Name: assessment of lymphocyte migration in an ex vivo transmigration system
Uploaded: 2019-09-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av American Lung Association (K.J.W.), Memorial Eugene Kenney fondet tildelt T.A.W. og K.J.W., sjenerøs oppstart støtte fra University of Utah for K.J.W., og en Department of Veterans Affairs prisen til T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. er mottaker av en forskerkarriere forsker Award (IK6 BX003781) fra Department of Veterans Affairs. Forfatterne ønsker å anerkjenne redaksjonell bistand fra MS Lisa Chudomelka. Forfatterne takker UNMC Flow flowcytometri kjerne for deres støtte i å samle inn flyten flowcytometri data generert for dette manuskriptet.

Alle metoder beskrevet her ble gjennomgått og godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteer ved University of Nebraska Medical Center (UNMC) og University of Utah.
1. oppsett og tilberedning av reagenser
<ol><li>
Forbered komplett RPMI (Roswell Park Memorial Institute) Media.
	<ol>
<li>Tilsett 10 mL varme-deaktivert fosterets storfe serum (FBS) til 90 mL RPMI.</li>
		<li>Tilsett 1 mL 100 prosent penicillin-Streptomycin-glutamin til 100 mL på 10% FBS RPMI.</li>
	...

<ol>
	<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Moser, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+History+of+Chemoattractant+Research.">Editorial: History of Chemoattractant Research.</a> Frontiers in Immunology. 6, 548 (2015).</li><li>Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+sound+the+alarmin:+The+role+of+atypical+chemokine+in+inflammation+and+cancer.">Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer.</a> Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).</li><li>Charo, I. F., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+roles+of+chemokines+and+chemokine+receptors+in+inflammation.">The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation.</a> The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).</li><li>Abboud, D., Hanson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+neutralization+as+an+innovative+therapeutic+strategy+for+atopic+dermatitis.">Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis.</a> Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).</li><li>Aldinucci, D., Casagrande, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+CCL5/CCR5+Axis+against+the+Progression+of+Gastric+Cancer.">Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477 (2018).</li><li>Chonco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+DNA+Aptamers+Against+CCL21+Protein:+Characterization+and+Biomedical+Applications+for+Targeted+Drug+Delivery+to+T+Cell-Rich+Zones.">Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones.</a> Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).</li><li>Trivedi, P. J., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+Chemokine+Receptors+as+Therapeutic+Targets+in+Inflammatory+Bowel+Disease;+Pitfalls+and+Promise.">Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise.</a> Journal of Crohn's and Colitis. 12 (12), 1508 (2018).</li><li>Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+of+chemotaxis+as+a+window+into+mechanisms+of+toxicant-induced+immunomodulation.">In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation.</a> Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).</li><li>Davis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+studying+the+immune+system+leads+us+to+new+medicines.">How studying the immune system leads us to new medicines.</a> Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).</li><li>Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+chemokine+expression+following+respiratory+virus+infection+reflects+Th1-+or+Th2-biased+immunopathology.">Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology.</a> Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).</li><li>Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+chemokines+CCL2+and+CXCL10+by+matrix+metalloproteinases-2+and+-9:+implications+for+chemotaxis.">Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis.</a> Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).</li><li>Burrell, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+Node+Stromal+Fiber+ER-TR7+Modulates+CD4++T+Cell+Lymph+Node+Trafficking+and+Transplant+Tolerance.">Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance.</a> Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).</li><li>Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminins+affect+T+cell+trafficking+and+allograft+fate.">Laminins affect T cell trafficking and allograft fate.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).</li><li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th2+cell+differentiation+from+naive+CD4(+)+T+cells+is+enhanced+by+autocrine+CC+chemokines+in+atopic+diseases.">Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases.</a> Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).</li><li>Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Arrestin-2-Dependent+Signaling+Promotes+CCR4-mediated+Chemotaxis+of+Murine+T-Helper+Type+2+Cells.">beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+antagonist+for+CCR4+attenuates+allergic+lung+inflammation+in+a+mouse+model+of+asthma.">A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma.</a> Science Reports. 7 (1), 15038 (2017).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+helper+CD4+T+cells+during+acute+and+stable+allergic+asthma.">Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma.</a> Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).</li><li>Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Group+2+Innate+Lymphoid+Cells+in+Allergic+Airway+Inflammation+Models+in+the+Mouse.">Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse.</a> Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).</li><li>Li, B. W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group+2+Innate+Lymphoid+Cells+Exhibit+a+Dynamic+Phenotype+in+Allergic+Airway+Inflammation.">Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1684 (2017).</li><li>Warren, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+differences+in+activation+of+lung-related+type-2+innate+lymphoid+cells+in+experimental+asthma.">Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma.</a> Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).</li><li>Warren, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovalbumin-sensitized+mice+have+altered+airway+inflammation+to+agriculture+organic+dust.">Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust.</a> Respiratory Research. 20 (1), 51 (2019).</li><li>Poole, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphabeta+T+cells+and+a+mixed+Th1/Th17+response+are+important+in+organic+dust-induced+airway+disease.">alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease.</a> Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).</li><li>Matsuo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CCR4+antagonist+ameliorates+atopic+dermatitis-like+skin+lesions+induced+by+dibutyl+phthalate+and+a+hydrogel+patch+containing+ovalbumin.">A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin.</a> Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).</li><li>Mikhak, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+CCR4+and+CCR8+to+antigen-specific+T(H)2+cell+trafficking+in+allergic+pulmonary+inflammation.">Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).</li><li>Monticelli, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells+promote+lung-tissue+homeostasis+after+infection+with+influenza+virus.">Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus.</a> Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).</li><li>Saenz, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL25+elicits+a+multipotent+progenitor+cell+population+that+promotes+T(H)2+cytokine+responses.">IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses.</a> Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).</li><li>Hoyler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+GATA-3+controls+cell+fate+and+maintenance+of+type+2+innate+lymphoid+cells.">The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells.</a> Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).</li><li>Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+cytokine+receptor+gamma+chain+plays+an+essential+role+in+regulating+lymphoid+homeostasis.">The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).</li><li>Warren, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSV-specific+anti-viral+immunity+is+disrupted+by+chronic+ethanol+consumption.">RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption.</a> Alcohol. , (2016).</li><li>Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+association+between+MMP-9+and+impaired+T+cell+migration+in+ethanol-fed+BALB/c+mice+infected+with+Respiratory+Syncytial+Virus-2A.">An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A.</a> Alcohol. , (2018).</li><li>Molteni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+device+to+concurrently+assess+leukocyte+extravasation+and+interstitial+migration+within+a+defined+3D+environment.">A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment.</a> Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).</li><li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+in+vitro+3D+co-culture+model+to+engineer+vascularized+bone-mimicking+tissues+combining+computational+tools+and+statistical+experimental+approach.">Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach.</a> Biomaterials. 76, 157-172 (2016).</li><li>Jeon, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+3D+vascularized+organotypic+microfluidic+assays+to+study+breast+cancer+cell+extravasation.">Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).</li></ol>

Heri presenterer vi en veletablert metode for vurdering av chemokine-indusert migrering av lymfocytter i et ex vivo Transmigration-system. Det er flere kritiske trinn i protokollen, hvorav den første er å verifisere uttrykket av riktig chemokine reseptor på immunceller i eksperimentet. I våre hender, valgte vi CCR4 grunn av kroppen av litteraturen som fremhever viktigheten av CCR4 på Th2 Helper T-celler i allergisk betennelse. Ovalbumin-indusert betennelse ble vist tidligere å være begrenset av minst to CCR4 motst...

Denne originale Transmigration metoden ble presentert av Stephen Boyden i 1962 i Journal of Experimental Medicine1. Mye av det vi vet om chemotaxis og chemokinetics ville ikke være mulig uten utviklingen av Boyden kammeret. Før oppdagelsen av den første chemokine i 1977, ex vivo Transmigration systemer ble brukt til å lære om serum-faktorer som kan arrestere mobilnettet bevegelse i makrofager mens forsterke mobilnettet motilitet i nøytrofile1,2. En massiv vell av kunnskap har blitt utviklet om immun celle migrasjon, og hittil har 47 chemokiner nå blitt oppdaget med 19 tilsvarende reseptorer3,4. I tillegg mengder av hemmere/enhancers av disse chemokine trasé har gjennomgått utvikling for terapeutiske formål5,6,7,8. Mange av disse forbindelsene har blitt testet i lignende Transmigration kamre for å forstå direkte interaksjoner mellom forbindelsene og immun cellen respons til en gitt chemokine9.
Transmigration, eller diapedese, i betent vev er en viktig prosess til en sunn inflammatorisk respons for å fjerne smitte10,11. Et Boyden kammer, Transmigration system, eller transwell apparat er vanligvis sammensatt av to kamre adskilt av en porøs membran1,12. Den nederste kammer oftest har medier som inneholder chemokine av interesse, mens leukocytter er plassert i øverste kammeret. Størrelsen på pore i membranen kan velges basert på størrelsen på cellen av interesse. For dette prosjektet, valgte vi en 3 μm porøs membran, som lymfoide celler er 7-20 μm i størrelse, avhengig av stadium av cellulær utvikling. Denne størrelsen på porene sikrer at disse cellene ikke er passivt å falle gjennom porene, men at de er aktivt migrerer som svar på chemokine gradient.
Den store fordelen med denne protokollen er dens kostnadseffektivitet. In vivo Transmigration er vanskelig fordi det krever omfattende opplæring i dyr håndtering og kirurgi, og ofte innebærer høy-drevet mikroskopi som ikke alltid er tilgjengelig for en forsker. Kostnadseffektiv screening av forbindelser som antas å forsterke eller hemme Transmigration kan oppnås i forkant av in vivo Imaging. Fordi Transmigration systemet er strengt kontrollert, celler kan behandles i utgangspunktet deretter lagt til transwell apparatet, eller omvendt, kan chemokine behandles først med en chemokine inhibitor deretter celler lagt til transwell apparatet. Til slutt, endothelial celler og/eller kjeller membran proteiner kan legges til bunnen av transwell sette inn 1-2 dager før Transmigration eksperimentet for å forstå involvering av disse barriere celler i chemokinetics. Igjen, disse manipulasjoner av systemet gir en kraftig måte å bestemme viktig informasjon om effektiviteten av en gitt sammensatte i forkant av mer kompliserte in vivo studier.
Bruk av et Transmigration kammer system er en effektiv måte å vurdere mobilitet av lymfocytter under forskjellige in vivo-og in vitro-betingelser12,13,14. Her beskriver vi en optimalisert metode for å vurdere respons på ex vivo-lymfocytter for å chemokiner i et Transmigration kammer. I dette eksempelet eksperimentet, CD4+ T celler og gruppe 2 medfødte lymfoide celler (ILC2) ble isolert fra mannlige og KVINNELIGE, BALB/c mus etter OVA-allergen eksponering. En hypotese ble generert at CCR4+ CD45+ Lineage-(Lin-) ILC2 fra allergen-utfordret mus ville MIGRERE mer effektivt mot CCL17 og CCL22 enn CCR4+ CD4+ T hjelper celler. CCL17 og CCL22 er chemokiner vanligvis produsert av dendrittiske celler og makrofager av m2 (allergisk) fenotype, blant andre celler, i allergi15,16. CCL17 og CCL22 kan betraktes som biomarkører av allergisk betennelse som de er lett oppdages i lungene under luftveiene eksaserbasjoner16,17,18. Viktigere, CCR4 uttrykk er forhøyet i forhold til ubehandlede kontroller, som avslørt i Bioinformatic data generert fra ILC2 isolert fra huset støv midd behandlede dyr, og tilsvarende ILC2 fra naive dyr behandlet ex vivo med IL-33 ( allergen-fremme medfødt cytokin) upregulates CCR419,20. Videre, ifølge data for ILC2 i immunologiske Genova Project database (www.immgen.org), CCR4 mRNA er svært uttrykt i disse medfødte immunceller. Hittil er lite kjent om handel med ILC2 i vev, men det er sannsynlig at ILC2 og CD4+ T celler bruk lignende chemokiner og reseptorer for chemotaxis og chemokinetics som de uttrykker lignende transkripsjon faktorer og reseptorer. Således, sammenlignet vi CCL17 versus CCL22 respons, av ILC2 og CD4+ T-lymfocytter, fra både mannlige og KVINNELIGE, OVA-utfordret dyr.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15250061</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>329424</td>
			<td>U-100 Syringes Micro-Fine 28G 1/2&#34; 1cc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td>Dilute to 1x in RPMI media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td>polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 um transwell inserts</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-288</td>
			<td>24-well plate containing 12 transwell inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3x stabilizing fixative</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>338036</td>
			<td>Prepare 1x solution according to manufacturers protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene tubes</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>38007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-106</td>
			<td>polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-chamber easy separation magnet</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>18103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>A1049201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced cell strainer, 40 um</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-375</td>
			<td>nylon mesh, 40 micron strainers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Hydroxide, Reagent Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239186-25G</td>
			<td>20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- mouse CCR4; APC-conjugated</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>131211</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>557396</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11c; PE eFluor 610</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>61-0114-82</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD16/32, Fc block</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553141</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>47-0193-82</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>552774</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD45; PE conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>56087</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse ICOS (CD278)</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>564070</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553164</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>145311</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1450102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Dissociator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td>0.5% in serum-free RPMI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter Clides</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1450015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Egg Ovalbumin, Grade V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5503-10G</td>
			<td>500 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1, Filtered</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216)</td>
			<td>25 U/mL in RPMI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compensation beads</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>01-1111-41</td>
			<td>1 drop per contol tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation Tubes</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-335</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>554657</td>
			<td>1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated-FBS</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-525H</td>
			<td>10% in complete RPMI &#38; ILC2 Expansion Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CCL17</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02954-20</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CCL22</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02856-20</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CD4+ T cell enrichment kit</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>19852</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse IL-2</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02764-20</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse ILC2 enrichment kit</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>19842</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse recombinant IL-33</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>78044</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>22400071</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation Buffer</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>20144</td>
			<td>1 X PBS + 2% FBS; stored at 4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small animal nebulizer and chamber</td>
			<td>Data Sciences International</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7124; NDC 0338-0048-04</td>
			<td>0.9% Sodium Chloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of lymphocyte migration in an ex vivo transmigration system

Heri, presenterer vi en effektiv metode som kan utføres med grunnleggende laboratorie ferdigheter og materialer for å vurdere lymfocytter chemokinetic bevegelse i et ex vivo Transmigration system. Gruppe 2 medfødte lymfoide celler (ILC2) og CD4+ T helper celler ble isolert fra spleens og lunger av kylling egg OVALBUMIN (OVA)-utfordret BALB/c mus. Vi bekreftet uttrykk for CCR4 på både CD4+ T celler og ILC2, relativt. CCL17 og CCL22 er de kjente ligander for CCR4; Derfor, ved hjelp av denne ex vivo Transmigration metoden vi undersøkt CCL17- og CCL22-indusert bevegelse av CCR4+ lymfocytter. Å etablere chemokine graderinger, CCL17 og CCL22 ble plassert i bunnen kammer av Transmigration systemet. Isolerte lymfocytter ble deretter lagt til toppen kamre og over en 48 h perioden lymfocytter aktivt migrert gjennom 3 μm porene mot chemokine i bunnen kammeret. Dette er et effektivt system for å bestemme chemokinetics av lymfocytter, men forståelig nok, ikke etterligne kompleksiteten funnet i in vivo organ microenvironments. Dette er en begrensning av metoden som kan overvinnes ved tilsetning av in situ Imaging av orgel og lymfocytter under studien. I kontrast, fordelen med denne metoden er som kan utføres av en entry-level tekniker på en mye mer kostnadseffektiv hastighet enn Live Imaging. Som terapeutiske forbindelser blir tilgjengelig for å forbedre migrasjon, som i tilfelle av tumor infiltrere cytotoksisk immunceller, eller for å hemme migrasjon, kanskje i tilfelle av autoimmune sykdommer der immunopathology er av interesse, kan denne metoden brukes som en verktøy for screening. Generelt er metoden effektivt hvis chemokine av interesse konsekvent genererer chemokinetics på et statistisk høyere nivå enn medie kontrollen. I slike tilfeller kan graden av hemming/forsterkning av en gitt sammensatte bestemmes også.

CCR4 uttrykk på CD4 + T celler og ILC2.
For suksessen av ex vivo Transmigration eksperimentet, er det viktig å avgjøre om lymfocytter er mottakelig for CCL17 og CCL22 gjennom CCR4; Derfor har vi bestemt CCR4 uttrykk på både CD4+ T celler og ILC2 av Flow flowcytometri. Mens det er velkjent at OVA-spesifikke CD4+ Helper T-celler uttrykke CCR4, mindre er kjent av UTTRYKKET av CCR4 på ILC2. Figur 1 viser representative resu...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System at JoVE.com

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

I denne protokollen, er lymfocytter plassert i øverste kammeret i et Transmigration system, adskilt fra bunnen kammer av en porøs membran. Chemokine legges til bunnen kammer, som induserer aktiv migrasjon langs en chemokine gradient. Etter 48 h, er lymfocytter telles i begge kamre for å quantitate Transmigration.

Vurdering av overføring av lymfocytter i et ex vivo Transmigration system

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Lymfocytttransmigrasjon er et viktig trekk ved enhver immunrespons. Derfor er denne protokollen betydelig fordi den gjør det mulig for en forsker å vurdere mobiliteten til lymfocytter i et veldefinert in vitro-system. Den største fordelen med denne teknikken er at ulike chemokines kan vurderes for å bestemme effektiviteten av å indusere migrasjon i nylig definerte celler, for eksempel gruppen to medfødte lymfoide celler, eller ILC2.En annen fordel er at hemmere eller biologiske terapier som tar sikte på å blokkere bestemte chemokinveier, kan testes ved denne metoden før de gjør dyrere eksperimenter med dyr. Begynn med å ekscisere lunger og milter fra eutaniserte ovabehandlede hann- og hunnmus ved hjelp av to til tre dyr per gruppe. Plasser utskåret vev i separate dissosiasjonsrør i henhold til vevstype og dyre kjønn.Plasser lungevevet i 500 mikroliter av lungedissosiasjonsmedier i et dissosiasjonsrør, plasser røret i den automatiserte vevdissosiatoren, og dissosier det ved hjelp av lungeprotokollen. Gjenta disse trinnene for totalt to ganger. For å fjerne miltvev, legg det i 500 mikroliter med komplettE RPMI-medier i dissosiatoren, og bruk deretter miltprotokollen.Arbeide i et biologisk sikkerhetsskap ved hjelp av steril teknikk fra nå av, filtrere hvert dissosiert vev gjennom en 40-mikrometer celle sil, og samle inn i 50-milliliter koniske rør. Skyll dissosiasjonsrørene som inneholder lungehomogenater med fem milliliter ekstra lungedissosiasjonsmedier, rør som inneholder milthomogenater med fem milliliter fullstendig RPMI, og filtrer innholdet gjennom filtrene som brukes til deres tilsvarende vev. For ytterligere å dissosiere lungevev, inkubere lungehomogenater i 15 til 30 minutter i en 37-graders Celsius inkubator med 5% karbondioksid.Tilsett deretter fem milliliter med fullstendig RPMI til både lunge- og milthomogenater, og sentrifuge. Etter å ha kastet det overnaturlige, kombinere pellets som inneholder miltytter og lungeceller fra gruppen av dyr av samme kjønn til en enkelt 50-milliliter konisk rør. Tilsett 10 milliliter med komplett RPMI i hvert rør, og gjenoppliv.Bestem totalt antall celletall ved hjelp av en automatisert celleteller. Juster mannlige og kvinnelige celle suspensjoner til 100 millioner celler per milliliter i separasjonsbuffer, og deretter legge til en fem-milliliter polystyren rør. Etter å ha isolert gruppe to medfødte lymfoidceller fra 2/3 av de totale cellene som beskrevet i manuskriptet, bruk de resterende cellene til CD4-positiv T-celleisolasjonsprosedyre.For å starte CD4-positiv T-celleisolasjon, legg til rotteserum til CD4 T-celleberikelsesfjæringen. Legg deretter isolasjonscocktail til celleprøven, og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur. Vortex raske kuler i 30 sekunder, og legg til celleprøven for å oppnå en fortynning av 75 mikroliter per milliliter.Bland forsiktig og inkuber i 2 1/2 minutter ved romtemperatur. Topp prøvene med omtrent to milliliter separasjonsbuffer opptil tre milliliter, plasser de fem milliliter rørene i åtte-kammers lett separasjonsmagnet, og inkuber i fem minutter ved romtemperatur. Tipp deretter magneten fremover, og pipette hver celle suspensjon i en ren fem-milliliter rør.Tilsett 1,5 milliliter serumfri RPMI til hvert rør, og sentrifuge. Hell av det overnaturlige, og gjenoppusser CD4-positiv T-cellepellet ved 10 millioner celler per milliliter i serumfri RPMI. For å starte denne delen av protokollen, bestemme antall Transwell innsatser som trengs for eksperimentet for både ILC2 og CD4-positive T-celler som beskrevet i manuskriptet.Flytt forsiktig tre mikron Transwell-innsatser fra de midterste radene på en 24-brønnsplate til topp- og bunnradene på samme 24-brønnsplate med pipettespiss og hansker. Tilsett 500 mikroliter med migreringsmedier med CCL17 til 1/3 av brønnene i den midterste raden på 24-brønnsplaten. Tilsett 500 mikroliter med migreringsmedier med CCL22 i ytterligere 1/3 av brønnene.Og til slutt, tilsett 500 mikroliter serumfri RPMI som ikke inneholder chemokin til de siste 1/3 av brønnene. Merk lokket på platen tydelig med navnet på de riktige transmigrasjonsmediene som er plassert i de nederste brønnene. Deretter plasserer Du Transwell-innsatsene tilbake i brønnene som inneholder de ulike behandlingene.Tilsett forsiktig 100 mikroliter cd4 T-celler eller ILC2 til toppbrønnen på hvert innlegg, og pass på at du ikke blander eller pipetterer celleopphenget opp og ned i transbrønnene. Merk lokket på platen tydelig med celletypen plassert i hver brønn, og skriv datoen og klokkeslettet som cellene ble lagt til. Gjenta denne prosessen fra å fjerne Transwell-innsatsene fra platen til alle cellene er plassert i Transwell-innsatser med media.Når cellene av interesse er isolert, er de viktigste trinnene å holde styr på chemokines og celletyper som er plassert i bestemte brønner, for å forsiktig legge celler til de øverste kamrene, og til slutt for å unngå unødvendig kontakt med transmigrasjonsplaten under 48-timers inkubasjon. Plasser platen forsiktig i en 37-graders Celsius inkubator med 5% karbondioksid, og inkuber i 48 timer, og sørg for å minimere kontakten med platen over inkubasjonsperioden. Etter forsiktig fjerning av platen fra inkubatoren, fjern alle Transwell-innsatsene fra de midterste radene inn i de tomme brønnene like over eller under.Samle cellene fra topp og bunn brønner av Transwell setter inn i rør merket med topp eller bunn med CCL17, CCL22, eller media, med celletype, og med replikering nummer. Skyll de nederste brønnene med 500 mikroliter på 1x PBS, samle den inn i de tilsvarende rørene, og gjør det samme for de øverste brønnene. Sentrifuger rørene ved 378 ganger g ved romtemperatur i fem minutter.Bruk en pipette til å forsiktig fjerne alle de supernatante, og deretter bruke T-cellen og ILC2-pellets med 50 mikroliter 1x PBS. Etter å ha fjernet 10 mikroliter av cellefjæringen, legg til 90 mikroliter på 0,4% trypan blå. Telle cellene på den automatiserte celletelleren.Og for hvert utvalg, rekordprosent av levedyktighet og celletall per milliliter, og bestemme det totale antall celler per behandling i toppen og det nederste kammeret. Når CCR4-uttrykket ble vurdert på både CD4-positive T-celler og ILC2 ved flytcytometri, var det ingen forskjeller mellom mannlige og kvinnelige verter. Uttrykket av CCR4 per celle på ILC2 var imidlertid høyere sammenlignet med CD4-positive T-celler.Når det nederste kammeret i Transwell-apparatet var fylt med ubehandlede cellekulturmedier, medier som inneholder CCL22 eller medier som inneholder CCL17, migrerte mindre enn 14 % av cellene i mediekontrollforhold. Som svar på CCL22 svarte begge celletypene, uavhengig av om de var fra mannlige eller kvinnelige verter, på CCL22. CCL22 induserte også større migrering enn CCL17 hos mannlige ILC2.På den annen side induserte CCL17 betydelig migrering av de kvinnelige CD4 T-cellene og ILC2 sammenlignet med media alene. CCL17-behandlingen var ikke annerledes enn media for mannlige CD4-positive T-celler eller mannlige ILC2. Under suboptimale forhold, når platen med CD4-celler forble ved romtemperatur de første 24 timene og deretter flyttet inn i inkubatoren, var det ingen migrering mot CCL22 og CCL17.Videre var levedyktigheten til cellene spesielt lav for cellene i bunnkammeret, noe som viser viktigheten av å bruke de riktige temperaturene og forholdene som er beskrevet i denne protokollen for å oppnå optimale resultater. Når transmigrasjonsprosedyren er fullført, bør man se betydelig migrasjon til chemokin av interesse i forhold til media kontroll brønner. Hvis det ikke er signifikant migrasjon sett, kan man anta at prosedyren ikke fungerte som den skal eller at lymfocytter ikke er lydhøre for den aktuelle chemokinen.Denne teknikken kan brukes bredt for å forstå lymfocyttmigrasjon når disse lymfocytter har gjennomgått et bredt spekter av in vivo behandlinger.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Kvantitativ vurdering av Menneskelig Neutrophil Migration Across en kultivert Blære Epitel

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Vurdere Medfødt Sensing av HIV-1 infiserte CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler ved Plasmacytoid dendrittiske celler ved hjelp av en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modell av en oligodendrocyte styrt T-Cell angrep i akutt hjerneskiver

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymfocyttisolasjonsmetoder fra menneskelig hud for fenotypeanalyser og<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Isolation and Ex Vivo Culture of VÃƒÅ½Ã‚Â´1+CD4+ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells, an Extrathymic ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â²T-cell Progenitor

Isolasjon og<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture of Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T Cells, en Extrathymic αβT-celle Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flowcytometrisk analyse av partikkelbundet Bet v 1 Allergen i PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymfocytter Merking av<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-antistoff Reseptor for målretting<em&gt; In Vivo</em&gt; Celletrafikken av PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...