Watch this Scientific Journal Video about Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of 

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

Xenobiotic effluxpumpar är mycket aktiva i hematopoietiska Stem och stamceller (HSPCs) och orsaka extrudering av TMRM, ett mitokondriellt membran potentiella fluorescerande färgämne. Här presenterar vi ett protokoll för att exakt mäta mitokondriell membran potential i HSPCs av TMRM i närvaro av verapamil, en effluxpumphämmare.

Förbättra noggrannheten i flödescytometrisk bedömning av mitokondriell membran potential i hematopoietiska stamceller och stamceller genom hämning av effluxpumpar

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Mitokondriell funktion är avgörande för hematopoietic stamceller självförnyelse. Mitokondriell aktivitet är en reflektor av den inre mitokondriella membranpotentialen, som kan mätas med TMRM, ett celllysrör, cellpermeant katjonämne. Xenobiotiska effluxpumpar är mycket aktiva i HSC, och orsakar TMRM extrudering.Den största fördelen med detta protokoll, är korrigeringen av denna effekt, utnyttja Verapamil, en hämmare av de efflux pumpar. Börja med att isolera benmärg från musbenor. Använd ett par typpor och vass sax för att skära de två bakre tassarna.Gör sedan ett litet klipp i den ventrala huden på musen, och sträcka den. Extrahera lårbenet och skenbenet, samtidigt som man är noga med att inte rubba lårbenets huvuden, och placera benen i en sex-brunnsplatta, fylld med 1,5 milliliter färgningsbuffert. Ta bort musklerna från benen, och skär ändarna av benen, så att benmärg att avsluta.Placera de rengjorda benen i nya brunnar, med 1,5 milliliter färgningsbuffert. Spola sedan ut benmärgen med en tre milliliter spruta och en 25 gauge nål, tills benet blir vitt. Samla alla celler i en 1,5 milliliter rör, och centrifug dem i fem minuter vid 180 gånger G, sedan kasta supernatant.Försiktigt resuspend pelleten i 300 mikroliter av iskall ACK lysning buffert, och lägg cellerna på is i en minut. Därefter omedelbart avaktivera lys genom att lägga till en milliliter av färgning buffert. Centrifugera cellerna i fem minuter vid 180 gånger G.Resuspend cellen pelleten, som bör visas vit, i en milliliter färgning buffert.Filtrera cellerna med hjälp av en cellsillock, med ett 35 mikrometer nylonnät, för att få mononukleära celler. Börja med att förbereda härstamning cocktail, och fluorophore konjugerade antikroppar, enligt manuskript riktningar. Håll antikropparna på is, och skyddas från ljus.Sedan centrifugera provet i fem minuter vid 180 gånger G, och kasta supernatanten. Tillsätt 400 mikroliter av härstamning cocktail, och fyra mikroliter av CD135 biotinylerade antikroppar mot cellen pelleten, och virvel blandningen. Sedan ruva den på is i 30 minuter.Efter inkubationen tvätta provet genom att tillsätta tre milliliter färgningsbuffert, snurra ner det i fem minuter vid 180 gånger G och kassera supernatanten. Tillsätt sedan 400 mikroliter av antikroppslösning, och virvel blandningen. Inkubera den på is i ytterligare 30 minuter, och upprepa tvätten med färgningsbufferten.För att förbereda TMRM-färgningslösningen, tillsätt 2,2 mikroliter av TMRM-stamlösning, och 1,1 mikroliter av Verapamil, till 1,1 milliliter serumfritt hematopoietiska odlingsmedium, med trombopoietin och stamcellsfaktor. Resuspend benmärgen i en milliliter av TMRM färgning lösning, virvel snabbt, och inkubera i en timme vid 37 grader Celsius. Filtrera provet med hjälp av en cellsillock, med ett 35 mikrometer nylonnät, för att undvika att flödescytometern täpps igen.Tillsätt sedan en mikroliter av DAPI och fortsätt med flödescytometri. Kör benmärgsprovet, och förvärva minst en miljon händelser. Visa sedan de levande benmärgs mononukleära cellerna i en tomt för stilla havsblått, för att identifiera CD135 Lin-negativa och Lin-positiva fraktioner.Rita linnegativa fraktionen för APC/Cy7 kontra PE/Cy7 för att identifiera den multipotenta progenitoren eller MPP-fraktionen. Rita sedan MPP-fraktionen för APC kontra PerCP/Cy5.5, för att identifiera den hematopoetiska stamceller eller HSC-fraktionen. Visa HSC-fraktionen för FITC, eller CD34, för att dela upp den i CD34-negativa HSC- och CD34-positiva HSC-fraktioner.Slutligen förvärva TMRM intensiteten i varje population. För att säkerställa att TMRM-infärgningen fungerade korrekt, tillsätt en mikroliter FCCP i provet, för en slutkoncentration på en millimolar, och inkubera den i 37 grader Celsius i fem minuter. Skaffa sedan en miljon evenemang.Efter FCCP-tillägg bör TMRM-intensiteten ökas drastiskt. Detta protokoll har framgångsrikt använts för att kvantifiera mitokondriellt membran potential i olika cell populationer, med TMRM färgämne. Det har visats att förekomsten av PBS och FBS i odlingsmediet påverkar TMRM signalintensitet.Så det är viktigt att utföra TMRM färgning i serumfri expansion medium. Hematopoetiska stamceller uttrycker höga aktivitetsnivåer av xenobiotiska effluxpumpar som extruderar TMRM-färgämne. Så TMRM profiler varierar också i närvaro av Verapamil eller Cyclosporin H, som blockerar pumparna.För att verifiera riktigheten av TMRM-färgning kan FCCP vara att depolarisera mitokondrierna, och minska TMRM-intensiteten. Detta protokoll kan enkelt anpassas för att studera HSC med ett annat mitokondriellt membran potentialfärgämne, inklusive TMRE eller JC-1. Samt andra mitokondriella färgämnen som MitoTracker eller MitoSOX.De kritiska frågor som ärvs av effluxpumpars olika aktivitet bland benmärgspopulationen påpekades först nyligen. Så detta protokoll syftar till att minska diskrepansen mellan tidigare resultat.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Isolering och analys av hematopoetiska stamceller från moderkakan

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Flödescytometri Rening av Mouse meiotiska celler

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-medierad Knockdown Under Ex vivo Erytropoes av mänskliga hematopoetiska stamceller

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fenotypisk analys och isoleringen av murina hematopoietiska stamceller och Linjen-bundna stamfäder

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Identifiering av nyckelfaktorer Reglersjälvförnyelse och differentiering i EML Hematopoietisk prekursorceller genom RNA-sekvensering analys

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig mätning av mitokondrie kalcium och mitokondriell membranpotential i levande celler genom fluorescensmikroskopi

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Mätning av mitokondriell massa och membran potential i hematopoietiska stamceller och T-celler med flödescytometri

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Bedömning av cellulär bioenergetik i mus hematopoetisk stam och primitiva stamceller med hjälp av extracellulär flödesanalysator

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Funktionell bedömning av kinesin-7 CENP-E i spermatocyter med användning av in vivo-hämning, immunofluorescens och flödescytometri

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...