Name: improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps
Uploaded: 2019-07-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of

Yazarlar Ito laboratuar, özellikle K Ito ve H sato ve Einstein kök hücre Enstitüsü yorum ve Einstein Flow cytometry ve analitik görüntüleme çekirdek tesisleri (Ulusal Kanser Enstitüsü Grant P30 CA013330 tarafından finanse edilen) tüm üyelerine teşekkür deneyler yürütmek yardımcı olur. K.I. Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01DK98263, R01DK115577 ve R01DK100689) ve Einstein tek hücreli Genomics/Epigenomics (C029154) çekirdek Direktörü olarak sağlık New York Dışişleri Bakanlığı hibe tarafından desteklenir. K.I. Ito lösemi ve lenfoma toplumu araştırma bilimci olduğunu.

Burada açıklanan tüm yöntemler, Albert Einstein Tıp Koleji 'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıAYUC) tarafından onaylanmıştır.
1. çözümlerin hazırlanması
<ol><li>Boyama tampon (fosfat-tamponlu tuz (PBS) + 2% fetal sığır serumu (FBS)): steril PBS çözeltisi 500 mL 'de 10 mL FBS ekleyin. Not: Bu çözüm, steril durumda en az bir ay boyunca 4 °C ' de depolanabilir. Aşağıdaki yordamları başlatmadan önce, bu çözümün (50 ml) bir ...

<ol>
	<li>Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+progenitor+cells:+origins,+phenotypes,+lineage+commitments,+and+transdifferentiations.">Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).</li><li>Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+stem+cell+biology.">Regulatory mechanisms in stem cell biology.</a> Cell. 88 (3), 287-298 (1997).</li><li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li><li>Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell:+keystone+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+and+a+stepping-stone+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine.</a> Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).</li><li>Ito, K., Bonora, M., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+as+master+of+hematopoietic+stem+cell+fate.">Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate.</a> International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+a+purified+Tie2++hematopoietic+stem+cell+population+relies+on+mitochondrial+clearance.">Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance.</a> Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).</li><li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthesis+and+storage.">ATP synthesis and storage.</a> Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).</li><li>Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+catalysis+in+ATP+synthase.">The regulation of catalysis in ATP synthase.</a> Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).</li><li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment.">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li><li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+efflux+studies+suggest+that+hematopoietic+stem+cells+expressing+low+or+undetectable+levels+of+CD34+antigen+exist+in+multiple+species.">Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species.</a> Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).</li><li>Spangrude, G. J., Johnson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+and+activated+subsets+of+mouse+multipotent+hematopoietic+stem+cells.">Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).</li><li>Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABCG2+transporter+is+an+efficient+Hoechst+33342+efflux+pump+and+is+preferentially+expressed+by+immature+human+hematopoietic+progenitors.">The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors.</a> Blood. 99 (2), 507-512 (2002).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+transporter+Bcrp1/ABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype.">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, 13125 (2016).</li><li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress.">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+imaging+of+mitochondrial+structure+and+function+during+acute+kidney+injury.">In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury.</a> Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cyclophilin+with+the+mitochondrial+inner+membrane+and+regulation+of+the+permeability+transition+pore,+and+cyclosporin+A-sensitive+channel.">Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance.">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).</li></ol>

Mitokondriyal membran potansiyel ölçümü, hücrenin metabolik durumu için kritik olan mitokondri analizinin ve değerlendirmesinin temel taşıdır. Burada, TMRM staining tarafından Δkr m analizi için bir protokol açıklanmaktadır. TMRM, Δkr m nedeniyle aktif mitokondri içinde biriken ve ilgili seviyeleri, ekstrüler, sitoplazmik ve mitokondriyal bölmeleri10arasında denge içinde kalır bir hücre-perdemek floresan boya. Bu protokol tetrametilrhodamin, etil ester (TMRE) ve JC-1 gibi ?...

Hematopoetik kök hücreler (HSCs) kendi kendini yenileyen, çok güçlü ve kan1,2tüm hücrelere artış veren yeteneğine sahiptir. Hücresel metabolizma HSC bakım, transkripsiyon faktörleri, içsel sinyaller ve mikroçevre3,4,5ile birlikte önemli bir düzenleyici olduğunu. Mitokondriyal fonksiyon ve kalitenin uygun kontrolü bu nedenle HSC bakım6,7için önemlidir.
Mitokondriyal membran potansiyeli (Δkr m), doğrudan işlevselliğini yansıtan mitokondri değerlendirilmesinde anahtar bir parametredir, bu da elektron taşıma zincirindeki proton pompalama aktivitesinin dengesinden ve F üzerinden proton akışına göre türemiştir. 1/FO ATP synthase. Bu her ikisi de (gen ifadesi ve substrat kullanılabilirliği bağlı olarak) ADP, ATP için oksijen bağımlı fosforilasyon için8,9gereklidir. Mitokondriyal bölmesinin elektronik aletinden faydalanabilmek için Δkr m 'i ölçmek üzere çeşitli Potansiyometrik boyalar geliştirilmiştir. Bunlardan biri tetrametylrhodamine metil ester perklorat (TMRM), hangi yaygın hücreler çeşitli akış sitometri tarafından δkr m ölçmek için kullanılan10, hematopoetik kök ve progenitör hücreler dahil11.
Ancak, bu hücrelerin ksenobiyotik "effluks" pompaları yüksek aktivite boya ekstrüzyon12neden olabilir çünkü mitokondriyal boyalar, HSCs bazı dikkatli kullanılması gerekir. Nitekim, Rhodamine 123 gibi mitokondriyal boyaların ekstrüzyon araştırmacılar HSCs izole etmek için izin verdi13 veya HSC tanımlamak "yan nüfus" boya Hoechst mavi ve Hoechst kırmızı14diferansiyel ekstrüzyon sömürüyor tarafından, 15. aynı zamanda bu Fumitremorgin C, ATP-bağlayıcı kaset alt aile G üyesi 2 (ABCG2) taşıyıcı, belirli bir engelleyici, HSPCs16mitotracker boyama deseni etkilemez gösterildi. Bu sonuçların yayınlanması sonrasında, ksenobiyotik "effluks" pompa inhibitörlerinin yokluğunda mitokondrial boyalar kullanılarak birden fazla çalışma gerçekleştirildi, HSCs 'nin düşük δkr m16 ile sadece az sayıda mitokondri sahip olduğu yaygın izlenimi taşımaktadır. , 17 , 18 yaşınakadar.
Son zamanlarda, ancak, bu verapamil, "effluks" pompaları geniş bir spektrum inhibitörü, önemli ölçüde mitokondriyal boya mitotracker yeşil19boyama deseni değiştirir gösterildi. Bu tutarsızlık muhtemelen Fumitremorgin C 'nin Abcg2 için son derece seçici olması nedeniyle, HSCs Ayrıca Abcb1a gibi diğer taşıyıcıları da ifade ederken (sadece Fumitremorgin C 'ye zayıf hassastır)19. Ayrıca, TMRM, nonyl akridin Orange ve mitotracker Orange (MTO) gibi diğer mitokondrial boyaların mitotracker Green ile aynı desenleri sergilediğine dair rapor verdik. Daha da önemlisi, HSPCs 'in akış cytometrik desenlerinin, mitokondriyal kütle11' e ek olarak Δkr m 'lerini yansıttığını gözlemledik.
TMRM boya alımı kesinlikle mitokondri negatif şarj bağlıdır, ancak boya elde edilen birikim, alımı ve boşluğu arasında sürekli bir denge ile "effluks" pompalar20. HSCs ve olgun hücre nüfusu arasındaki ksenobiyotik "effluks" pompa ifadesinde fark bu dengeyi etkiler ve önyargılı sonuçlara yol açabilir. Verapamil gibi özel inhibitörlerinin kullanımı, Potansiyometrik boyalar ile Δkr m analizinde düşünülebilir. Burada, özel inhibitörler kullanılarak ksenobiyotik ışınlama aktivitesini düzeltir olan TMRM tabanlı Akış sitometrisi ile doğru δkr m ölçümü için değiştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3e-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0031-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-biotin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD48-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0481-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD135-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1351-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150-PerCP/Cy5.5&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-kit-APC/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporin H</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1575-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr1-biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM-biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-5790-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Il7R&#945;-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1271-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nk1.1-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca-1-PE/Cy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-5981-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF murine</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>250-03-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM medium</td>
			<td>STEMCELL technologies</td>
			<td>9605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Pacific Blue</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119-biotin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BDB553672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5428-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-14-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>V4629-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the accuracy of flow cytometric assessment of mitochondrial membrane potential in hematopoietic stem and progenitor cells through the inhibition of efflux pumps

Hücresel metabolizma hematopoetik kök hücre (HSC) Self-yenileme, hematopoetik homeostaz mitokondri tarafından oynanan çeşitli roller önemli bir düzenleyici olduğu gibi kapsamlı HSC araştırmacılar tarafından incelendi. Mitokondriyal aktivite seviyeleri, TMRM (tetrametilrhodamin, metil ester) gibi hücre-perdemek kyonik boyalar ile ölçülecek olan membran potansiyelleri (Δkr m) ile yansıtılır. Bu boyalar hücrelerden ekstrüze etmek için "effluks" pompaları yeteneği, ancak kullanışlılığı sınırlandırabilirsiniz. Ksenobotik taşıyıcılar, HSCs 'de farklılaşmış hücrelerden daha yüksek ifade ve etkinlik sergileyen, HSCs 'yi değerlendirirken elde edilen ölçüm önyargı özellikle önemlidir. Burada, bir "effluks" pompa inhibitörü olan verapamil 'i kullanarak, birden fazla kemik iliği nüfusu arasında δkr m 'i doğru şekilde ölçmek için bir protokol açıklanmaktadır. Pompa aktivitesinin ortaya çıkan inhibisyonu, hematopoetik kök ve Progenitör hücrelerde TMRM yoğunluğunu artırmak için gösterilir (hspcs), Olgun fraksiyonları nispeten değişmeden bırakarak iken. Bu, Δkr m 'ye bağımlı boyalar kullanıldığında ve yazılmış ve görselleştirildiğinde gerekli olan boya-efflux aktivitesine yakın ilgi vurgulamaktadır, bu protokol kemik iliği içindeki farklı nüfus ya da aynı nüfus içinde doğru karşılaştırmak için kullanılabilir farklı deneysel modeller arasında.

Yukarıda açıklanan protokol, BM-MNCs ' i fare modelinden kolay yalıtımını sağlar. Şekil 1 protokolün ana adımlarını özetler: kemik yalıtımı, kemik iliği dışında yıkama, kırmızı kan hücresi Lizi, ve antikor boyama, belirli bir hematopoetik nüfus mitokondriyal membran potansiyelini ölçmek için TMRM boyama izledi .
BM-MNCs, HSCs dahil olmak üzere birkaç hücre nüfus içerir. Bu protokolde kullanılan antikor kokteylleri, HSCs 'nin (CD...

Watch this Scientific Journal Video about Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of 

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

Xenobiotic "effluks" pompalar son derece hematopoetik kök ve progenitör hücreleri (hspcs) ve neden ekstrüzyon TMRM, bir mitokondriyal membran potansiyel floresan boya aktif. Burada, bir "effluks" pompa inhibitörü verapamil varlığında TMRM tarafından hspcs 'de mitokondriyal membran potansiyelini doğru ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Efflux pompaları Inhibisyonu Ile hematopoetik kök ve progenitor hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin akış Cytometrik değerlendirilmesi doğruluğu iyileştirilmesi

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Mitokondriyal fonksiyon hematopoetik kök hücre kendini yenileme için önemlidir. Mitokondriyal aktivite iç mitokondriyal membran potansiyelinin bir reflektörüdür, tmrm ile ölçülebilir, bir hücre floresan, hücre perkastesi katyonik boya. Ksenobiyotik efflux pompalar HSC'de son derece aktiftir ve TMRM ekstrüzyonuna neden olur.Bu protokolün en büyük avantajı, efflux pompaların inhibitörü Olan Verapamil'i kullanarak bu etkinin düzeltilmesidir. Fare uyluk kemik iliği izole ederek başlayın. İki posterior pençeleri kesmek için forceps ve keskin makas bir çift kullanın.Sonra farenin ventral deri küçük bir snip yapmak ve germek. Femur ve tibia ayıklayın, femur başları yerinden değil özen yaparken, ve altı kuyu plaka kemikleri yerleştirin, boyama tampon 1.5 mililitre ile dolu. Kemiklerden kasları çıkarın ve kemik iliği çıkmak için izin, kemiklerin uçlarını kesti.Temizlenmiş kemikleri 1,5 mililitre boyama tamponuyla yeni kuyulara yerleştirin. Sonra, kemik üç mililitreşlik şırınga ve 25 gauge iğne ile kemik iliği dışarı floş, kemik beyaz olana kadar. 1.5 mililitrelik bir tüptüm hücreleri toplamak ve 180 kez G beş dakika santrifüj, sonra supernatant atın.Dikkatle buz soğuk ACK lysing tampon 300 mikrolitre pelet resuspend ve bir dakika için buz hücreleri koymak. Daha sonra bir mililitre boyama tamponu ekleyerek lysis'i hemen devre dışı bırakın. Hücreleri 180 kez g.Resuspend hücre pelet, beyaz görünmesi gereken beş dakika santrifüj, boyama tampon bir mililitre içinde.Hücreleri 35 mikrometre naylon kafesle hücre süzgeci kapağı kullanarak filtreuygulayın ve mononükleer hücreler elde edin. Soyun kokteyli ve feorofore konjuge antikorlar hazırlayarak başlayın, el yazması talimatlara göre. Antikorları buzda tutun ve ışıktan koruyun.Daha sonra, 180 kez G beş dakika için örnek santrifüj ve supernatant atın. Hücre peletine 400 mikrolitre silik kokteyl ve dört mikrolitre CD135 biyotinylated antikorlar ekleyin ve karışımı girdap. Sonra 30 dakika buzüzerinde kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, numuneyi üç mililitre boyama tamponu ekleyerek, 180 kez G'de beş dakika eğdirerek ve süpernatantı atarak yıkayın. Sonra antikor çözeltisi 400 mikrolitre ekleyin ve karışımı girdap. 30 dakika daha buzüzerinde kuluçkaya yatvere ve boyama tamponu ile yıkamayı tekrarlayın.TMRM boyama çözeltisini hazırlamak için trombopoietin ve kök hücre faktörü ile 2,2 mikrolitre TMRM stok çözeltisi ve 1,1 mikrolitre Verapamil, 1,1 mililitre serumsuz hematopoetik kültür ortamı ekleyin. TMRM boyama çözeltisinin bir mililitresinde kemik iliğini yeniden askıya alın, girdap hızlıca ve 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Akış sitometresini tıkamamak için numuneyi 35 mikrometre naylon kafesle bir hücre süzgeci kapağı kullanarak filtreleyin.Sonra DAPI bir mikrolitre ekleyin ve akış sitometri ile devam edin. Kemik iliği örneğini çalıştırın ve en az bir milyon etkinlik elde edin. Daha sonra cd135 Lin-negatif ve Lin-pozitif fraksiyonları tanımlamak için, pasifik mavisi için bir komplo canlı kemik iliği mononükleer hücreleri görüntüleyin.Çok güçlü ataveya MPP fraksiyonu tanımlamak için APC/Cy7 karşı PE/Cy7 için Lin-negatif fraksiyonu çizin. Sonra hematopoetik kök hücre veya HSC fraksiyonu tanımlamak için, PerCP/Cy5.5 karşı APC için MPP fraksiyonu çizin. CD34 negatif HSC ve CD34 pozitif HSC fraksiyonlarına bölmek için FITC veya CD34 için HSC fraksiyonu görüntüleyin.Son olarak her popülasyonda TMRM yoğunluğu elde edin. TMRM boyamadoğru çalıştı emin olmak için, örnek için FCCP bir mikrolitre ekleyin, bir milimolar son konsantrasyon için, ve beş dakika boyunca 37 derece santigrat de kuluçka. O zaman bir milyon etkinlik kazan.FCCP ilavesi sonrasında TMRM yoğunluğu önemli ölçüde artırılmalıdır. Bu protokol, TMRM boyası ile çeşitli hücre popülasyonlarında mitokondriyal membran potansiyelini ölçmek için başarıyla kullanılmıştır. PBS ve FBS'nin kültür ortamıiçinde bulunmasının TMRM sinyal yoğunluğunu etkilediği gösterilmiştir.Bu nedenle serumsuz genleşme ortamda TMRM boyama yapmak önemlidir. Hematopoetik kök hücreler, TMRM boyasını ekstrüzyon yapan ksenobiyotik efflux pompaların yüksek aktivite düzeylerini ifade eder. Yani TMRM profilleri de Verapamil veya Siklosporin H, pompaları blok varlığında değişir.TMRM boyama doğruluğunu doğrulamak için, FCCP mitokondri depolarize ve TMRM yoğunluğunu azaltmak olabilir. Bu protokol, TMRE veya JC-1 dahil olmak üzere farklı bir mitokondriyal membran potansiyel boya ile HSC eğitimi için kolayca uyarlanabilir. Yanı sıra MitoTracker veya MitoSOX gibi diğer mitokondriyal boyalar.Kemik iliği popülasyonu arasında efflux pompaların farklı aktivitesi nden kaynaklanan kritik konular açıktı. Yani bu protokol, önceki bulgular arasındaki tutarsızlığı azaltmayı amaçlamaktadır.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Plasenta Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu ve Analizi

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral aracılı demonte sırasında Ex vivo İnsan Hematopoetik Kök Hücre Eritropoiesis

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

RNA dizileme Analizi ile EML Hematopoetik Öncü Hücreler Self-yenileme ve farklılaşma Düzenlenmesi Anahtar Faktörler belirlenmesi

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Hematopoetik Kök Hücrelerde ve T-Hücrelerinde Mitokondriyal Kitle ve Membran Potansiyelinin Akış Sitometrisi ile Ölçülmesi

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanılarak Fare Hematopoetik Kök ve İlkel Progenitör Hücrelerinde Hücresel Biyoenerjetik Verilerin Değerlendirilmesi

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

Kinesin-7 CENP-E'nin In Vivo İnhibisyon, İmmünofloresan ve Akım Sitometrisi Kullanılarak Spermatositlerde Fonksiyonel Değerlendirilmesi

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...