Name: assessment of lymphocyte migration in an ex vivo transmigration system
Uploaded: 2019-09-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System at JoVE.com

Ces travaux ont été financés par l'American Lung Association (K.J.W.), le fonds Memorial Eugene Kenney attribué à T.A.W. et K.J.W., un généreux soutien de démarrage de l'Université de l'Utah pour K.J.W., et un prix du ministère des Anciens Combattants à T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. est le récipiendaire d'un prix de chercheur en carrière scientifique (IK6 BX003781) du ministère des Anciens Combattants. Les auteurs tiennent à souligner l'aide éditoriale de Mme Lisa Chudomelka. Les auteurs remercient le noyau de cytométrie des flux de l'UNMC pour leur soutien dans la collecte des données de cytométrie de flux générées pour ce manuscrit.

Toutes les méthodes décrites ici ont été examinées et approuvées par les comités institutionnels de soins et d'utilisation des animaux du Centre médical de l'Université du Nebraska (UNMC) et de l'Université de l'Utah.
1. Configuration et préparation des réactifs
<ol><li>
Préparer les médias complets du RPMI (Roswell Park Memorial Institute).
	<ol>
<li>Ajouter 10 ml de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (SGF) à 90 ml de RPMI.</li>
		<li>Ajouter 1 mL d...

<ol>
	<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Moser, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+History+of+Chemoattractant+Research.">Editorial: History of Chemoattractant Research.</a> Frontiers in Immunology. 6, 548 (2015).</li><li>Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+sound+the+alarmin:+The+role+of+atypical+chemokine+in+inflammation+and+cancer.">Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer.</a> Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).</li><li>Charo, I. F., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+roles+of+chemokines+and+chemokine+receptors+in+inflammation.">The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation.</a> The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).</li><li>Abboud, D., Hanson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+neutralization+as+an+innovative+therapeutic+strategy+for+atopic+dermatitis.">Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis.</a> Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).</li><li>Aldinucci, D., Casagrande, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+CCL5/CCR5+Axis+against+the+Progression+of+Gastric+Cancer.">Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477 (2018).</li><li>Chonco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+DNA+Aptamers+Against+CCL21+Protein:+Characterization+and+Biomedical+Applications+for+Targeted+Drug+Delivery+to+T+Cell-Rich+Zones.">Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones.</a> Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).</li><li>Trivedi, P. J., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+Chemokine+Receptors+as+Therapeutic+Targets+in+Inflammatory+Bowel+Disease;+Pitfalls+and+Promise.">Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise.</a> Journal of Crohn's and Colitis. 12 (12), 1508 (2018).</li><li>Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+of+chemotaxis+as+a+window+into+mechanisms+of+toxicant-induced+immunomodulation.">In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation.</a> Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).</li><li>Davis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+studying+the+immune+system+leads+us+to+new+medicines.">How studying the immune system leads us to new medicines.</a> Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).</li><li>Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+chemokine+expression+following+respiratory+virus+infection+reflects+Th1-+or+Th2-biased+immunopathology.">Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology.</a> Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).</li><li>Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+chemokines+CCL2+and+CXCL10+by+matrix+metalloproteinases-2+and+-9:+implications+for+chemotaxis.">Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis.</a> Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).</li><li>Burrell, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+Node+Stromal+Fiber+ER-TR7+Modulates+CD4++T+Cell+Lymph+Node+Trafficking+and+Transplant+Tolerance.">Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance.</a> Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).</li><li>Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminins+affect+T+cell+trafficking+and+allograft+fate.">Laminins affect T cell trafficking and allograft fate.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).</li><li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th2+cell+differentiation+from+naive+CD4(+)+T+cells+is+enhanced+by+autocrine+CC+chemokines+in+atopic+diseases.">Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases.</a> Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).</li><li>Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Arrestin-2-Dependent+Signaling+Promotes+CCR4-mediated+Chemotaxis+of+Murine+T-Helper+Type+2+Cells.">beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+antagonist+for+CCR4+attenuates+allergic+lung+inflammation+in+a+mouse+model+of+asthma.">A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma.</a> Science Reports. 7 (1), 15038 (2017).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+helper+CD4+T+cells+during+acute+and+stable+allergic+asthma.">Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma.</a> Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).</li><li>Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Group+2+Innate+Lymphoid+Cells+in+Allergic+Airway+Inflammation+Models+in+the+Mouse.">Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse.</a> Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).</li><li>Li, B. W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group+2+Innate+Lymphoid+Cells+Exhibit+a+Dynamic+Phenotype+in+Allergic+Airway+Inflammation.">Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1684 (2017).</li><li>Warren, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+differences+in+activation+of+lung-related+type-2+innate+lymphoid+cells+in+experimental+asthma.">Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma.</a> Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).</li><li>Warren, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovalbumin-sensitized+mice+have+altered+airway+inflammation+to+agriculture+organic+dust.">Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust.</a> Respiratory Research. 20 (1), 51 (2019).</li><li>Poole, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphabeta+T+cells+and+a+mixed+Th1/Th17+response+are+important+in+organic+dust-induced+airway+disease.">alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease.</a> Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).</li><li>Matsuo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CCR4+antagonist+ameliorates+atopic+dermatitis-like+skin+lesions+induced+by+dibutyl+phthalate+and+a+hydrogel+patch+containing+ovalbumin.">A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin.</a> Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).</li><li>Mikhak, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+CCR4+and+CCR8+to+antigen-specific+T(H)2+cell+trafficking+in+allergic+pulmonary+inflammation.">Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).</li><li>Monticelli, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells+promote+lung-tissue+homeostasis+after+infection+with+influenza+virus.">Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus.</a> Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).</li><li>Saenz, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL25+elicits+a+multipotent+progenitor+cell+population+that+promotes+T(H)2+cytokine+responses.">IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses.</a> Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).</li><li>Hoyler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+GATA-3+controls+cell+fate+and+maintenance+of+type+2+innate+lymphoid+cells.">The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells.</a> Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).</li><li>Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+cytokine+receptor+gamma+chain+plays+an+essential+role+in+regulating+lymphoid+homeostasis.">The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).</li><li>Warren, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSV-specific+anti-viral+immunity+is+disrupted+by+chronic+ethanol+consumption.">RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption.</a> Alcohol. , (2016).</li><li>Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+association+between+MMP-9+and+impaired+T+cell+migration+in+ethanol-fed+BALB/c+mice+infected+with+Respiratory+Syncytial+Virus-2A.">An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A.</a> Alcohol. , (2018).</li><li>Molteni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+device+to+concurrently+assess+leukocyte+extravasation+and+interstitial+migration+within+a+defined+3D+environment.">A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment.</a> Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).</li><li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+in+vitro+3D+co-culture+model+to+engineer+vascularized+bone-mimicking+tissues+combining+computational+tools+and+statistical+experimental+approach.">Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach.</a> Biomaterials. 76, 157-172 (2016).</li><li>Jeon, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+3D+vascularized+organotypic+microfluidic+assays+to+study+breast+cancer+cell+extravasation.">Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).</li></ol>

Ici, nous présentons une méthode bien établie pour évaluer la migration chimiokine-induite des lymphocytes dans un système de transmigration ex vivo. Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole, dont la première est de vérifier l'expression du récepteur correct de chimiokine sur les cellules immunitaires dans l'expérience. Dans nos mains, nous avons choisi CCR4 en raison du corps de la littérature qui souligne l'importance de CCR4 sur les cellules T aide Th2 dans l'inflammation allergique. L'inflammati...

Cette méthode originale de transmigration a été présentée par Stephen Boyden en 1962 dans le Journal of Experimental Medicine1. Une grande partie de ce que nous savons sur la chimiotaxie et la chimiothérapeutique ne serait pas possible sans le développement de la chambre Boyden. Avant la découverte de la première chimiokine en 1977, les systèmes de transmigration ex vivo ont été utilisés pour en apprendre davantage sur les facteurs sériques qui pourraient arrêter le mouvement cellulaire dans les macrophages tout en amplifiant la motilité cellulaire chez les neutrophiles1,2. Une énorme richesse de connaissances a été développée en ce qui concerne la migration des cellules immunitaires, et à ce jour, 47 chemokines ont été découverts avec 19 récepteurs correspondants3,4. En outre, des multitudes d'inhibiteurs/améliorateurs de ces voies de chimiokine ont subi le développement à des fins thérapeutiques5,6,7,8. Beaucoup de ces composés ont été testés dans des chambres de transmigration similaires pour comprendre les interactions directes entre les composés et la réactivité des cellules immunitaires à une chimiokine donnée9.
La transmigration, ou diapède, dans les tissus enflammés est un processus essentiel à une réponse inflammatoire saine à l'infection claire10,11. Une chambre Boyden, un système de transmigration ou un appareil de transwell sont généralement composés de deux chambres séparées par une membrane poreuse1,12. La chambre inférieure tient le plus souvent des supports contenant la chimiokine d'intérêt, tandis que les leucocytes sont placés dans la chambre supérieure. La taille des pores de la membrane peut être sélectionnée en fonction de la taille de la cellule d'intérêt. Pour ce projet, nous avons sélectionné une membrane poreuse de 3 m, car les cellules lymphoïdes ont une taille de 7 à 20 m, selon le stade du développement cellulaire. Cette taille de pores assure que ces cellules ne tombent pas passivement à travers les pores, mais qu'elles migrent activement en réponse au gradient de chimiokine.
Le principal avantage de ce protocole est sa rentabilité. La transmigration in vivo est difficile parce qu'elle nécessite une formation approfondie sur la manipulation et la chirurgie des animaux, et implique souvent une microscopie de haute puissance qui n'est pas toujours disponible pour un chercheur. Le criblage rentable des composés censés améliorer ou inhiber la transmigration peut être accompli avant l'imagerie in vivo. Puisque le système de transmigration est étroitement commandé, les cellules peuvent être traitées d'abord puis ajoutées à l'appareil de transwell, ou, vice versa, la chimiokine peut être traitée d'abord avec un inhibiteur de chimiokine puis des cellules ajoutées à l'appareil de transwell. Enfin, les cellules endothéliales et/ou les protéines membranaires du sous-sol peuvent être ajoutées au fond de l'insertion de transwell 1-2 jours avant l'expérience de transmigration pour comprendre l'implication de ces cellules de barrière dans la chimioïétique. Encore une fois, ces manipulations du système fournissent un moyen puissant de déterminer des informations importantes sur l'efficacité d'un composé donné avant des études in vivo plus compliquées.
L'utilisation d'un système de chambre de transmigration est un moyen efficace d'évaluer la mobilité des lymphocytes dans diverses conditions in vivo et in vitro12,13,14. Ici, nous décrivons une méthode optimisée pour évaluer la réactivité ex vivo de lymphocyte aux chemokines dans une chambre de transmigration. Dans cet exemple d'expérience, les lymphocytesT CD4 et le groupe 2 lymphoïdes innés (ILC2) ont été isolés chez des souris mâles et femelles, BALB/c après exposition ova-allergène. Une hypothèse a été générée que CCR4- CD45- Lineage- (LIN-) ILC2 à partir de souris à défi allergène migrerait plus efficacement vers CCL17 et CCL22 que CCR4- CD4- T cellules d'aide. CCL17 et CCL22 sont des chemokines couramment produites par les cellules dendritiques et les macrophages du phénotype M2 (allergique), entre autres cellules, dans l'allergie15,16. CCL17 et CCL22 peuvent être considérés comme des biomarqueurs de l'inflammation allergique car ils sont facilement détectés dans les poumons lors d'exacerbations des voies respiratoires16,17,18. Fait important, l'expression CCR4 est élevée par rapport aux témoins non traités, comme le révèlent les données bioinformatiques générées par ilC2 isolés à partir d'animaux traités par les acariens de la poussière domestique, et de même ILC2 d'animaux naïfs traités ex vivo avec IL-33 ( cytokine innée favorisant l'allergène) upregulates CCR419,20. En outre, selon les données pour ILC2 dans la base de données immunologique de projet de génome (www.immgen.org), l'ARNm cCR4 est fortement exprimé dans ces cellules immunitaires innées. À ce jour, on sait peu de choses concernant le trafic d'ILC2 dans les tissus, mais il est probable que les cellules ILC2 etCD4-T utilisent des chimiocines et des récepteurs similaires pour la chimiotaxie et la chimiogénie car elles expriment des facteurs de transcription et des récepteurs similaires. Ainsi, nous avons comparé la réactivité du CCL17 à la réactivité du CCL22, des lymphocytes ILC2 et CD4T, provenant à la fois d'animaux mâles et femelles, d'animaux à défi OVA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15250061</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>329424</td>
			<td>U-100 Syringes Micro-Fine 28G 1/2&#34; 1cc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td>Dilute to 1x in RPMI media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td>polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 um transwell inserts</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-288</td>
			<td>24-well plate containing 12 transwell inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3x stabilizing fixative</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>338036</td>
			<td>Prepare 1x solution according to manufacturers protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene tubes</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>38007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-106</td>
			<td>polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-chamber easy separation magnet</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>18103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>A1049201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced cell strainer, 40 um</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-375</td>
			<td>nylon mesh, 40 micron strainers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Hydroxide, Reagent Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239186-25G</td>
			<td>20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- mouse CCR4; APC-conjugated</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>131211</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>557396</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11c; PE eFluor 610</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>61-0114-82</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD16/32, Fc block</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553141</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>47-0193-82</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>552774</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD45; PE conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>56087</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse ICOS (CD278)</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>564070</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553164</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>145311</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1450102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Dissociator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td>0.5% in serum-free RPMI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter Clides</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1450015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Egg Ovalbumin, Grade V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5503-10G</td>
			<td>500 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1, Filtered</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216)</td>
			<td>25 U/mL in RPMI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compensation beads</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>01-1111-41</td>
			<td>1 drop per contol tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation Tubes</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-335</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>554657</td>
			<td>1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated-FBS</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-525H</td>
			<td>10% in complete RPMI &#38; ILC2 Expansion Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CCL17</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02954-20</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CCL22</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02856-20</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CD4+ T cell enrichment kit</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>19852</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse IL-2</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02764-20</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse ILC2 enrichment kit</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>19842</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse recombinant IL-33</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>78044</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>22400071</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation Buffer</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>20144</td>
			<td>1 X PBS + 2% FBS; stored at 4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small animal nebulizer and chamber</td>
			<td>Data Sciences International</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7124; NDC 0338-0048-04</td>
			<td>0.9% Sodium Chloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of lymphocyte migration in an ex vivo transmigration system

Ici, nous présentons une méthode efficace qui peut être exécutée avec les qualifications et les matériaux de laboratoire de base pour évaluer le mouvement chimio-entique de lymphocyte dans un système de transmigration ex vivo. Les cellules lymphoïdes innées du groupe 2 (ILC2) et les cellules d'aide CD4t ont été isolées des rates et des poumons des souris BALB/c de BALB/c d'ovalbumine d'oeufde de poulet (OVA). Nous avons confirmé l'expression de CCR4 sur les deux cD4- lymphocytes T et ILC2, comparativement. LE CCL17 et le CCL22 sont les ligands connus pour le CCR4; par conséquent, en utilisant cette méthode de transmigration ex vivo, nous avons examiné le CCL17- et le mouvement induit par le CCL22 deslymphocytes CCR4. Pour établir des gradients de chimiokine, CCL17 et CCL22 ont été placés dans la chambre inférieure du système de transmigration. Des lymphocytes isolés ont alors été ajoutés aux chambres supérieures et sur une période de 48 h les lymphocytes ont activement migré par des pores de 3 m vers la chimiokine dans la chambre inférieure. Il s'agit d'un système efficace pour déterminer la chimioïque des lymphocytes, mais, naturellement, n'imite pas les complexités trouvées dans les microenvironnements in vivo d'organe. C'est une limitation de la méthode qui peut être surmontée par l'ajout de l'imagerie in situ de l'organe et des lymphocytes à l'étude. En revanche, l'avantage de cette méthode est que peut être effectuée par un technicien d'entrée de gamme à un taux beaucoup plus rentable que l'imagerie en direct. Comme les composés thérapeutiques deviennent disponibles pour améliorer la migration, comme dans le cas de la tumeur infiltrant les cellules immunitaires cytotoxiques, ou pour inhiber la migration, peut-être dans le cas des maladies auto-immunes où l'immunopathologie est préoccupante, cette méthode peut être utilisée comme un outil de dépistage. En général, la méthode est efficace si la chimiokine d'intérêt génère constamment des chimioïques à un niveau statistiquement plus élevé que le contrôle des médias. Dans de tels cas, le degré d'inhibition/amélioration par un composé donné peut également être déterminé.

Expression CCR4 sur les lymphocytes T CD4 et ILC2.
Pour le succès de l'expérience de transmigration ex vivo, il est impératif de déterminer si les lymphocytes sont sensibles au CCL17 et au CCL22 par cCR4; par conséquent, nous avons déterminé l'expression de CCR4 sur les deux cellules CD4et T et ILC2 par cytométrie de flux. Bien qu'il soit bien connu que les lymphocytes T CD4et aidespécifiques ovabiques expriment cCR4, on en sait moins sur l'expre...

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Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Dans ce protocole, les lymphocytes sont placés dans la chambre supérieure d'un système de transmigration, séparés de la chambre inférieure par une membrane poreuse. La chimiokine est ajoutée à la chambre inférieure, qui induit une migration active le long d'un gradient de chimiokine. Après 48 h, les lymphocytes sont comptés dans les deux chambres pour quantifier la transmigration.

Évaluation de la migration des lymphocytes dans un système de transmigration ex vivo

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

La transmigration des lymphocytes est une caractéristique importante de toute réponse immunitaire. Par conséquent, ce protocole est significatif parce qu’il permet à un chercheur d’évaluer la mobilité des lymphocytes dans un système in vitro bien défini. Le principal avantage de cette technique est que diverses chimiokines peuvent être évaluées pour déterminer leur efficacité d’induire la migration dans les cellules récemment définies, telles que le groupe deux cellules lymphoïdes innées, ou ILC2.Un deuxième avantage est que les inhibiteurs ou les thérapies biologiques visant à bloquer certaines voies de chimiokine peuvent être testés par cette méthode avant de faire des expériences plus coûteuses avec des animaux. Commencez par exciser les poumons et la rate des souris mâles et femelles euthanasiées traitées aux ovules à l’aide de deux à trois animaux par groupe. Placer les tissus excisés dans des tubes de dissociation séparés selon le type de tissu et le sexe animal.Placez le tissu pulmonaire dans 500 microlitres de supports de dissociation pulmonaire dans un tube de dissociation, placez le tube dans le dissociateur automatisé des tissus et dissociez-le à l’aide du protocole pulmonaire. Répétez ces étapes pour un total de deux fois. Pour dissocier le tissu de la rate, placez-le dans 500 microlitres de médias RPMI complets dans le dissociateur, puis utilisez le protocole de la rate.Travaillant dans une armoire de sécurité biologique utilisant la technique stérile à partir de maintenant, filtrez chaque tissu dissocié par une passoire de cellules de 40 micromètres, et recueillez dans des tubes coniques de 50 millilitres. Rincer les tubes de dissociation contenant des homogénéités pulmonaires avec cinq millilitres de supports de dissociation pulmonaire supplémentaires, des tubes contenant des homogénéisations de la rate avec cinq millilitres de RPMI complet, et filtrer leur contenu à travers les filtres utilisés pour leurs tissus correspondants. Pour dissocier davantage le tissu pulmonaire, incuber les homogénéisations pulmonaires pendant 15 à 30 minutes dans un incubateur de 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.Ajoutez ensuite cinq millilitres de RPMI complet aux homogénéisations pulmonaires et de la rate, ainsi qu’à la centrifugeuse. Après avoir jeté le supernatant, mélanger les granulés contenant des splenocytes et des cellules pulmonaires du groupe d’animaux du même sexe en un seul tube conique de 50 millilitres. Ajouter 10 millilitres de RPMI complet à chaque tube, et resuspendre.Déterminer le nombre total de cellules à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé. Réglez les suspensions cellulaires mâles et femelles à 100 millions de cellules par millilitre dans le tampon de séparation, puis ajoutez-les à un tube de polystyrène de cinq millilitres. Après isoler le groupe deux cellules lymphoïdes innées de 2/3 des cellules totales décrites dans le manuscrit, utilisez les cellules restantes pour la procédure d’isolement de cellule T CD4-positive.Pour commencer l’isolement des lymphocytes T CD4 positifs, ajoutez du sérum de rat à la suspension d’enrichissement des lymphocytes T CD4. Ajouter ensuite un cocktail d’isolement à l’échantillon cellulaire et incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Vortex sphères rapides pendant 30 secondes, et ajouter à l’échantillon cellulaire pour atteindre une dilution de 75 microlitres par millilitre.Mélanger délicatement et incuber pendant 2 1/2 minutes à température ambiante. Garnir les échantillons d’environ deux millilitres de tampon de séparation jusqu’à trois millilitres, placer les tubes de cinq millilitres dans l’aimant de séparation facile de huit chambres et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Puis inclinez l’aimant vers l’avant, et pipette chaque suspension cellulaire dans un tube propre de cinq millilitres.Ajouter 1,5 millilitres de RPMI sans sérum à chaque tube et centrifugeuse. Versez le supernatant, et resuspendez la pastille cd4-positive de cellule T à 10 millions de cellules par millilitre dans le RPMI sérique-libre. Pour commencer cette partie du protocole, déterminez le nombre d’inserts Transwell nécessaires à l’expérience pour les lymphocytes T ILC2 et CD4 positifs comme décrit dans le manuscrit.Déplacez doucement les inserts Transwell de trois microns des rangées moyennes d’une plaque de 24 puits vers les rangées supérieure et inférieure de la même plaque de 24 puits avec une pointe de pipette et des mains gantées. Ajouter 500 microlitres de supports migratoires avec CCL17 à 1/3 des puits dans la rangée centrale de la plaque de 24 puits. Ajouter 500 microlitres de supports migratoires avec CCL22 à un autre 1/3 des puits.Et enfin, ajoutez 500 microlitres de RPMI sans sérum ne contenant aucune chimiokine au dernier tiers des puits. Étiquetez clairement le couvercle de la plaque avec le nom du média de transmigration approprié placé dans les puits du bas. Ensuite, placez les inserts Transwell dans les puits contenant les différents traitements.Ajouter délicatement 100 microlitres de lymphocytes T CD4 ou ILC2 au puits supérieur de chaque insert, en s’assurant de ne pas mélanger ou pipette la suspension cellulaire de haut en bas dans les Transwells. Étiquetez clairement le couvercle sur la plaque avec le type de cellule placé dans chaque puits, et écrivez la date et l’heure de la journée que les cellules ont été ajoutées. Répétez ce processus à partir de l’enlèvement des inserts Transwell de la plaque jusqu’à ce que toutes les cellules aient été placées dans des inserts Transwell avec des supports.Une fois que les cellules d’intérêt sont isolées, les étapes les plus importantes sont de garder une trace des chimiokines et des types de cellules qui sont placés dans des puits particuliers, d’ajouter doucement des cellules aux chambres supérieures, et enfin d’éviter tout contact inutile avec la plaque de transmigration pendant l’incubation de 48 heures. Placez délicatement la plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et incubez pendant 48 heures, en vous assurant de minimiser le contact avec la plaque pendant la période d’incubation. Après avoir délicatement retiré la plaque de l’incubateur, retirez tous les inserts Transwell des rangées du milieu dans les puits vides juste au-dessus ou au-dessous.Recueillir les cellules des puits supérieur et inférieur des inserts Transwell dans des tubes étiquetés en haut ou en bas avec CCL17, CCL22 ou médias, avec le type de cellule, et avec le numéro de réplique. Rincez les puits du bas avec 500 microlitres de 1x PBS, recueillez-les dans les tubes correspondants et faites de même pour les puits du haut. Centrifuger les tubes à 378 fois g à température ambiante pendant cinq minutes.Utilisez une pipette pour enlever délicatement tous les supernatants, puis résuspendez les granulés T et ILC2 avec 50 microlitres de 1x PBS. Après avoir enlevé 10 microlitres de la suspension cellulaire, ajouter 90 microlitres de 0,4% de bleu trypan. Comptez les cellules sur le compteur de cellules automatisé.Et pour chaque échantillon, enregistrer le pourcentage de viabilité et le nombre de cellules par millilitre, et de déterminer le nombre total de cellules par traitement dans la chambre supérieure et inférieure. Quand l’expression de CCR4 a été évaluée sur les cellules T CD4-positives et ILC2 par cytométrie de flux, il n’y avait aucune différence entre les hôtes masculins et femelles. Cependant, l’expression de CCR4 sur une base par cellule sur ILC2 était plus élevée par rapport aux lymphocytes T CD4-positifs.Lorsque la chambre inférieure de l’appareil Transwell était remplie de médias de culture cellulaire non traités, de supports contenant du CCL22 ou de supports contenant du CCL17, moins de 14 % des cellules ont migré dans des conditions de contrôle des médias. En réponse au CCL22, les deux types de cellules, qu’ils proviennent d’hôtes mâles ou féminins, ont répondu au CCL22. En outre, CCL22 a induit une migration plus importante que CCL17 chez les hommes ILC2.D’autre part, CCL17 a induit une migration significative des lymphocytes T CD4 féminins et ilc2 par rapport aux seuls médias. Le traitement de CCL17 n’était pas différent des médias pour les lymphocytes T CD4-positifs masculins ou ilc2 masculins. Dans des conditions sous-optimales, lorsque la plaque avec des cellules CD4 est restée à température ambiante pendant les 24 premières heures, puis s’est déplacée dans l’incubateur, il n’y a pas eu de migration vers CCL22 et CCL17.En outre, la viabilité des cellules était particulièrement faible pour les cellules de la chambre inférieure, montrant l’importance d’utiliser les températures et les conditions correctes décrites dans ce protocole pour obtenir des résultats optimaux. Une fois la procédure de transmigration terminée, il faut voir une migration importante vers la chimiokine d’intérêt par rapport aux puits de contrôle des médias. S’il n’y a pas de migration significative observée, on peut supposer que la procédure n’a pas fonctionné correctement ou que les lymphocytes ne sont pas sensibles à la chimiokine en question.Cette technique peut être largement utilisée pour comprendre la migration des lymphocytes lorsque ces lymphocytes ont subi un large éventail de traitements in vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

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Human T isolement des lymphocytes, de la Culture et de l&#39;analyse des migrations In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Recherche

Immunologie et infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

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L&#39;imagerie non invasive des Homing leucocytes et des migrations In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Évaluation quantitative des neutrophiles migrations humaines à travers une culture d&#39;épithélium de la vessie

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

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L&#39;évaluation de l&#39;Innate détection du VIH-1 CD4 infectés<sup&gt; +</sup&gt; Cellules T par les cellules dendritiques plasmacytoïdes Utilisation d&#39;un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système de co-culture.

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An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

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Une<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modèle de T-Cell Attaque de Oligodendrocyte dirigée dans aigus tranches cérébrales

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

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Lymphocytes Isolation de la peau humaine pour Analyse phénotypique et<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture cellulaire

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Isolation and Ex Vivo Culture of VÃƒÅ½Ã‚Â´1+CD4+ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells, an Extrathymic ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â²T-cell Progenitor

Isolement et<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; cellules γδ T, un extrathymique αβT cellules progénitrices

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Cytométrie en flux Analyse de la particule liée Bet v 1 Allergène en PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murine lymphocytaire par étiquetage<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-anticorps du récepteur de ciblage pour<em&gt; In Vivo</em&gt; Le trafic cellulaire par PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...