Name: assessment of lymphocyte migration in an ex vivo transmigration system
Uploaded: 2019-09-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der American Lung Association (K.J.W.), dem Memorial Eugene Kenney Fund an T.A.W. und K.J.W., großzügiger Start-up-Unterstützung der University of Utah für K.J.W. und einem Department of Veterans Affairs Award an T.A.W. (VA I01BX0003635) finanziert. T.A.W. ist Träger des Research Career Scientist Award (IK6 BX003781) des Department of Veterans Affairs. Die Autoren möchten die redaktionelle Unterstützung von Frau Lisa Chudomelka würdigen. Die Autoren danken dem UNMC Flow Cytometry Core für ihre Unterstützung bei der Erfassung der für dieses Manuskript generierten Flow-Zytometrie-Daten.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees am University of Nebraska Medical Center (UNMC) und der University of Utah überprüft und genehmigt.
1. Aufbau und Herstellung von Reagenzien
<ol><li>
Bereiten Sie komplette RPMI (Roswell Park Memorial Institute) Medien vor.
	<ol>
<li>Fügen Sie 10 ml hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (FBS) zu 90 ml RPMI hinzu.</li>
		<li>1 ml 100x Penicillin-Streptomycin-Glutamin zu 100 ml von...

<ol>
	<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Moser, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+History+of+Chemoattractant+Research.">Editorial: History of Chemoattractant Research.</a> Frontiers in Immunology. 6, 548 (2015).</li><li>Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+sound+the+alarmin:+The+role+of+atypical+chemokine+in+inflammation+and+cancer.">Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer.</a> Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).</li><li>Charo, I. F., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+roles+of+chemokines+and+chemokine+receptors+in+inflammation.">The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation.</a> The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).</li><li>Abboud, D., Hanson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+neutralization+as+an+innovative+therapeutic+strategy+for+atopic+dermatitis.">Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis.</a> Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).</li><li>Aldinucci, D., Casagrande, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+CCL5/CCR5+Axis+against+the+Progression+of+Gastric+Cancer.">Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477 (2018).</li><li>Chonco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+DNA+Aptamers+Against+CCL21+Protein:+Characterization+and+Biomedical+Applications+for+Targeted+Drug+Delivery+to+T+Cell-Rich+Zones.">Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones.</a> Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).</li><li>Trivedi, P. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+differences+in+activation+of+lung-related+type-2+innate+lymphoid+cells+in+experimental+asthma.">Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma.</a> Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).</li><li>Warren, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovalbumin-sensitized+mice+have+altered+airway+inflammation+to+agriculture+organic+dust.">Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust.</a> Respiratory Research. 20 (1), 51 (2019).</li><li>Poole, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphabeta+T+cells+and+a+mixed+Th1/Th17+response+are+important+in+organic+dust-induced+airway+disease.">alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease.</a> Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).</li><li>Matsuo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CCR4+antagonist+ameliorates+atopic+dermatitis-like+skin+lesions+induced+by+dibutyl+phthalate+and+a+hydrogel+patch+containing+ovalbumin.">A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin.</a> Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).</li><li>Mikhak, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+CCR4+and+CCR8+to+antigen-specific+T(H)2+cell+trafficking+in+allergic+pulmonary+inflammation.">Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).</li><li>Monticelli, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells+promote+lung-tissue+homeostasis+after+infection+with+influenza+virus.">Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus.</a> Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).</li><li>Saenz, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL25+elicits+a+multipotent+progenitor+cell+population+that+promotes+T(H)2+cytokine+responses.">IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses.</a> Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).</li><li>Hoyler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+GATA-3+controls+cell+fate+and+maintenance+of+type+2+innate+lymphoid+cells.">The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells.</a> Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).</li><li>Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+cytokine+receptor+gamma+chain+plays+an+essential+role+in+regulating+lymphoid+homeostasis.">The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).</li><li>Warren, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSV-specific+anti-viral+immunity+is+disrupted+by+chronic+ethanol+consumption.">RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption.</a> Alcohol. , (2016).</li><li>Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+association+between+MMP-9+and+impaired+T+cell+migration+in+ethanol-fed+BALB/c+mice+infected+with+Respiratory+Syncytial+Virus-2A.">An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A.</a> Alcohol. , (2018).</li><li>Molteni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+device+to+concurrently+assess+leukocyte+extravasation+and+interstitial+migration+within+a+defined+3D+environment.">A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment.</a> Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).</li><li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+in+vitro+3D+co-culture+model+to+engineer+vascularized+bone-mimicking+tissues+combining+computational+tools+and+statistical+experimental+approach.">Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach.</a> Biomaterials. 76, 157-172 (2016).</li><li>Jeon, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+3D+vascularized+organotypic+microfluidic+assays+to+study+breast+cancer+cell+extravasation.">Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).</li></ol>

Hierbei stellen wir eine etablierte Methode zur Beurteilung der chemokininduzierten Migration von Lymphozyten in einem Ex-vivo-Transmigrationssystem vor. Es gibt mehrere kritische Schritte im Protokoll, von denen der erste die Überprüfung der Expression des richtigen Chemokinrezeptors auf die Immunzellen im Experiment ist. In unseren Händen haben wir uns für CCR4 entschieden, weil die Literatur die Bedeutung von CCR4 auf Th2-Helfer-T-Zellen bei allergischen Entzündungen hervorhebt. Ovalbumin-induzierte Entzündung w...

Diese ursprüngliche Transmigration-Methode wurde 1962 von Stephen Boyden im Journal of Experimental Medicine1vorgestellt. Vieles von dem, was wir über Chemotaxis und Chemokinetik wissen, wäre ohne die Entwicklung der Boydenkammer nicht möglich. Vor der Entdeckung des ersten Chemokins im Jahr 1977 wurden Ex-vivo-Transmigrationssysteme verwendet, um mehr über Serumfaktoren zu erfahren, die zelluläre Bewegungen in Makrophagen festsetzen könnten, während die zelluläre Motilität in Neutrophilen verstärkt wird1,2. Es wurde ein riesiger Wissensschatz in Bezug auf die Immunzellmigration entwickelt, und bis heute wurden 47 Chemokine mit 19 entsprechenden Rezeptoren3,4entdeckt. Darüber hinaus haben viele Inhibitoren/Enhancer dieser Chemokin-Wege eine Entwicklung zu therapeutischenZwecken5,6,7,8. Viele dieser Verbindungen wurden in ähnlichen Transmigrationskammern getestet, um direkte Wechselwirkungen zwischen den Verbindungen und immunzellige Reaktionsfähigkeit auf ein bestimmtes Chemokin zu verstehen9.
Transmigration, oder Diapedese, in entzündetes Gewebe ist ein wesentlicher Prozess für eine gesunde Entzündungsreaktion auf klare Infektion10,11. Ein Boyden-Kammer-, Transmigrationssystem oder Transwell-Apparat besteht in der Regel aus zwei Kammern, die durch eine poröse Membran1,12getrennt sind. Die untere Kammer hält am häufigsten Medien, die das Chemokin von Interesse enthalten, während Leukozyten in der oberen Kammer platziert werden. Die Größe der Pore in der Membran kann basierend auf der Größe der betreffenden Zelle ausgewählt werden. Für dieses Projekt haben wir eine poröse Membran von 3 m ausgewählt, da die Lymphzellen je nach Stadium der zellulären Entwicklung 7-20 m groß sind. Diese Porengröße stellt sicher, dass diese Zellen nicht passiv durch die Poren fallen, sondern dass sie aktiv als Reaktion auf den Chemokingradienten migrieren.
Der hauptvorteil dieses Protokolls ist seine Wirtschaftlichkeit. Die In-vivo-Transmigration ist schwierig, da sie eine umfassende Ausbildung im Umgang mit Tieren und in der Chirurgie erfordert und häufig eine hochleistungsfähige Mikroskopie erfordert, die einem Forscher nicht immer zur Verfügung steht. Kostengünstiges Screening von Verbindungen, von denen angenommen wird, dass sie die Transmigration verbessern oder hemmen, kann vor der In-vivo-Bildgebung durchgeführt werden. Da das Transmigrationssystem streng kontrolliert wird, können Zellen zunächst dem Transwell-Apparat zugesetzt werden, oder umgekehrt kann das Chemokin zuerst mit einem Chemokin-Inhibitor behandelt werden, dann mit Zellen, die dem Transwell-Apparat zugesetzt werden. Schließlich können Endothelzellen und/oder Kellermembranproteine 1-2 Tage vor dem Transmigrationsexperiment an der Unterseite des Transwell-Inserts zugesetzt werden, um die Beteiligung dieser Barrierezellen an der Chemokinetik zu verstehen. Auch diese Manipulationen des Systems bieten ein leistungsfähiges Mittel, um wichtige Informationen über die Wirksamkeit einer bestimmten Verbindung im Vorfeld komplizierterer In-vivo-Studien zu bestimmen.
Die Verwendung eines Transmigrationskammersystems ist eine effektive Möglichkeit, die Lymphozytenmobilität unter verschiedenen In-vivo- und In-vitro-Bedingungen12,13,14zu bewerten. Hierin beschreiben wir eine optimierte Methode zur Beurteilung der Ex-vivo-Lymphozytenreaktion auf Chemokine in einer Transmigrationskammer. In diesem Beispielexperiment wurden CD4+ T-Zellen und angeborene Lymphzellen der Gruppe 2 (ILC2) nach der OVA-Allergen-Exposition von männlichen und weiblichen BALB/c-Mäusen isoliert. Es wurde die Hypothese erstellt, dass CCR4+ CD45+ Lineage- (LIN-) ILC2 von allergenbekämpften Mäusen effizienter in Richtung CCL17 und CCL22 migrieren würde als CCR4+ CD4+ T-Helferzellen. CCL17 und CCL22 sind Chemokine, die häufig von dendritischen Zellen und Makrophagen des M2 (allergischen) Phänotyps unter anderen Zellen, in Allergie15,16produziert werden. CCL17 und CCL22 können als Biomarker allergischer Entzündungen betrachtet werden, da sie bei Atemwegsexazerbationen16,17,18leicht in der Lunge nachgewiesen werden können. Wichtig ist, dass die CCR4-Expression im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen erhöht ist, wie aus bioinformatischen Daten hervorgeht, die aus ILC2 gewonnen wurden, das von Hausstaubmilben behandelten Tieren isoliert wurde, und ähnlich ILC2 von naiven Tieren, die ex vivo mit IL-33 behandelt wurden ( allergenförderndes angeborenes Zytokin) upreguliert CCR419,20. Darüber hinaus ist CCR4 mRNA nach Daten für ILC2 in der Datenbank des Immunologischen Genomprojekts (www.immgen.org) in diesen angeborenen Immunzellen stark exprimiert. Bis heute ist wenig über den Handel mit ILC2 in Gewebe bekannt, aber es ist wahrscheinlich, dass die ILC2- und CD4+ T-Zellen ähnliche Chemokine und Rezeptoren für Chemotaxis und Chemokinetik verwenden, da sie ähnliche Transkriptionsfaktoren und Rezeptoren ausdrücken. So verglichen wir CCL17 versus CCL22 Reaktionsfähigkeit, von ILC2 und CD4+ T Lymphozyten, von männlichen und weiblichen, OVA-herausgeforderten Tieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15250061</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>329424</td>
			<td>U-100 Syringes Micro-Fine 28G 1/2&#34; 1cc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td>Dilute to 1x in RPMI media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td>polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 um transwell inserts</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-288</td>
			<td>24-well plate containing 12 transwell inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3x stabilizing fixative</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>338036</td>
			<td>Prepare 1x solution according to manufacturers protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene tubes</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>38007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-106</td>
			<td>polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-chamber easy separation magnet</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>18103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>A1049201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced cell strainer, 40 um</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-375</td>
			<td>nylon mesh, 40 micron strainers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Hydroxide, Reagent Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239186-25G</td>
			<td>20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- mouse CCR4; APC-conjugated</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>131211</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>557396</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11c; PE eFluor 610</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>61-0114-82</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD16/32, Fc block</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553141</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>47-0193-82</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>552774</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD45; PE conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>56087</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse ICOS (CD278)</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>564070</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553164</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>145311</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1450102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Dissociator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td>0.5% in serum-free RPMI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter Clides</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1450015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Egg Ovalbumin, Grade V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5503-10G</td>
			<td>500 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1, Filtered</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216)</td>
			<td>25 U/mL in RPMI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compensation beads</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>01-1111-41</td>
			<td>1 drop per contol tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation Tubes</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-335</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>554657</td>
			<td>1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated-FBS</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-525H</td>
			<td>10% in complete RPMI &#38; ILC2 Expansion Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CCL17</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02954-20</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CCL22</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02856-20</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CD4+ T cell enrichment kit</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>19852</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse IL-2</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02764-20</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse ILC2 enrichment kit</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>19842</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse recombinant IL-33</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>78044</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>22400071</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation Buffer</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>20144</td>
			<td>1 X PBS + 2% FBS; stored at 4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small animal nebulizer and chamber</td>
			<td>Data Sciences International</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7124; NDC 0338-0048-04</td>
			<td>0.9% Sodium Chloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of lymphocyte migration in an ex vivo transmigration system

Hierbei präsentieren wir eine effiziente Methode, die mit grundlegenden Laborfertigkeiten und Materialien ausgeführt werden kann, um die lymphozyte chemokine Bewegung in einem Ex-vivo-Transmigrationssystem zu bewerten. Angeborene Lymphzellen der Gruppe 2 (ILC2) und CD4+ T-Helferzellen wurden aus Milz und Lunge von Hühnerei-Ovalbumin (OVA)-herausgeforderten BALB/c-Mäusen isoliert. Wir haben die Expression von CCR4 auf CD4+ T-Zellen und ILC2, vergleichsweise bestätigt. CCL17 und CCL22 sind die bekannten Liganden für CCR4; Daher haben wir mit dieser Ex-vivo-Transmigration-Methode die CCL17- und CCL22-induzierte Bewegung von CCR4+ Lymphozyten untersucht. Um Chemokin-Gradienten zu ermitteln, wurden CCL17 und CCL22 in die untere Kammer des Transmigration-Systems gelegt. Isolierte Lymphozyten wurden dann den oberen Kammern zugesetzt und über einen Zeitraum von 48 h wanderten die Lymphozyten aktiv durch 3 m Poren in Richtung Chemokin in der unteren Kammer. Dies ist ein wirksames System zur Bestimmung der Chemokinetik von Lymphozyten, imitiert aber verständlicherweise nicht die Komplexitäten, die in den in vivo Organmikroumgebungen zu finden sind. Dies ist eine Einschränkung der Methode, die durch die Zugabe von In-situ-Bildgebung des untersuchten Organs und Lymphozyten überwunden werden kann. Im Gegensatz dazu besteht der Vorteil dieser Methode darin, dass ein Einsteigertechniker viel kostengünstiger als Live-Bildgebung durchgeführt werden kann. Da therapeutische Verbindungen zur Verbesserung der Migration verfügbar werden, wie im Falle von Tumor infiltrierenden zytotoxischen Immunzellen, oder um die Migration zu hemmen, vielleicht im Falle von Autoimmunerkrankungen, bei denen die Immunpathologie von Beunruhigung ist, kann diese Methode als Screening-Tool. Im Allgemeinen ist die Methode wirksam, wenn das Chemokin von Interesse konsequent Chemokinetik auf einem statistisch höheren Niveau als die Medienkontrolle erzeugt. In solchen Fällen kann auch der Grad der Hemmung/Verbesserung durch eine bestimmte Verbindung bestimmt werden.

CCR4-Expression auf CD4+ T-Zellen und ILC2.
Für den Erfolg des Ex-vivo-Transmigrationsexperiments ist es unerlässlich, zu bestimmen, ob die Lymphozyten auf CCL17 und CCL22 über CCR4 reagieren; Daher haben wir die CCR4-Expression sowohl auf CD4+ T-Zellen als auch auf ILC2 durch Durchflusszytometrie bestimmt. Obwohl bekannt ist, dass OVA-spezifische CD4+ Helfer-T-Zellen CCR4 exprimieren, ist weniger über die Expression von CCR4 auf ILC2 bekannt. <strong...

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Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

In diesem Protokoll werden Lymphozyten in die obere Kammer eines Transmigrationssystems gelegt, die durch eine poröse Membran von der unteren Kammer getrennt sind. Chemokin wird der unteren Kammer hinzugefügt, was eine aktive Migration entlang eines Chemokingradienten induziert. Nach 48 h werden Lymphozyten in beiden Kammern gezählt, um die Transmigration zu quantitieren.

Bewertung der Lymphozytenmigration in einem Ex-Vivo-Transmigrationssystem

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Lymphozytentransmigration ist ein wichtiges Merkmal jeder Immunantwort. Daher ist dieses Protokoll von Bedeutung, da es es einem Forscher ermöglicht, die Mobilität von Lymphozyten in einem genau definierten In-vitro-System zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass verschiedene Chemokine bewertet werden können, um ihre Wirksamkeit der Induktion der Migration in kürzlich definierten Zellen zu bestimmen, wie die Gruppe zwei angeborene lymphoide Zellen, oder ILC2.Ein zweiter Vorteil ist, dass Inhibitoren oder biologische Therapien zur Blockierung bestimmter Chemokinwege mit dieser Methode getestet werden können, bevor teurere Experimente mit Tieren durchgeführt werden. Beginnen Sie mit der Ausscheidung von Lungen und Milz von eingeschläferten eizellenbehandelten männlichen und weiblichen Mäusen mit zwei bis drei Tieren pro Gruppe. Zerlegen Sie ausgeschnittene Gewebe in separate Dissoziationsröhren nach Gewebetyp und tierischem Geschlecht.Legen Sie das Lungengewebe in 500 Mikroliter Lungendissoziationsmedien in ein Dissoziationsrohr, legen Sie das Rohr in den automatisierten Gewebedissoziator und dissoziieren Sie es mit dem Lungenprotokoll. Wiederholen Sie diese Schritte insgesamt zweimal. Um Milzgewebe zu dissoziieren, legen Sie es in 500 Mikroliter vollständiger RPMI-Medien in den Dissoziator, und verwenden Sie dann das Milzprotokoll.Wenn Sie in einem biologischen Sicherheitsschrank mit steriler Technik arbeiten, filtern Sie jedes dissoziierte Gewebe durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb und sammeln Sie sich in 50-Milliliter konische Schläuche. Spülen Sie die dissoziationsröhren, die Lungenhomogenate enthalten, mit fünf Millilitern zusätzlicher Lungendissoziationsmedien, Mitmilenhomogenaten mit fünf Millilitern vollständigem RPMI und filtern Sie deren Inhalt durch die Filter, die für die entsprechenden Gewebe verwendet werden. Um das Lungengewebe weiter zu dissoziieren, inkubieren Sie die Lunge 15 bis 30 Minuten in einem 37-Grad-Celsius-Inkubator mit 5% Kohlendioxid.Dann fügen Sie fünf Milliliter komplette sRPMI sowohl auf die Lunge und Milz Homogenate, und Zentrifuge. Nach dem Wegwerfen des Überstandes die Pellets mit Splenozyten und Lungenzellen aus der Gruppe der Tiere des gleichen Geschlechts zu einem einzigen 50-Milliliter konischen Röhrchen kombinieren. Fügen Sie 10 Milliliter vollständiger RPMI zu jeder Röhre hinzu, und setzen Sie sie erneut aus.Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Zellen mithilfe eines automatisierten Zellenzählers. Stellen Sie männliche und weibliche Zellsuspensionen auf 100 Millionen Zellen pro Milliliter im Trennpuffer ein und fügen Sie sie dann zu einem Polystyrolrohr mit fünf Millilitern hinzu. Nach der Isolierung von Gruppe zwei angeborene lymphoide Zellen aus 2/3 der gesamten Zellen, wie im Manuskript beschrieben, verwenden Sie die verbleibenden Zellen für die CD4-positive T-Zell-Isolation.Um die CD4-positive T-Zellisolierung zu starten, fügen Sie der CD4 T-Zellanreicherungsuspension Rattenserum hinzu. Dann fügen Sie Isolationscocktail in die Zellprobe, und inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Wirbel schnelle Kugeln für 30 Sekunden, und fügen Sie die Zellprobe, um eine Verdünnung von 75 Mikroliter pro Milliliter zu erreichen.Sanft mischen und für 2 1/2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Proben mit etwa zwei Millilitern Trennpuffer bis zu drei Millilitern topisieren, die Fünf-Milliliter-Rohre in den achtkammerigen Leichttrennmagneten geben und bei Raumtemperatur fünf Minuten brüten. Dann kippen Sie den Magneten nach vorne und pipette jede Zellsuspension in ein sauberes Fünf-Milliliter-Rohr.Fügen Sie 1,5 Milliliter serumfreies RPMI zu jedem Rohr und Zentrifuge hinzu. Gießen Sie den Überstand ab und setzen Sie das CD4-positive T-Zellpellet bei 10 Millionen Zellen pro Milliliter in serumfreiem RPMI wieder aus. Um diesen Teil des Protokolls zu beginnen, bestimmen Sie die Anzahl der Transwell-Einsätze, die für das Experiment für ILC2- und CD4-positive T-Zellen benötigt werden, wie im Manuskript beschrieben.Bewegen Sie drei Mikrometer Transwell-Einsätze vorsichtig von den mittleren Reihen einer 24-Well-Platte in die obere und untere Reihe der gleichen 24-Well-Platte mit einer Pipette-Spitze und Handhand. Fügen Sie 500 Mikroliter Migrationsmedien mit CCL17 zu 1/3 der Brunnen in der mittleren Reihe der 24-Well-Platte hinzu. Fügen Sie 500 Mikroliter Migrationsmedien mit CCL22 zu einem weiteren 1/3 der Brunnen hinzu.Und schließlich fügen Sie 500 Mikroliter serumfreies RPMI, das kein Chemokin enthält, zu den letzten 1/3 der Brunnen hinzu. Beschriften Sie den Deckel auf der Platte deutlich mit dem Namen der entsprechenden Transmigrationsmedien, die in den unteren Brunnen platziert sind. Dann legen Sie die Transwell-Einsätze wieder in die Brunnen mit den verschiedenen Behandlungen.Fügen Sie vorsichtig 100 Mikroliter CD4 T-Zellen oder ILC2 an den oberen Brunnen jedes Einsatzes, um sicherzustellen, dass die Zellsuspension in den Transwells nicht gemischt oder pipette. Beschriften Sie den Deckel auf der Platte klar mit dem Zelltyp, der in jedem Brunnen platziert ist, und schreiben Sie das Datum und die Uhrzeit, zu der die Zellen hinzugefügt wurden. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Transwell-Einsätze von der Platte entfernen, bis alle Zellen in Transwell-Einsätzen mit Medien platziert wurden.Sobald die von Interesse wichtigen Zellen isoliert sind, sind die wichtigsten Schritte, die Chemokine und Zelltypen, die in bestimmten Brunnen platziert werden, zu verfolgen, sanft Zellen zu den oberen Kammern hinzuzufügen und schließlich unnötigen Kontakt mit der Transmigrationsplatte während der 48-stündigen Inkubation zu vermeiden. Legen Sie die Platte vorsichtig in einen 37-Grad-Celsius-Inkubator mit 5% Kohlendioxid und inkubieren Sie 48 Stunden lang, um den Kontakt mit der Platte während der Inkubationszeit zu minimieren. Nachdem Sie die Platte vorsichtig aus dem Inkubator entfernt haben, entfernen Sie alle Transwell-Einsätze aus den mittleren Reihen in die leeren Brunnen direkt darüber oder unten.Sammeln Sie die Zellen aus den oberen und unteren Brunnen der Transwell-Einsätze in Röhren, die mit CCL17, CCL22 oder Medium beschriftet sind, mit dem Zelltyp und mit der Replikationsnummer. Spülen Sie die unteren Brunnen mit 500 Mikroliter 1x PBS, sammeln Sie sie in die entsprechenden Schläuche und tun Sie das gleiche für die oberen Brunnen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 378-facher g bei Raumtemperatur für fünf Minuten.Verwenden Sie eine Pipette, um den gesamten Überstand vorsichtig zu entfernen, und setzen Sie dann T-Zelle und ILC2-Pellets mit 50 Mikroliter1x PBS wieder auf. Nach dem Entfernen von 10 Mikroliter der Zellsuspension, fügen Sie 90 Mikroliter von 0,4%Trypan blau. Zählen Sie die Zellen auf dem automatisierten Zellenzähler.Und für jede Probe, erfassen Prozentsatz der Lebensfähigkeit und Zellzahl pro Milliliter, und bestimmen Sie die Gesamtzahl der Zellen pro Behandlung in der oberen und unteren Kammer. Als die CCR4-Expression sowohl an CD4-positiven T-Zellen als auch an ILC2 durch Durchflusszytometrie bewertet wurde, gab es keine Unterschiede zwischen männlichen und weiblichen Wirten. Die Expression von CCR4 auf Zellbasis auf ILC2 war jedoch höher als bei CD4-positiven T-Zellen.Wenn die untere Kammer des Transwell-Geräts mit unbehandelten Zellkulturmedien, Medien, die CCL22 enthalten, oder Medien, die CCL17 enthalten, gefüllt war, migrierten weniger als 14 % der Zellen unter Medienkontrollbedingungen. Als Reaktion auf CCL22 reagierten beide Zelltypen, unabhängig davon, ob sie von männlichen oder weiblichen Hosts stammten, auf CCL22. Außerdem induzierte CCL22 eine größere Migration als CCL17 bei männlichen ILC2.Auf der anderen Seite induzierte CCL17 eine signifikante Migration der weiblichen CD4-T-Zellen und ILC2 im Vergleich zu Medien allein. Die CCL17-Behandlung war nicht anders als die Medien für männliche CD4-positive T-Zellen oder männliche ILC2. Unter suboptimalen Bedingungen, wenn die Platte mit CD4-Zellen die ersten 24 Stunden bei Raumtemperatur blieb und dann in den Inkubator verschoben wurde, gab es keine Migration in Richtung CCL22 und CCL17.Darüber hinaus war die Lebensfähigkeit der Zellen für die Zellen in der unteren Kammer besonders gering, was zeigt, wie wichtig es ist, die in diesem Protokoll beschriebenen richtigen Temperaturen und Bedingungen zu verwenden, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Sobald das Transmigrationsverfahren abgeschlossen ist, sollte man eine signifikante Migration in das Chemokin von Interesse im Vergleich zu den Medienkontrollbrunnen sehen. Wenn keine signifikante Migration beobachtet wird, kann man davon ausgehen, dass das Verfahren nicht richtig funktioniert hat oder dass die Lymphozyten nicht auf das betreffende Chemokin reagieren.Diese Technik kann allgemein verwendet werden, um Lymphozytenmigration zu verstehen, wenn diese Lymphozyten eine breite Palette von In-vivo-Behandlungen durchlaufen haben.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Menschliche T-Lymphozyten-Isolierung, Kultur und Analyse der Migration In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Quantitative Bewertung der humanen neutrophilen Migration Über eine Zucht Blasenepithel

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Co-Kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell eines Oligodendrozyten-gerichtete T-Cell Attack in akuten Hirnschnitten

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Zellkultur

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Isolation and Ex Vivo Culture of VÃƒÅ½Ã‚Â´1+CD4+ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells, an Extrathymic ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â²T-cell Progenitor

Isolation und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur des Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T-Zellen, eine extrathymic αβT-Zell-Vorläufer

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Durchflusszytometrische Analyse von partikelgebundenen Bet v 1 Allergens in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Kennzeichnung von<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antikörper-Rezeptor-Targeting für<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellhandel von PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...