Name: assessment of lymphocyte migration in an ex vivo transmigration system
Uploaded: 2019-09-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af American Lung Association (K.J.W.), mindesmærket Eugene Kenney fond tildelt T.A.W. og K.J.W., generøs start-up støtte fra University of Utah for K.J.W., og en afdeling af veteraner anliggender Award til T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. er modtager af en forskerkarriere videnskabsmand Award (IK6 BX003781) fra Department of Veterans Affairs. Forfatterne ønsker at anerkende redaktionel bistand fra MS. Lisa Chudomelka. Forfatterne takker unmc flow flowcytometri Core for deres støtte til at indsamle de flow cytometri-data, der genereres for dette manuskript.

Alle metoder, der er beskrevet her, blev gennemgået og godkendt af de institutionelle dyrepleje-og Brugsudvalg ved University of Nebraska Medical Center (UNMC) og University of Utah.
1. opsætning og klargøring af reagenser
<ol><li>
Forbered komplet RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medier.
	<ol>
<li>10 mL varme inaktiveret føtal bovint serum (FBS) tilsættes til 90 mL RPMI.</li>
		<li>Tilsæt 1 mL 100x penicillin-streptomycin-glutamin til 100 mL 10% FBS RPMI.</li>
	...

<ol>
	<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Moser, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+History+of+Chemoattractant+Research.">Editorial: History of Chemoattractant Research.</a> Frontiers in Immunology. 6, 548 (2015).</li><li>Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+sound+the+alarmin:+The+role+of+atypical+chemokine+in+inflammation+and+cancer.">Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer.</a> Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).</li><li>Charo, I. F., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+roles+of+chemokines+and+chemokine+receptors+in+inflammation.">The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation.</a> The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).</li><li>Abboud, D., Hanson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+neutralization+as+an+innovative+therapeutic+strategy+for+atopic+dermatitis.">Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis.</a> Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).</li><li>Aldinucci, D., Casagrande, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+CCL5/CCR5+Axis+against+the+Progression+of+Gastric+Cancer.">Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477 (2018).</li><li>Chonco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+DNA+Aptamers+Against+CCL21+Protein:+Characterization+and+Biomedical+Applications+for+Targeted+Drug+Delivery+to+T+Cell-Rich+Zones.">Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones.</a> Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).</li><li>Trivedi, P. J., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+Chemokine+Receptors+as+Therapeutic+Targets+in+Inflammatory+Bowel+Disease;+Pitfalls+and+Promise.">Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise.</a> Journal of Crohn's and Colitis. 12 (12), 1508 (2018).</li><li>Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+of+chemotaxis+as+a+window+into+mechanisms+of+toxicant-induced+immunomodulation.">In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation.</a> Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).</li><li>Davis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+studying+the+immune+system+leads+us+to+new+medicines.">How studying the immune system leads us to new medicines.</a> Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).</li><li>Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+chemokine+expression+following+respiratory+virus+infection+reflects+Th1-+or+Th2-biased+immunopathology.">Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology.</a> Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).</li><li>Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+chemokines+CCL2+and+CXCL10+by+matrix+metalloproteinases-2+and+-9:+implications+for+chemotaxis.">Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis.</a> Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).</li><li>Burrell, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+Node+Stromal+Fiber+ER-TR7+Modulates+CD4++T+Cell+Lymph+Node+Trafficking+and+Transplant+Tolerance.">Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance.</a> Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).</li><li>Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminins+affect+T+cell+trafficking+and+allograft+fate.">Laminins affect T cell trafficking and allograft fate.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).</li><li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th2+cell+differentiation+from+naive+CD4(+)+T+cells+is+enhanced+by+autocrine+CC+chemokines+in+atopic+diseases.">Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases.</a> Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).</li><li>Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Arrestin-2-Dependent+Signaling+Promotes+CCR4-mediated+Chemotaxis+of+Murine+T-Helper+Type+2+Cells.">beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+antagonist+for+CCR4+attenuates+allergic+lung+inflammation+in+a+mouse+model+of+asthma.">A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma.</a> Science Reports. 7 (1), 15038 (2017).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+helper+CD4+T+cells+during+acute+and+stable+allergic+asthma.">Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma.</a> Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).</li><li>Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Group+2+Innate+Lymphoid+Cells+in+Allergic+Airway+Inflammation+Models+in+the+Mouse.">Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse.</a> Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).</li><li>Li, B. W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group+2+Innate+Lymphoid+Cells+Exhibit+a+Dynamic+Phenotype+in+Allergic+Airway+Inflammation.">Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1684 (2017).</li><li>Warren, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+differences+in+activation+of+lung-related+type-2+innate+lymphoid+cells+in+experimental+asthma.">Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma.</a> Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).</li><li>Warren, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovalbumin-sensitized+mice+have+altered+airway+inflammation+to+agriculture+organic+dust.">Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust.</a> Respiratory Research. 20 (1), 51 (2019).</li><li>Poole, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphabeta+T+cells+and+a+mixed+Th1/Th17+response+are+important+in+organic+dust-induced+airway+disease.">alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease.</a> Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).</li><li>Matsuo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CCR4+antagonist+ameliorates+atopic+dermatitis-like+skin+lesions+induced+by+dibutyl+phthalate+and+a+hydrogel+patch+containing+ovalbumin.">A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin.</a> Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).</li><li>Mikhak, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+CCR4+and+CCR8+to+antigen-specific+T(H)2+cell+trafficking+in+allergic+pulmonary+inflammation.">Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).</li><li>Monticelli, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells+promote+lung-tissue+homeostasis+after+infection+with+influenza+virus.">Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus.</a> Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).</li><li>Saenz, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL25+elicits+a+multipotent+progenitor+cell+population+that+promotes+T(H)2+cytokine+responses.">IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses.</a> Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).</li><li>Hoyler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+GATA-3+controls+cell+fate+and+maintenance+of+type+2+innate+lymphoid+cells.">The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells.</a> Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).</li><li>Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+cytokine+receptor+gamma+chain+plays+an+essential+role+in+regulating+lymphoid+homeostasis.">The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).</li><li>Warren, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSV-specific+anti-viral+immunity+is+disrupted+by+chronic+ethanol+consumption.">RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption.</a> Alcohol. , (2016).</li><li>Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+association+between+MMP-9+and+impaired+T+cell+migration+in+ethanol-fed+BALB/c+mice+infected+with+Respiratory+Syncytial+Virus-2A.">An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A.</a> Alcohol. , (2018).</li><li>Molteni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+device+to+concurrently+assess+leukocyte+extravasation+and+interstitial+migration+within+a+defined+3D+environment.">A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment.</a> Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).</li><li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+in+vitro+3D+co-culture+model+to+engineer+vascularized+bone-mimicking+tissues+combining+computational+tools+and+statistical+experimental+approach.">Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach.</a> Biomaterials. 76, 157-172 (2016).</li><li>Jeon, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+3D+vascularized+organotypic+microfluidic+assays+to+study+breast+cancer+cell+extravasation.">Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).</li></ol>

Heri præsenterer vi en veletableret metode til vurdering af kemo-induceret migration af lymfocytter i et ex vivo transmigrerings system. Der er flere kritiske trin i protokollen, hvoraf den første er at kontrollere ekspression af den korrekte chemokine receptor på immuncellerne i forsøget. I vores hænder, valgte vi CCR4 på grund af litteraturen, der fremhæver vigtigheden af CCR4 på Th2 hjælper T celler i allergisk inflammation. Ovalbumin-induceret inflammation blev tidligere påvist at være begrænset af mindst...

Denne oprindelige transmigrering metode blev præsenteret af Stephen BoyDen i 1962 i Journal of eksperimentel medicin1. Meget af det, vi ved om chemotaxis og chemokinetik, ville ikke være muligt uden udvikling af BoyDen-kammeret. Før opdagelsen af den første chemokine i 1977, ex vivo transmigrering systemer blev brugt til at lære om serum-faktorer, der kunne arrestere cellulære bevægelse i makrofager mens forstærke cellulære motilitet i neutrofiler1,2. En massiv rigdom af viden er blevet udviklet med hensyn til immuncelle migration, og til dato, 47 kemokiner er nu blevet opdaget med 19 tilsvarende receptorer3,4. Desuden er fler mængder af hæmmere/smagsforstærkere af disse kemo okinveje undergået udvikling til terapeutiske formål5,6,7,8. Mange af disse forbindelser er blevet testet i lignende vandring kamre til at forstå direkte interaktioner mellem forbindelser og immuncelle reaktionsevne til en given chemokine9.
Transmigration, eller diapedesis, i betændelses vævet væv er en vigtig proces til en sund inflammatorisk respons på klar infektion10,11. Et BoyDen-kammer, transmigrerings system eller transwell-apparatur består almindeligvis af to kamre adskilt af en porøs membran1,12. Den nederste kammer oftest holder medier, der indeholder chemokine af interesse, mens leukocytter er placeret i øverste kammer. Størrelsen af pore i membranen kan vælges baseret på størrelsen af cellen af interesse. Til dette projekt, vi har valgt en 3 μm porøs membran, som lymfoide celler er 7-20 μm i størrelse, afhængigt af den fase af cellulære udvikling. Denne porestørrelse sikrer, at disse celler ikke passivt falder gennem porerne, men at de aktivt migrerer som reaktion på chemokine gradient.
Den største fordel ved denne protokol er dens omkostningseffektivitet. In vivo transmigration er vanskelig, fordi det kræver omfattende uddannelse i dyre håndtering og kirurgi, og ofte involverer høj-drevne mikroskopi, der ikke altid er til rådighed for en forsker. Omkostningseffektiv screening af forbindelser menes at forbedre eller hæmme overførsel kan opnås forud for in vivo Imaging. Da transmigrerings systemet er stramt kontrolleret, kan cellerne i første omgang behandles derefter til transwell-apparatet, eller, omvendt, kan chemokin behandles først med en chemokine-hæmmer, derefter tilsættes cellerne til transwell-apparatet. Endelig kan endotel celler og/eller kælder membran proteiner tilsættes til bunden af transwell INSERT 1-2 dage før transmigration eksperiment for at forstå inddragelsen af disse barriere celler i chemokinetics. Igen, disse manipulationer af systemet giver et effektivt middel til at bestemme vigtige oplysninger om effektiviteten af en given forbindelse forud for mere komplicerede in vivo undersøgelser.
Anvendelse af et transmigrerings kammer system er en effektiv metode til at vurdere lymfocyt mobilitet under forskellige in vivo-og in vitro-forhold12,13,14. Heri beskrives en optimeret metode til vurdering af ex vivo-lymfocyt respons på kemo okiner i et transmigrationskammer. I dette eksempel eksperiment blev CD4+ T- celler og gruppe 2-medfødte lymfoide celler (ILC2) isoleret fra mænd og kvinder, Balb/c-mus efter eksponering af æg-allergen. En hypotese blev genereret, at CCR4+ CD45+ LINEAGE-(Lin-) ILC2 fra allergen-udfordrede mus ville migrere mere effektivt mod CCL17 og CCL22 end CCR4+ CD4+ T hjælpe celler. CCL17 og CCL22 er kemo okiner, der almindeligvis produceres af dendritiske celler og makrofager af m2 (allergisk) fænotype, blandt andre celler, i allergi15,16. CCL17 og CCL22 kan opfattes som biomarkører af allergisk inflammation, da de let påvises i lungerne under luftvejs eksacerbationer16,17,18. Det er vigtigt, CCR4 ekspression er forhøjet i forhold til ubehandlede Kontroller, som afsløret i bioinformatiske data genereret fra ILC2 isoleret fra House Dust mide behandlede dyr, og tilsvarende ILC2 fra naive dyr behandlet ex vivo med Il-33 ( allergen-fremme af medfødte cytokin) opregulerer CCR419,20. Desuden, ifølge data for ILC2 i den immunologiske genom Project database (www.immgen.org), CCR4 mRNA er stærkt udtrykt i disse medfødte immunceller. Til dato, er lidt kendt om handel med ILC2 i væv, men det er sandsynligt, at ILC2 og CD4+ T celler bruger lignende kemo okiner og receptorer for chemotaxis og chemokinetics som de udtrykker lignende transkriptionsfaktorer og receptorer. Således sammenlignede vi CCL17 versus CCL22 reaktionsevne, af ILC2 og CD4+ T-lymfocytter, fra både mandlige og kvinder, æg-udfordrede dyr.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15250061</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>329424</td>
			<td>U-100 Syringes Micro-Fine 28G 1/2&#34; 1cc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td>Dilute to 1x in RPMI media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td>polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 um transwell inserts</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-288</td>
			<td>24-well plate containing 12 transwell inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3x stabilizing fixative</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>338036</td>
			<td>Prepare 1x solution according to manufacturers protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene tubes</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>38007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-106</td>
			<td>polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-chamber easy separation magnet</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>18103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>A1049201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced cell strainer, 40 um</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-375</td>
			<td>nylon mesh, 40 micron strainers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Hydroxide, Reagent Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239186-25G</td>
			<td>20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- mouse CCR4; APC-conjugated</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>131211</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>557396</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11c; PE eFluor 610</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>61-0114-82</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD16/32, Fc block</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553141</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>47-0193-82</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>552774</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD45; PE conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>56087</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse ICOS (CD278)</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>564070</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553164</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>145311</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1450102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Dissociator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td>0.5% in serum-free RPMI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter Clides</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1450015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Egg Ovalbumin, Grade V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5503-10G</td>
			<td>500 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1, Filtered</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216)</td>
			<td>25 U/mL in RPMI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compensation beads</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>01-1111-41</td>
			<td>1 drop per contol tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation Tubes</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-335</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>554657</td>
			<td>1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated-FBS</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-525H</td>
			<td>10% in complete RPMI &#38; ILC2 Expansion Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CCL17</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02954-20</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CCL22</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02856-20</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CD4+ T cell enrichment kit</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>19852</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse IL-2</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02764-20</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse ILC2 enrichment kit</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>19842</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse recombinant IL-33</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>78044</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>22400071</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation Buffer</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>20144</td>
			<td>1 X PBS + 2% FBS; stored at 4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small animal nebulizer and chamber</td>
			<td>Data Sciences International</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7124; NDC 0338-0048-04</td>
			<td>0.9% Sodium Chloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of lymphocyte migration in an ex vivo transmigration system

Heri præsenterer vi en effektiv metode, der kan udføres med grundlæggende laboratorie færdigheder og materialer til at vurdere lymfocyt chemokinetisk bevægelse i et ex vivo transmigrerings system. Gruppe 2 medfødte lymfoide celler (ILC2) og CD4+ T hjælpe celler blev isoleret fra deres og lunger af hønseæg ægalbumin (OVA)-udfordrede Balb/c-mus. Vi bekræftede udtrykket af CCR4 på både CD4+ T- celler og ILC2, forholdsvis. CCL17 og CCL22 er de kendte ligander for CCR4; ved hjælp af denne ex vivo-transmigrerings metode undersøgte vi derfor CCL17- og CCL22-induceret bevægelse af CCR4+ lymfocytter. For at etablere kemo gradienter blev CCL17 og CCL22 anbragt i det nederste kammer af transmigrerings systemet. Isolerede lymfocytter blev derefter føjet til top kamre og over en 48 h periode lymfocytter aktivt migreret gennem 3 μm porer mod chemokine i nederste kammer. Dette er et effektivt system til bestemmelse af de chemokinetik af lymfocytter, men, forståeligt nok, ikke efterligner de kompleksiteter findes i in vivo orgel mikromiljøer. Dette er en begrænsning af den metode, der kan overvindes ved tilsætning af in situ billeddannelse af orgel og lymfocytter under undersøgelse. I modsætning hertil fordelen ved denne metode er, at der kan udføres af en entry-level tekniker på en langt mere omkostningseffektiv sats end Live imaging. Som terapeutiske forbindelser bliver tilgængelige for at øge migration, som i tilfælde af tumor infiltrerende cytotoksiske immunceller, eller at hæmme migration, måske i tilfælde af autoimmune sygdomme, hvor immunopatologi giver anledning til bekymring, denne metode kan bruges som en screening værktøj. Generelt, metoden er effektiv, hvis chemokine af interesse er konsekvent genererer chemokinetics på et statistisk højere niveau end medierne kontrol. I sådanne tilfælde kan graden af hæmning/forbedring af en given forbindelse bestemmes så godt.

CCR4 udtryk på CD4 + T-celler og ILC2.
For succesen med ex vivo-transmigrerings eksperimentet er det bydende nødvendigt at afgøre, om lymfocytterne reagerer på CCL17 og CCL22 gennem CCR4; Derfor fastsatte vi CCR4 udtryk på både CD4+ T- celler og ILC2 ved flow cytometri. Selv om det er velkendt, at OVA-specifikke CD4+ Helper T CELLS Express CCR4, mindre er kendt af udtrykket CCR4 på ILC2. Figur 1 viser repræsentative r...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System at JoVE.com

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

I denne protokol er lymfocytter placeret i det øverste kammer af et transmigrerings system, adskilt fra det nederste kammer af en porøs membran. Chemokin tilsættes til det nederste kammer, som inducerer aktiv migration langs en chemokine gradient. Efter 48 h tælles lymfocytter i begge kamre for at kvantificere overførsel.

Vurdering af lymfocyt migration i et ex vivo-Transmigrerings system

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Lymfocyt transmigration er et vigtigt element i enhver immunrespons. Derfor er denne protokol er betydelig, fordi det giver en forsker mulighed for at vurdere mobiliteten af lymfocytter i et veldefineret in vitro-system. Den største fordel ved denne teknik er, at forskellige chemokines kan vurderes for at bestemme deres effektivitet af inducerende migration i nyligt definerede celler, såsom gruppen to medfødte lymfoide celler, eller ILC2.En anden fordel er, at inhibitorer eller biologiske behandlinger med henblik på at blokere bestemte chemokin veje kan testes ved denne metode, før du gør dyrere forsøg med dyr. Begynd med at ekscisere lunger og milt fra aflivede ægbehandlede han- og hunmus med to til tre dyr pr. gruppe. Læg punkterede væv i separate dissociationsrør efter vævstype og dyresked.Placer lungevævet i 500 mikroliter af lungeekskiveringsmedier i et dissociationsrør, anbring røret i den automatiserede vævseksociator, og dissocier det ved hjælp af lungeprotokollen. Gentag disse trin i alt to gange. For at adskille miltvæv skal du placere det i 500 mikroliter af komplette RPMI-medier i dissociatoren og derefter bruge miltprotokollen.Arbejde i et biologisk sikkerhedsskab ved hjælp af steril teknik fra nu af, filtrere hvert dissocieret væv gennem en 40-mikrometercellestiter, og samles i 50-milliliter koniske rør. Dissociationsrør, der indeholder lungehomogenater, skylles med fem milliliter yderligere lungeeksocieringsmedier, rør, der indeholder milt homogenater med fem milliliter komplet RPMI, og filtrere deres indhold gennem de filtre, der anvendes til deres tilsvarende væv. For yderligere at adskille lungevæv, inkubere lunge homogenater i 15 til 30 minutter i en 37-graders Celsius inkubator med 5% kuldioxid.Derefter tilsættes fem milliliter komplet RPMI til både lunge og milt homogenater, og centrifuge. Efter udsmid af supernatanten kombineres pellets, der indeholder miltytter og lungeceller fra gruppen af dyr af samme køn, i et enkelt konisk rør på 50 milliliter. Tilsæt 10 milliliter komplet RPMI til hvert rør, og resuspend.Bestem det samlede celletal ved hjælp af en automatisk celletæller. Juster han- og huncellesuspensioner til 100 millioner celler pr. milliliter i separationsbuffer, og tilføj derefter et fem milliliter polystyrenrør. Efter isolering af gruppe to medfødte lymfoide celler fra 2/3 af de samlede celler som beskrevet i manuskriptet, skal du bruge de resterende celler til den CD4-positive T-celleisoleringsprocedure.For at starte CD4-positiv T-celleisolering skal der tilføjes rotteserum til CD4 T-celleberigelsesaffjedringen. Derefter tilsættes isolation cocktail til cellen prøve, og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur. Vortex hurtige kugler i 30 sekunder, og tilsæt til celleprøven for at opnå en fortynding af 75 mikroliter pr. milliliter.Bland forsigtigt og inkuberes i 2 1/2 minutter ved stuetemperatur. Top prøverne med ca. to milliliter separationsbuffer op til tre milliliter, læg de fem milliliterrør i den ottekammerbaserede separationsmagnet og inkuberes i fem minutter ved stuetemperatur. Derefter tip magneten fremad, og pipette hver celle suspension i en ren fem-milliliter rør.Der tilsættes 1,5 milliliter serumfri RPMI til hvert rør og centrifuge. Hæld supernatanten af, og ophjæld den CD4-positive T-cellepille ved 10 millioner celler pr. milliliter i serumfri RPMI. For at starte denne del af protokollen skal du bestemme antallet af Transwell-skær, der er nødvendige for eksperimentet for både ILC2- og CD4-positive T-celler som beskrevet i manuskriptet.Flyt forsigtigt tre-mikron Transwell skær fra de midterste rækker af en 24-brønd plade til de øverste og nederste rækker af samme 24-brønd plade med en pipette spids og behandskede hænder. Tilføj 500 mikroliter af migrationsmedier med CCL17 til 1/3 af brøndene i den midterste række af 24-brøndpladen. Tilføj 500 mikroliter af migrationsmedier med CCL22 til en anden 1/3 af brøndene.Og endelig tilsættes 500 mikroliter serumfri RPMI, der ikke indeholder chemokin, til de sidste 1/3 af brøndene. Mærk låget på pladen tydeligt med navnet på de relevante transmigrationsmedier placeret i bundbåsene. Derefter placere Transwell indsætter tilbage i brøndene, der indeholder de forskellige behandlinger.Tilsæt forsigtigt 100 mikroliter CD4 T-celler eller ILC2 til toppen af hver indsats, og sørg for ikke at blande eller pipette celleophænget op og ned i Transwells. Mærl låget på pladen tydeligt med celletypen placeret i hver brønd, og skriv den dato og det tidspunkt på dagen, hvor cellerne blev tilføjet. Gentag denne proces startende fra at fjerne Transwell-skær fra pladen, indtil alle cellerne er placeret i Transwell-skær med medier.Når de celler af interesse er isoleret, de vigtigste skridt er at holde styr på de kemofiner og celletyper, der er placeret i bestemte brønde, at forsigtigt tilføje celler til de øverste kamre, og endelig for at undgå unødvendig kontakt med transmigration plade under 48-timers inkubation. Anbring forsigtigt pladen i en 37-graders Celsius-inkubator med 5 % kuldioxid, og inkuber den i 48 timer, og sørg for at minimere kontakt med pladen i inkubationstiden. Når pladen er fjernet fra inkubatoren, fjernes alle Transwell-skær fra de midterste rækker i de tomme brønde lige over eller under.Indsamle celler fra toppen og bunden brønde af Transwell indsætter i rør mærket med top eller bund med CCL17, CCL22, eller medier, med celletype, og med replikeret nummer. Skyl bundboerne med 500 mikroliter på 1x PBS, opsaml dem i de tilsvarende rør, og gør det samme for de øverste brønde. Centrifuge rørene ved 378 gange g ved stuetemperatur i fem minutter.Brug en pipette til forsigtigt at fjerne alle supernatant, og derefter resuspend T celle og ILC2 pellets med 50 mikroliter af 1x PBS. Efter fjernelse af 10 mikroliter af cellesuspensionen tilsættes 90 mikroliter på 0,4 % trypanblå. Tæl cellerne på den automatiserede celletæller.Og for hver prøve skal du registrere procentdelen af levedygtighed og celletal pr. milliliter og bestemme det samlede antal celler pr. behandling i det øverste og nederste kammer. Når CCR4-udtrykket blev vurderet på både CD4-positive T-celler og ILC2 ved flowcytometri, var der ingen forskelle mellem mandlige og kvindelige værter. Ekspressionen af CCR4 pr. celle på ILC2 var imidlertid højere sammenlignet med CD4-positive T-celler.Når det nederste kammer i Transwell-apparatet var fyldt med ubehandlede cellekulturmedier, medier, der indeholder CCL22, eller medier, der indeholder CCL17, migrerede mindre end 14 % af cellerne under mediekontrolforhold. Som svar på CCL22, begge celletyper, uanset om de var fra mandlige eller kvindelige værter, reagerede på CCL22. Også, CCL22 induceret større migration end CCL17 i mandlige ILC2.På den anden side fremkaldte CCL17 signifikant migration af de kvindelige CD4 T-celler og ILC2 sammenlignet med medierne alene. CCL17 behandling var ikke anderledes end medier for mandlige CD4-positive T-celler eller mandlige ILC2. Under suboptimale forhold, når pladen med CD4 celler forblev ved stuetemperatur for de første 24 timer og derefter flyttet ind i inkubatoren, var der ingen migration mod CCL22 og CCL17.Desuden var cellernes levedygtighed især lav for cellerne i bundkammeret, hvilket viste vigtigheden af at anvende de korrekte temperaturer og tilstande, der er beskrevet i denne protokol, for at opnå optimale resultater. Når transmigrationsproceduren er afsluttet, bør man se en betydelig migration til chemokin af interesse i forhold til medierne kontrol brønde. Hvis der ikke er signifikant migration set, kan man antage, at proceduren ikke fungerede korrekt, eller at lymfocytter ikke reagerer på chemokine pågældende.Denne teknik kan bruges bredt til at forstå lymfocyt migration, når disse lymfocytter har gennemgået en bred vifte af in vivo behandlinger.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Kvantitativ vurdering af human neutrofil migration over en Kulturperler Blære epitel

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Vurdering af Innate Sensing af HIV-1 inficerede CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler ved plasmacytoide dendritiske celler ved hjælp af en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-dyrkningssystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Model af en oligodendrocyt rettet T-celle Angrib akut Brain Skiver

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymfocyt Isolering fra menneskehud for Fænotypisk Analyse og<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Isolation and Ex Vivo Culture of VÃƒÅ½Ã‚Â´1+CD4+ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells, an Extrathymic ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â²T-cell Progenitor

Isolering og<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T-celler, en Extrathymic αβT-celleprogenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometri af partikelbundet Bet v 1 Allergen i PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Muse lymfocyt Mærkning af<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-antistofreceptor Målretning for<em&gt; In vivo</em&gt; Cell Trafficking af PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...