Name: assessment of lymphocyte migration in an ex vivo transmigration system
Uploaded: 2019-09-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System at JoVE.com

이 작품은 미국 폐 협회 (K.J.W.), T.A.W.와 K.J.W.에 수여 된 기념 유진 케니 기금, K.J.W.에 대한 유타 대학의 관대 한 창업 지원, T.A.W.에 재향 군인 업무 상 (VA I01BX003335)에 의해 지원되었다. T.A.W.는 재향 군인 국무부에서 연구 경력 과학자 상 (IK6 BX003781)의 수상자입니다. 저자는 리사 추도멜카 씨의 편집 지원을 인정하고 자합니다. 저자는 이 원고에 대해 생성된 유세포분석 데이터를 수집하는 데 도움을 준 UNMC 흐름 세포분석 코어에 감사를 표합니다.

여기에 설명된 모든 방법은 네브래스카 대학 의료 센터(UNMC)와 유타 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 시약의 설치 및 준비
<ol><li>
완전한 RPMI를 준비 (로스웰 공원 기념 연구소) 미디어.
	<ol>
<li>RPMI 의 90 mL에 열 불활성화 태아 소 혈청 (FBS)의 10 mL를 추가합니다.</li>
		<li>100x 페니실린-스트렙토마이신-글루타민 1mL를 100 mL?...

<ol>
	<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Moser, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+History+of+Chemoattractant+Research.">Editorial: History of Chemoattractant Research.</a> Frontiers in Immunology. 6, 548 (2015).</li><li>Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+sound+the+alarmin:+The+role+of+atypical+chemokine+in+inflammation+and+cancer.">Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer.</a> Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).</li><li>Charo, I. F., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+roles+of+chemokines+and+chemokine+receptors+in+inflammation.">The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation.</a> The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).</li><li>Abboud, D., Hanson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+neutralization+as+an+innovative+therapeutic+strategy+for+atopic+dermatitis.">Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis.</a> Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).</li><li>Aldinucci, D., Casagrande, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+CCL5/CCR5+Axis+against+the+Progression+of+Gastric+Cancer.">Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477 (2018).</li><li>Chonco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+DNA+Aptamers+Against+CCL21+Protein:+Characterization+and+Biomedical+Applications+for+Targeted+Drug+Delivery+to+T+Cell-Rich+Zones.">Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones.</a> Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).</li><li>Trivedi, P. J., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+Chemokine+Receptors+as+Therapeutic+Targets+in+Inflammatory+Bowel+Disease;+Pitfalls+and+Promise.">Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise.</a> Journal of Crohn's and Colitis. 12 (12), 1508 (2018).</li><li>Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+of+chemotaxis+as+a+window+into+mechanisms+of+toxicant-induced+immunomodulation.">In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation.</a> Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).</li><li>Davis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+studying+the+immune+system+leads+us+to+new+medicines.">How studying the immune system leads us to new medicines.</a> Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).</li><li>Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+chemokine+expression+following+respiratory+virus+infection+reflects+Th1-+or+Th2-biased+immunopathology.">Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology.</a> Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).</li><li>Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminins+affect+T+cell+trafficking+and+allograft+fate.">Laminins affect T cell trafficking and allograft fate.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).</li><li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th2+cell+differentiation+from+naive+CD4(+)+T+cells+is+enhanced+by+autocrine+CC+chemokines+in+atopic+diseases.">Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases.</a> Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).</li><li>Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+differences+in+activation+of+lung-related+type-2+innate+lymphoid+cells+in+experimental+asthma.">Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma.</a> Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).</li><li>Warren, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovalbumin-sensitized+mice+have+altered+airway+inflammation+to+agriculture+organic+dust.">Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust.</a> Respiratory Research. 20 (1), 51 (2019).</li><li>Poole, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphabeta+T+cells+and+a+mixed+Th1/Th17+response+are+important+in+organic+dust-induced+airway+disease.">alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease.</a> Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).</li><li>Matsuo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CCR4+antagonist+ameliorates+atopic+dermatitis-like+skin+lesions+induced+by+dibutyl+phthalate+and+a+hydrogel+patch+containing+ovalbumin.">A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin.</a> Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).</li><li>Mikhak, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+CCR4+and+CCR8+to+antigen-specific+T(H)2+cell+trafficking+in+allergic+pulmonary+inflammation.">Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).</li><li>Monticelli, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells+promote+lung-tissue+homeostasis+after+infection+with+influenza+virus.">Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus.</a> Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).</li><li>Saenz, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL25+elicits+a+multipotent+progenitor+cell+population+that+promotes+T(H)2+cytokine+responses.">IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses.</a> Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).</li><li>Hoyler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+GATA-3+controls+cell+fate+and+maintenance+of+type+2+innate+lymphoid+cells.">The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells.</a> Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).</li><li>Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+cytokine+receptor+gamma+chain+plays+an+essential+role+in+regulating+lymphoid+homeostasis.">The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).</li><li>Warren, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSV-specific+anti-viral+immunity+is+disrupted+by+chronic+ethanol+consumption.">RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption.</a> Alcohol. , (2016).</li><li>Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+association+between+MMP-9+and+impaired+T+cell+migration+in+ethanol-fed+BALB/c+mice+infected+with+Respiratory+Syncytial+Virus-2A.">An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A.</a> Alcohol. , (2018).</li><li>Molteni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+device+to+concurrently+assess+leukocyte+extravasation+and+interstitial+migration+within+a+defined+3D+environment.">A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment.</a> Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).</li><li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+in+vitro+3D+co-culture+model+to+engineer+vascularized+bone-mimicking+tissues+combining+computational+tools+and+statistical+experimental+approach.">Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach.</a> Biomaterials. 76, 157-172 (2016).</li><li>Jeon, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+3D+vascularized+organotypic+microfluidic+assays+to+study+breast+cancer+cell+extravasation.">Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).</li></ol>

본 명세서에서, 우리는 생체 내 트랜스이민 시스템에서 림프구의 케모카인 유도 이동을 평가하기 위한 잘 확립된 방법을 제시한다. 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있으며, 그 중 첫 번째는 실험에서 면역 세포에 대한 올바른 케모카인 수용체의 발현을 확인하는 것입니다. 우리의 손에, 우리는 알레르기성 염증에 있는 Th2 도우미 T 세포에 CCR4의 중요성을 강조하는 문헌의 바디 때문에 CCR4를 ?...

이 원래 이주 방법은 실험 의학의 전표에서1962년에 스티븐 보이든에 의해 제출되었습니다1. 우리가 화학 요법과 화학 요법에 대해 알고있는 많은 것은 Boyden 챔버의 개발없이 가능하지 않을 것입니다. 1977년에 첫번째 chemokine의 발견이전에, ex vivo transmigration 시스템은 호중구에 있는 세포 운동성을 증폭하는 동안 대식세포에 있는 세포 운동을 체포할 수 있던 혈청 요인에 관하여 배우기 위하여 이용되었습니다1,2. 면역 세포 이동에 관한 지식의 엄청난 재산이 개발되었습니다, 현재까지, 47 케모카인은 지금 발견되었습니다 19 해당 수용체3,4. 또한, 이러한 케모카인 경로의 억제제 / 강화제의 무리는 치료 목적을 위한 개발을 겪고있다5,6,7,8. 그 화합물의 많은 주어진된 chemokine에 화합물과 면역 세포 응답 성 간의 직접적인 상호 작용을 이해 하기 위해 유사한 마이그레이션 챔버에서 테스트 되었습니다9.
이민, 또는 diapedesis, 염증된 조직으로 명확한 감염에 건강한 선동적인 반응에 필수적인 과정10,11. 보이든 챔버, 트랜스이민 시스템, 또는 트랜스웰 장치는 일반적으로 다공성 멤브레인1,12에의해 분리된 2개의 챔버로 구성된다. 바닥 챔버는 가장 자주 관심의 케모카인을 포함하는 미디어를 보유하고, 백혈구는 상단 챔버에 배치되는 동안. 막 내의 기공의 크기는 관심 있는 세포의 크기에 기초하여 선택될 수 있다. 이 프로젝트의 경우, 우리는 림프세포의 크기가 7-20 μm이기 때문에 세포 발달 단계에 따라 3 μm 다공성 멤브레인을 선택했습니다. 이 기공 크기는 이 세포가 수동적으로 모공을 통해 떨어지는 것이 아니라 케모카인 구배에 반응하여 적극적으로 이동한다는 것을 보장합니다.
이 프로토콜의 주요 장점은 비용 효율성입니다. 생체 내 이주는 동물 취급 및 수술에 있는 광대한 훈련을 요구하기 때문에 어렵고, 수시로 연구원에게 항상 유효하지 않는 고성능 현미경 검사법을 관련시킵니다. 이주를 강화하거나 억제하기 위해 생각되는 화합물의 비용 효과적인 스크리닝은 생체 내 이미징에 앞서 달성될 수 있다. 트랜스이민 시스템은 엄격하게 조절되기 때문에, 세포는 트랜스웰 장치에 처음에 첨가된 후 처리될 수 있거나, 또는 그 반대의 경우도 마찬가지이며, 케모카인은 트랜스웰 장치에 첨가된 세포후 케모카인 억제제로 먼저 치료될 수 있다. 마지막으로, 내피 세포 및/또는 지하 막 단백질은 트랜스웰 삽입의 바닥에 첨가될 수 있다 1-2 화학학에서 이러한 장벽 세포의 참여를 이해하기 위해 이주 실험 1-2일 전에. 다시, 시스템의 이러한 조작은 생체 내 연구에서 보다 복잡한 연구에 앞서 주어진 화합물의 효과에 대한 중요한 정보를 결정하는 강력한 수단을 제공한다.
이주 챔버 시스템을 활용하는 것은 생체 내 및 체외 조건 하에서 다양한 림프구 이동성을 평가하는 효과적인방법(12,13,14)이다. 본 명세서에서, 우리는 트랜스이민 챔버에서 케모카인에 대한 생체 림프구 반응성을 평가하기 위한 최적화된 방법을 설명한다. 본 실시예 실험에서,CD4+ T 세포 및 그룹 2 선천성 림프성 세포(ILC2)는 OVA 알러지 유발 물질 노출 다음의 남성 및 여성, BALB/c 마우스로부터 분리되었다. 알레르겐 도전 마우스로부터 CCR4+ CD45+ 리니지-(LIN-) ILC2가 CCR4+ CD4+ T 도우미 세포보다 CCL17 및 CCL22로 보다 효율적으로 마이그레이션될 것이라는 가설이 생성되었다. CCL17 및 CCL22는 일반적으로 M2 (알레르기성) 표현형의 수지상 세포 및 대식세포에 의해 생성되는 케모카인이며, 다른 세포들 중에서, 알레르기15,16. CCL17 및 CCL22는 기도 악화 시 폐에서 쉽게 검출되기 때문에 알레르기 성 염증의 바이오마커로 생각될 수 있다16,17,18. 중요한 것은, CCR4 발현은 집 먼지 마이트 처리 동물로부터 분리된 ILC2로부터 생성된 생물정보학 데이터에서 밝혀진 바와 같이, 처리되지 않은 대조군과 비교하여 상승되고, 유사하게 ILC2는 IL-33으로 생체내 처리된 순진한 동물로부터 알레르겐 촉진 선천적 사이토카인) upregulates CCR419,20. 더욱이, 면역학적 게놈 프로젝트 데이터베이스(www.immgen.org)에서 ILC2에 대한 데이터에 따르면, CCR4 mRNA는 이들 선천적인 면역 세포에서 고도로 발현된다. 현재까지, 조직으로 ILC2의 인신 매매에 관하여 거의 알려져 있지 않습니다, 그러나 ILC2와 CD4+ T 세포는 유사한 전사 인자 및 수용체를 표현하기 때문에 화학요법과 화학요법을 위한 유사한 케모카인 및 수용체를 이용하기 위하여 확률이 높습니다. 따라서, 우리는 CCL17 대 CCL22 응답성, ILC2 및 CD4+ T 림프구, 남성과 여성 모두에서, OVA 도전 동물을 비교했다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15250061</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>329424</td>
			<td>U-100 Syringes Micro-Fine 28G 1/2&#34; 1cc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td>Dilute to 1x in RPMI media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td>polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 um transwell inserts</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-288</td>
			<td>24-well plate containing 12 transwell inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3x stabilizing fixative</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>338036</td>
			<td>Prepare 1x solution according to manufacturers protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene tubes</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>38007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-106</td>
			<td>polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-chamber easy separation magnet</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>18103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>A1049201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced cell strainer, 40 um</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-375</td>
			<td>nylon mesh, 40 micron strainers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Hydroxide, Reagent Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239186-25G</td>
			<td>20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- mouse CCR4; APC-conjugated</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>131211</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>557396</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11c; PE eFluor 610</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>61-0114-82</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD16/32, Fc block</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553141</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>47-0193-82</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>552774</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD45; PE conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>56087</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse ICOS (CD278)</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>564070</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553164</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>145311</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1450102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Dissociator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td>0.5% in serum-free RPMI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter Clides</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1450015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Egg Ovalbumin, Grade V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5503-10G</td>
			<td>500 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1, Filtered</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216)</td>
			<td>25 U/mL in RPMI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compensation beads</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>01-1111-41</td>
			<td>1 drop per contol tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation Tubes</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-335</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>554657</td>
			<td>1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated-FBS</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-525H</td>
			<td>10% in complete RPMI &#38; ILC2 Expansion Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CCL17</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02954-20</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CCL22</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02856-20</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CD4+ T cell enrichment kit</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>19852</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse IL-2</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02764-20</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse ILC2 enrichment kit</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>19842</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse recombinant IL-33</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>78044</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>22400071</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation Buffer</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>20144</td>
			<td>1 X PBS + 2% FBS; stored at 4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small animal nebulizer and chamber</td>
			<td>Data Sciences International</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7124; NDC 0338-0048-04</td>
			<td>0.9% Sodium Chloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of lymphocyte migration in an ex vivo transmigration system

본 명세서에서, 우리는 생체 내 트랜스이민 시스템에서 림프구 케모카네틱 운동을 평가하기 위한 기본적인 실험실 기술 및 물질로 실행될 수 있는 효율적인 방법을 제시한다. 그룹 2 선천림프세포(ILC2) 및CD4+ T 도우미 세포를 닭계란 ovalbumin(OVA)-도전BALB/c 마우스의 비장 및 폐로부터 분리하였다. 우리는CD4+ T 세포 및 ILC2 둘 다에서 CCR4의 발현을 비교적 확인하였다. CCL17 및 CCL22는 CCR4에 대해 공지된 리간드; 따라서, 이러한 생체 내 이주 방법을 사용하여CCL17-및 CCR22-유도 된 CCR4+ 림프구의 이동을 조사하였다. 케모카인 그라데이션을 확립하기 위해 CCL17 및 CCL22를 마이그레이션 시스템의 하단 챔버에 배치했습니다. 분리된 림프구는 상부 챔버에 첨가하고 48h 기간 동안 림프구가 3 μm 기공을 통해 활발하게 이동하여 하단 챔버의 케모카인을 향하게 했다. 이것은 림프구의 화학 요법을 결정하기위한 효과적인 시스템이지만, 당연히 생체 내 장기 미세 환경에서 발견되는 복잡성을 모방하지는 않습니다. 이것은 연구 하에 기관 및 림프구의 실화 화상 진찰에 추가함으로써 극복 될 수있는 방법의 한 가지 한계이다. 대조적으로, 이 방법의 장점은 엔트리 레벨 기술자가 라이브 이미징보다 훨씬 더 비용 효율적인 속도로 수행 될 수 있다는 것입니다. 종양이 세포독성 면역 세포에 침투하는 경우와 같이 치료 화합물이 이동을 향상시키거나 이동을 억제할 수 있게 됨에 따라, 아마도 면역병리학이 우려되는 자가면역 질환의 경우, 이 방법은 스크리닝 도구. 일반적으로, 이 방법은 관심 있는 케모카인이 미디어 제어보다 통계적으로 더 높은 수준에서 화학을 일관되게 생성하는 경우에 효과적이다. 이러한 경우에, 주어진된 화합물에 의해 억제/향상의 정도 또한 결정 될 수 있다.

CD4+ T 세포 및 ILC2에 대한 CCR4 발현.
생체 내 이민 실험의 성공을 위해, 림프구가 CCR4를 통해 CCL17 및 CCL22에 반응하는지 여부를 결정하는 것이 필수적이다; 따라서, 우리는 유세포측정에 의한CD4+ T 세포 및 ILC2 둘 다에 CCR4 발현을 결정하였다. OVA 특이적CD4+ 도우미 T 세포가 CCR4를 발현하는 것은 잘 알려져 있지만, 덜 ILC2상에서 CCR4의 발현이 알려져 있다...

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Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

이 프로토콜에서 림프구는 다공성 멤브레인에 의해 하단 챔버로부터 분리 된 트랜스 이민 시스템의 상부 챔버에 배치됩니다. 케모카인은 하단 챔버에 첨가되어 케모카인 그라데이션을 따라 활발한 이동을 유도합니다. 48 시간 후, 림프구는 트랜스 이민을 정량화하기 위해 두 챔버에서 계산됩니다.

Ex Vivo 트랜스이민 시스템에서 림프구 마이그레이션 평가

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

림프구 환전은 면역 반응의 중요한 특징입니다. 따라서, 이 프로토콜은 연구원이 잘 정의된 체외 시스템에서 림프구의 이동성을 평가할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 케모키네가 군 2선 림프구 세포 또는 ILC2와 같은 최근 정의된 세포에서 이주를 유도하는 효과를 결정하기 위해 평가될 수 있다는 것이다.두 번째 장점은 특정 케모키네 경로를 차단하는 것을 목표로 억제제 또는 생물학적 치료가 동물과 더 비싼 실험을하기 전에이 방법에 의해 테스트 될 수 있다는 것입니다. 그룹당 2~3마리의 동물을 사용하여 안락사 된 ova 처리 된 남성과 여성 마우스에서 폐와 비장을 절제하는 것으로 시작합니다. 조직 유형 및 동물 성별에 따라 별도의 해리 튜브에 절제된 조직을 배치합니다.폐 조직을 500 마이크로리터의 폐 해리 튜브에 해리 튜브를 배치하고, 튜브를 자동화 된 조직 해리에 배치하고 폐 프로토콜을 사용하여 해리시화한다. 총 두 번 이 단계를 반복합니다. 비장을 소독하려면, 소각에 완전한 RPMI 미디어의 500 마이크로 리터에 배치 한 다음 비장 프로토콜을 사용합니다.지금부터 멸균 기술을 사용하여 생물학적 안전 캐비닛에서 작업하고, 40 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 각 해리 된 조직을 필터링하고 50 밀리리터 원판 튜브로 수집합니다. 폐 균질화관을 함유한 해리튜브를 추가 폐 소화 매체의 5밀리리터로 헹구고, 비장을 함유한 튜브는 완전한 RPMI의 5밀리리터로 균질화하고, 해당 조직에 사용되는 필터를 통해 내용을 필터링한다. 폐 조직을 더 해리하기 위해 폐균질을 37도 의 이산화탄소로 37도 의 섭씨 인큐베이터에서 15~30분 동안 배양합니다.그런 다음 폐와 비장 균질화 및 원심분리기 모두에 완전한 RPMI의 5 밀리리터를 추가합니다. 상체를 폐기한 후, 같은 성별의 동물 군으로부터 비장세포와 폐세포를 함유한 펠릿을 단일 50밀리리터 원내 튜브로 결합한다. 각 튜브에 10밀리리터의 완전한 RPMI를 추가하고 다시 중단합니다.자동화된 셀 카운터를 사용하여 총 셀 수를 결정합니다. 분리 버퍼에서 밀리리터 당 1억 개의 세포로 수컷 및 암컷 세포 현탁액을 조정한 다음 5밀리리터 폴리스티렌 튜브에 추가합니다. 원고에 설명된 바와 같이 총 세포의 2/3에서 2개의 선천성 림프구 세포를 격리한 후, CD4 양성 T 세포 격리 절차에 대한 나머지 세포를 사용한다.CD4 양성 T 세포 격리를 시작하려면 CD4 T 세포 농축 현탁액에 쥐 혈청을 추가합니다. 그런 다음 세포 샘플에 격리 칵테일을 추가하고 실온에서 10 분 동안 배양하십시오. 30초 동안 소용돌이가 급속한 구체를 만들고, 셀 샘플에 추가하여 밀리리터당 75마이크로리터의 희석을 달성한다.부드럽게 혼합하고 실온에서 2 1/2 분 동안 배양하십시오. 최대 3밀리리터의 분리 버퍼약 2밀리리터로 시료를 얹고, 5밀리리터 튜브를 8챔버 간편 분리 자석에 넣고 실온에서 5분간 배양합니다. 그런 다음 자석을 앞으로 팁, 깨끗한 5 밀리 리터 튜브에 각 셀 서스펜션을 파이펫.각 튜브와 원심분리기에 1.5 밀리리터의 세럼 프리 RPMI를 추가합니다. 상체를 부어, 혈청없는 RPMI에서 밀리리터 당 1천만 세포에서 CD4 양성 T 세포 펠릿을 다시 중단. 프로토콜의 이 부분을 시작하려면 원고에 설명된 ILC2 및 CD4 양성 T 세포 모두에 대한 실험에 필요한 Transwell 삽입수를 결정합니다.파이펫 팁과 장갑을 낀 손으로 동일한 24웰 플레이트의 상단및 하단 행으로 24웰 플레이트의 중간 줄에서 3미크로닌 트랜스웰 인서트를 부드럽게 이동합니다. CCL17과 함께 500 마이크로리터의 마이그레이션 미디어를 24웰 플레이트의 중간 줄에 우물의 1/3로 추가합니다. CCL22를 사용하여 500마이크로리터의 마이그레이션 미디어를 우물의 또 다른 1/3에 추가합니다.그리고 마지막으로, 우물의 마지막 1/3에 화학모키네를 함유하지 않은 세럼이 없는 RPMI 500마이크로리터를 추가합니다. 하단 웰에 배치된 적절한 마이그레이션 미디어의 이름으로 플레이트의 뚜껑을 명확하게 레이블을 지정합니다. 그런 다음 트랜스웰 인서트를 다양한 치료법을 포함하는 우물에 다시 배치합니다.CD4 T 셀 또는 ILC2 의 100 마이크로리터를 각 인서트의 상단 우물에 부드럽게 추가하여 트랜스웰에서 셀 서스펜션을 위아래로 혼합하거나 파이펫하지 않도록 합니다. 각 웰에 배치된 셀 타입으로 플레이트의 뚜껑을 명확하게 표시하고 세포가 첨가된 날짜와 시간을 적어 둡니다. 모든 세포가 매체를 가진 Transwell 인서트에 배치될 때까지 플레이트에서 Transwell 삽입을 제거하는 것부터 시작하는 이 과정을 반복합니다.관심있는 세포가 고립되면, 가장 중요한 단계는 특히 우물에 배치 된 케모키네 및 세포 유형을 추적하고, 상단 챔버에 세포를 부드럽게 추가하고, 마지막으로 48 시간 배양 동안 환원 플레이트와의 불필요한 접촉을 피하는 것입니다. 플레이트를 37도 의 섭씨 인큐베이터에 5%의 이산화탄소를 부드럽게 배치하고 48시간 동안 배양하여 인큐베이션 기간 동안 플레이트와의 접촉을 최소화하십시오. 인큐베이터에서 플레이트를 부드럽게 제거한 후 중간 행에서 모든 Transwell 삽입을 바로 위 또는 아래 빈 우물로 제거합니다.CCL17, CCL22 또는 미디어, 셀 유형 및 복제 번호로 표시된 튜브에 Transwell 삽입물의 위쪽 및 하단 우물에서 세포를 수집합니다. 1x PBS의 500 마이크로리터로 하단 우물을 헹구고 해당 튜브로 수집하고 상단 우물에서도 동일한 작업을 수행합니다. 5 분 동안 실온에서 378 배 g에서 튜브를 원심 분리합니다.파이펫을 사용하여 모든 수퍼나티를 부드럽게 제거한 다음 T 셀 및 ILC2 펠릿을 1x PBS 50 마이크로리터로 재축합니다. 세포 현탁액의 마이크로리터 10을 제거한 후 90마이크로리터를 0.4%의 트라이팬 블루로 추가합니다. 자동화된 셀 카운터의 셀을 계산합니다.그리고 각 샘플에 대해 밀리리터당 생존력과 세포 수의 백분율을 기록하고, 상부 및 하단 챔버에서 치료당 총 세포 수를 결정한다. CCR4 발현이 유동 세포측정에 의해 CD4 양성 T 세포와 ILC2 모두에서 평가되었을 때, 남성과 여성 호스트 사이에는 차이가 없었습니다. 그러나, ILC2에 대한 세포별 기준으로 CCR4의 발현은 CD4 양성 T 세포에 비해 높았다.트랜스웰 장치의 바닥 챔버가 처리되지 않은 세포 배양 매체, CCL22 를 포함하는 배지 또는 CCL17을 포함하는 매체로 채워졌을 때, 세포의 14% 미만이 미디어 제어 조건에서 마이그레이션되었다. CCL22에 응하여, 둘 다 세포 모형은, 남성 또는 여성 호스트에게서 왔는지에 관계없이, CCL22에 반응했습니다. 또한, CCL22는 남성 ILC2에서 CCL17보다 더 큰 이주를 유도했다.한편, CCL17은 미디어에 비해 여성 CD4 T 세포 및 ILC2의 상당한 이주를 유도하였다. CCL17 치료는 남성 CD4 양성 T 세포 또는 남성 ILC2에 대한 미디어와 다르지 않았다. 최적이 아닌 조건에서, CD4 셀을 가진 플레이트가 처음 24 시간 동안 실온에 남아 인큐베이터로 이동했을 때 CCL22 및 CCL17로의 이주가 없었습니다.더욱이, 세포의 생존가능성은 바닥 챔버내의 세포에 대해 특히 낮았으며, 최적의 결과를 달성하기 위해 이 프로토콜에 기재된 올바른 온도 및 조건을 사용하는 것의 중요성을 나타냈다. 마이그레이션 절차가 완료되면 미디어 제어 우물과 비교하여 관심 있는 케모키네로상당한 마이그레이션이 표시됩니다. 중요한 마이그레이션이 보이지 않는 경우 절차가 제대로 작동하지 않거나 림프구가 문제의 chemokine에 반응하지 않는다고 가정 할 수 있습니다.이 기술은 그 림프구가 생체 내 처리의 넓은 범위를 겪었을 때 림프구 이동을 이해하기 위하여 광범위하게 이용될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

연구

면역학 및 감염병학

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

교양 방광 상피 세포 간 인간 호중구 이주의 정량 평가

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가<sup&gt; +</sup&gt;를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 공동 문화 시스템.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

<em&gt; 생체 내</em&gt; 급성 뇌 조각의 희소 돌기 아교 세포 지시 T 세포 공격의 모델

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 세포 배양

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Isolation and Ex Vivo Culture of VÃƒÅ½Ã‚Â´1+CD4+ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells, an Extrathymic ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â²T-cell Progenitor

분리 및<em&gt; 전의 VIVO</emVδ1의&gt; 문화<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T 세포, Extrathymic αβT 세포 선조

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

PM10의 입자 바인딩 베팅 1 절 알레르기의 유세포 분석

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

에 의해 쥐 림프구 라벨링<sup&gt; (64)</sup&gt; CU-항체 수용체는 대한 타겟팅<em&gt; 생체</em&gt; PET / CT에 의한 세포 트래 피킹

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...