Name: assessment of lymphocyte migration in an ex vivo transmigration system
Uploaded: 2019-09-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pela American Lung Association (K.J.W.), o Memorial Eugene Kenney fundo concedido a T.A.W. e K.J.W., generoso apoio start-up da Universidade de Utah para K.J.W., e um departamento de assuntos veteranos prêmio de T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. é o destinatário de um prêmio de cientista de carreira de pesquisa (IK6 BX003781) do departamento de assuntos de veteranos. Os autores desejam reconhecer a assistência editorial da Sra. Lisa Chudomelka. Os autores agradecem o núcleo de citometria de fluxo da UNMC por seu apoio na coleta dos dados de citometria de fluxo gerados para este manuscrito.

Todos os métodos descritos aqui foram revisados e aprovados pelos comitês institucionais de cuidados e uso de animais da Universidade de Nebraska Medical Center (UNMC) e da Universidade de Utah.
1. configuração e preparação de reagentes
<ol><li>
Prepare a mídia completa do RPMI (Roswell Park Memorial Institute).
	<ol>
<li>Adicionar 10 mL de soro bovino fetal inativado por calor (FBS) a 90 mL de RPMI.</li>
		<li>Adicionar 1 mL de 100 x penicilina-estreptomicina-glutami...

<ol>
	<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Moser, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+History+of+Chemoattractant+Research.">Editorial: History of Chemoattractant Research.</a> Frontiers in Immunology. 6, 548 (2015).</li><li>Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+sound+the+alarmin:+The+role+of+atypical+chemokine+in+inflammation+and+cancer.">Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer.</a> Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).</li><li>Charo, I. F., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+roles+of+chemokines+and+chemokine+receptors+in+inflammation.">The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation.</a> The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).</li><li>Abboud, D., Hanson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+neutralization+as+an+innovative+therapeutic+strategy+for+atopic+dermatitis.">Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis.</a> Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).</li><li>Aldinucci, D., Casagrande, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+CCL5/CCR5+Axis+against+the+Progression+of+Gastric+Cancer.">Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477 (2018).</li><li>Chonco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+DNA+Aptamers+Against+CCL21+Protein:+Characterization+and+Biomedical+Applications+for+Targeted+Drug+Delivery+to+T+Cell-Rich+Zones.">Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones.</a> Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).</li><li>Trivedi, P. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+differences+in+activation+of+lung-related+type-2+innate+lymphoid+cells+in+experimental+asthma.">Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma.</a> Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).</li><li>Warren, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovalbumin-sensitized+mice+have+altered+airway+inflammation+to+agriculture+organic+dust.">Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust.</a> Respiratory Research. 20 (1), 51 (2019).</li><li>Poole, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphabeta+T+cells+and+a+mixed+Th1/Th17+response+are+important+in+organic+dust-induced+airway+disease.">alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease.</a> Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).</li><li>Matsuo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CCR4+antagonist+ameliorates+atopic+dermatitis-like+skin+lesions+induced+by+dibutyl+phthalate+and+a+hydrogel+patch+containing+ovalbumin.">A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin.</a> Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).</li><li>Mikhak, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+CCR4+and+CCR8+to+antigen-specific+T(H)2+cell+trafficking+in+allergic+pulmonary+inflammation.">Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).</li><li>Monticelli, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells+promote+lung-tissue+homeostasis+after+infection+with+influenza+virus.">Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus.</a> Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).</li><li>Saenz, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL25+elicits+a+multipotent+progenitor+cell+population+that+promotes+T(H)2+cytokine+responses.">IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses.</a> Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).</li><li>Hoyler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+GATA-3+controls+cell+fate+and+maintenance+of+type+2+innate+lymphoid+cells.">The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells.</a> Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).</li><li>Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+cytokine+receptor+gamma+chain+plays+an+essential+role+in+regulating+lymphoid+homeostasis.">The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).</li><li>Warren, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSV-specific+anti-viral+immunity+is+disrupted+by+chronic+ethanol+consumption.">RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption.</a> Alcohol. , (2016).</li><li>Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+association+between+MMP-9+and+impaired+T+cell+migration+in+ethanol-fed+BALB/c+mice+infected+with+Respiratory+Syncytial+Virus-2A.">An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A.</a> Alcohol. , (2018).</li><li>Molteni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+device+to+concurrently+assess+leukocyte+extravasation+and+interstitial+migration+within+a+defined+3D+environment.">A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment.</a> Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).</li><li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+in+vitro+3D+co-culture+model+to+engineer+vascularized+bone-mimicking+tissues+combining+computational+tools+and+statistical+experimental+approach.">Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach.</a> Biomaterials. 76, 157-172 (2016).</li><li>Jeon, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+3D+vascularized+organotypic+microfluidic+assays+to+study+breast+cancer+cell+extravasation.">Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).</li></ol>

Nisto, nós apresentamos um método bem estabelecido para avaliar a migração chemokine-induzida dos linfócitos em um sistema ex vivo da transmigração. Existem várias etapas críticas no protocolo, sendo que a primeira é verificar a expressão do receptor de quimiocina correto nas células imunes no experimento. Em nossas mãos, nós escolhemos CCR4 por causa do corpo da literatura que destaca a importância de CCR4 em células T do ajudante Th2 na inflamação alérgica. A inflamação induzida por ovalbumina foi ...

Este método original de transmigração foi apresentado por Stephen Boyden em 1962 no periódico de medicina experimental1. Muito do que sabemos sobre quimiotaxia e quimiocinetics não seria possível sem o desenvolvimento da câmara de Boyden. Antes da descoberta da primeira quimiocina em 1977, os sistemas de transmigração ex vivo foram utilizados para aprender sobre os fatores séricos que poderiam prender o movimento celular em macrófagos, enquanto amplificavam a motilidade celular em neutrófilos1,2. Uma riqueza maciça do conhecimento foi desenvolvida a respeito da migração imune da pilha, e até à data, 47 quimiocinas foram descobertas agora com 19 receptores correspondentes3,4. Além disso, multidões de inibidores/potenciadores dessas vias de quimiocina passaram por desenvolvimento para fins terapêuticos5,6,7,8. Muitos desses compostos foram testados em câmaras de transmigração semelhantes para compreender as interações diretas entre os compostos e a responsividade da célula imune a uma determinada quimiocina9.
A transmigração, ou diapedese, em tecido inflamado é um processo essencial para uma resposta inflamatória saudável à infecção clara10,11. Uma câmara de Boyden, sistema de transmigração, ou aparelho transwell são geralmente compostas por duas câmaras separadas por uma membrana porosa1,12. A câmara inferior mais frequentemente detém meios contendo a quimiocina de interesse, enquanto os leucócitos são colocados na câmara superior. O tamanho do poro na membrana pode ser selecionado com base no tamanho da célula de interesse. Para este projeto, selecionamos uma membrana porosa de 3 μm, pois as células linfóides têm 7-20 μm de tamanho, dependendo do estágio do desenvolvimento celular. Este tamanho do poro assegura-se de que estas pilhas não estejam caindo passivamente através dos poros, mas que estão migrando ativamente em resposta ao inclinação do quimiocina.
A principal vantagem deste protocolo é a sua rentabilidade. A transmigração in vivo é difícil porque requer treinamento extensivo em manuseio e cirurgia de animais, e muitas vezes envolve microscopia de alta potência que nem sempre está disponível para um pesquisador. A triagem econômica de compostos pensados para aprimorar ou inibir a transmigração pode ser realizada com antecedência na imagem latente in vivo. Como o sistema de transmigração é rigorosamente controlado, as células podem ser tratadas inicialmente, em seguida, adicionadas ao aparelho transwell, ou, vice-versa, a quimiocina pode ser tratada primeiro com um inibidor de quimiocina, em seguida, as células adicionadas ao aparelho transwell. Por fim, células endoteliais e/ou proteínas da membrana basal podem ser adicionadas ao fundo da pastilha transwell 1-2 dias antes do experimento de transmigração para compreender o envolvimento dessas células de barreira em quimiocinetics. Novamente, essas manipulações do sistema fornecem um meio poderoso de determinar informações importantes sobre a eficácia de um determinado composto antes de estudos mais complicados in vivo.
A utilização de um sistema de câmara de transmigração é uma forma efetiva de avaliar a mobilidade dos linfócitos várias condições in vivo e in vitro12,13,14. Nisto, nós descrevemos um método aperfeiçoado para avaliar a compreensibilidade ex vivo do linfócito aos quimiocinas em uma câmara do transmigração. Neste experimento de exemplo, as células T CD4+ e as células linfóides inatas do grupo 2 (ILC2) foram isoladas de camundongos machos e fêmeas, Balb/c após exposição de óvulos-alérgeno. Uma hipótese foi gerada que CCR4+ CD45+ Lineage-(Lin-) ILC2 dos ratos alérgeno-desafiados migrariam mais EFICIENTEMENTE para CCL17 e CCL22 do que pilhas do ajudante de CCR4+ de CD4+ T. CCL17 e CCL22 são quimiocinas comumente produzidas por células dendríticas e macrófagos do fenótipo m2 (alérgico), entreoutrascélulas, emalergia15,16. CCL17 e CCL22 podem ser pensados como biomarcadores de inflamaçãoalérgica, poissão prontamente detectados nos pulmões durante as exacerbações das vias aéreas16,17,18. É importante ressaltar que a expressão CCR4 é elevada em comparação aos controles não tratados, como revelado em dados bioinformaticos gerados a partir de ILC2 isolados de animais tratados com ácaros da casa, e similarmente ILC2 de animais ingênuos tratados ex vivo com IL-33 ( cytokine inata de promoção do alérgeno) upregulates CCR4,19. Além disso, de acordo com dados para ILC2 na base de dados do projeto do genoma imunológico (www.immgen.org), CCR4 mRNA é expressado altamente nestas pilhas imunes inata. Até o momento, pouco se sabe sobre o tráfico de ILC2 em tecidos, mas é provável que as células T de ILC2 e CD4+ usem quimiocinas e receptores semelhantes para quimiotaxia e quimiocinetics, pois expressam fatores e receptores de transcrição semelhantes. Assim, comparamos a responsividade CCL17 versus CCL22, dos linfócitos T de ILC2 e CD4+ , tanto de machos como de fêmeas, animais desafiados por óvulos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15250061</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>329424</td>
			<td>U-100 Syringes Micro-Fine 28G 1/2&#34; 1cc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td>Dilute to 1x in RPMI media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td>polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 um transwell inserts</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-288</td>
			<td>24-well plate containing 12 transwell inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3x stabilizing fixative</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>338036</td>
			<td>Prepare 1x solution according to manufacturers protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene tubes</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>38007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-106</td>
			<td>polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-chamber easy separation magnet</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>18103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>A1049201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced cell strainer, 40 um</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-375</td>
			<td>nylon mesh, 40 micron strainers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Hydroxide, Reagent Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239186-25G</td>
			<td>20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- mouse CCR4; APC-conjugated</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>131211</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>557396</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11c; PE eFluor 610</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>61-0114-82</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD16/32, Fc block</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553141</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>47-0193-82</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>552774</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD45; PE conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>56087</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse ICOS (CD278)</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>564070</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553164</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>145311</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1450102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Dissociator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td>0.5% in serum-free RPMI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter Clides</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1450015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Egg Ovalbumin, Grade V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5503-10G</td>
			<td>500 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1, Filtered</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216)</td>
			<td>25 U/mL in RPMI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compensation beads</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>01-1111-41</td>
			<td>1 drop per contol tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation Tubes</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-335</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>554657</td>
			<td>1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated-FBS</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-525H</td>
			<td>10% in complete RPMI &#38; ILC2 Expansion Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CCL17</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02954-20</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CCL22</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02856-20</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CD4+ T cell enrichment kit</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>19852</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse IL-2</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02764-20</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse ILC2 enrichment kit</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>19842</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse recombinant IL-33</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>78044</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>22400071</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation Buffer</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>20144</td>
			<td>1 X PBS + 2% FBS; stored at 4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small animal nebulizer and chamber</td>
			<td>Data Sciences International</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7124; NDC 0338-0048-04</td>
			<td>0.9% Sodium Chloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of lymphocyte migration in an ex vivo transmigration system

Neste documento, apresentamos um método eficiente que pode ser executado com habilidades e materiais laboratoriais básicos para avaliar o movimento quimiocineítico do linfócito em um sistema de transmigração ex vivo. As pilhas lymphoid inata do grupo 2 (ILC2) e as pilhas do ajudante de CD4+ T foram isoladas dos baços e dos pulmões do ovalbumina do ovo da galinha (óvulos)-desafiaram ratos de Balb/c. Nós confirmamos a expressão de CCR4 em pilhas de T CD4+ e em ILC2, comparativamente. CCL17 e CCL22 são os ligantes conhecidos para CCR4; Conseqüentemente, usando este método ex vivo da transmigração nós examinamos o movimento CCL17- e CCL22-INDUCED de CCR4+ linfócitos. Para estabelecer gradientes de quimiocina, CCL17 e CCL22 foram colocados na câmara inferior do sistema de transmigração. Os linfócitos isolados foram adicionados então às câmaras superiores e sobre um período de 48 h os linfócitos migraram ativamente através dos poros de 3 μm para o quimiocina na câmara inferior. Este é um sistema eficaz para determinar o chemokinetics dos linfócitos, mas, compreensivelmente, não imitam as complexidades encontradas nos microambientes in vivo do órgão. Esta é uma limitação do método que pode ser superado pela adição da imagem latente in situ do órgão e dos linfócitos o estudo. Por outro lado, a vantagem deste método é que é pode ser realizada por um técnico de nível de entrada a uma taxa muito mais rentável do que imagens ao vivo. Como os compostos terapêuticos tornam-se disponíveis para melhorar a migração, como no caso de tumor infiltrando células imunes citotóxicas, ou para inibir a migração, talvez no caso de doenças auto-imunes onde a Imunopatologia é preocupante, este método pode ser usado como um ferramenta de triagem. Em geral, o método é eficaz se a quimiocina de interesse é consistentemente gerando quimiocinetics em um nível estatisticamente mais elevado do que o controle de mídia. Em tais casos, o grau de inibição/realce por um composto dado pode ser determinado também.

Expressão CCR4 em células T CD4 + e ILC2.
Para o sucesso do experimento de transmigração ex vivo, é imperativo determinar se os linfócitos são responsivos a CCL17 e CCL22 a CCR4; Conseqüentemente, nós determinamos a expressão CCR4 em pilhas de T CD4+ e ILC2 pela citometria do fluxo. Embora seja bem sabido que as células T do ajudante CD4+ específicas de ova expressam CCR4, menos é conhecida da expressão de CCR4 em ILC2. A <strong class="xfig...

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Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Neste protocolo, os linfócitos são colocados na câmara superior de um sistema de transmigração, separados da câmara inferior por uma membrana porosa. A quimiocina é adicionada à câmara inferior, o que induz a migração ativa ao longo de um gradiente de quimiocina. Após 48 h, os linfócitos são contados em ambas as câmaras para quantificar o transmigration.

Avaliação da migração do linfócito em um sistema de transmigração ex vivo

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Transmigração linfócito é uma característica importante de qualquer resposta imune. Portanto, esse protocolo é significativo porque permite que um pesquisador avalie a mobilidade de linfócitos em um sistema in vitro bem definido. A principal vantagem desta técnica é que várias quimiocinas podem ser avaliadas para determinar sua eficácia de induzir a migração em células recentemente definidas, como o grupo duas células linfoides inatas, ou ILC2.Uma segunda vantagem é que inibidores ou terapias biológicas destinadas a bloquear caminhos específicos de quimioterapia podem ser testados por este método antes de fazer experimentos mais caros com animais. Comece excisando pulmões e baços de camundongos machos e fêmeas tratados com ovários eutanizados usando dois a três animais por grupo. Coloque tecidos excisados em tubos separados de dissociação de acordo com o tipo de tecido e o sexo animal.Coloque o tecido pulmonar em 500 microliters de mídia de dissociação pulmonar em um tubo de dissociação, coloque o tubo no dissociador de tecido automatizado e dissocia-o usando o protocolo pulmonar. Repita estes passos por um total de duas vezes. Para dissociar o tecido do baço, coloque-o em 500 microliters de mídia RPMI completa no dissociador e, em seguida, use o protocolo do baço.Trabalhando em um armário de segurança biológica usando técnica estéril a partir de agora, filtrar cada tecido dissociado através de um coador de células de 40 micrômetros, e coletar em tubos cônicos de 50 mililitros. Enxágüe os tubos de dissociação contendo homogeneizadores pulmonares com cinco mililitros de mídia adicional de dissociação pulmonar, tubos contendo homogêneos de baço com cinco mililitros de RPMI completos, e filtre seu conteúdo através dos filtros utilizados para seus tecidos correspondentes. Para dissociar ainda mais o tecido pulmonar, incubar homogeneiza pulmonares por 15 a 30 minutos em uma incubadora Celsius de 37 graus com 5% de dióxido de carbono.Em seguida, adicione cinco mililitros de RPMI completos tanto para o pulmão quanto para o baço homogeneiza, e centrífuga. Depois de descartar o supernasce, combine as pelotas contendo esplenócitos e células pulmonares do grupo de animais do mesmo sexo em um único tubo cônico de 50 mililitros. Adicione 10 mililitros de RPMI completos a cada tubo e resuspend.Determine a contagem total de células usando um contador automático de células. Ajuste as suspensões celulares masculinas e femininas para 100 milhões de células por mililitro no buffer de separação, e depois adicione a um tubo de poliestireno de cinco mililitros. Após isolar o grupo duas células linfoides inatas de 2/3 das células totais descritas no manuscrito, use as células restantes para o procedimento de isolamento celular T CD4 positivo.Para iniciar o isolamento da célula T CD4 positivo, adicione soro de rato à suspensão de enriquecimento de células CD4 T. Em seguida, adicione coquetel de isolamento à amostra celular e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente. O vórtice tem esferas rápidas por 30 segundos e adiciona à amostra celular para obter uma diluição de 75 microliters por mililitro.Misture delicadamente e incubar por 2 minutos e meio em temperatura ambiente. Cubra as amostras com aproximadamente dois mililitros de tampão de separação até três mililitros, coloque os tubos de cinco mililitros no ímã de separação fácil de oito câmaras e incubar por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, incline o ímã para a frente, e pipeta cada suspensão celular em um tubo limpo de cinco mililitros.Adicione 1,5 mililitros de RPMI sem soro a cada tubo e centrífuga. Despeje o supernasce, e resuspengue a pelota de célula T CD4 positivo em 10 milhões de células por mililitro em RPMI sem soro. Para iniciar esta parte do protocolo, determine o número de pastilhas Transwell necessárias para o experimento para células T ILC2 e CD4 positivos, conforme descrito no manuscrito.Mova suavemente as pastilhas Transwell de três mícrons das fileiras médias de uma placa de 24 poços para as linhas superior e inferior da mesma placa de 24 poços com uma ponta de pipeta e mãos enluvadas. Adicione 500 microliters de mídia migratória com CCL17 a 1/3 dos poços na linha do meio da placa de 24 poços. Adicione 500 microliters de mídia migratória com CCL22 a outros 1/3 dos poços.E, finalmente, adicione 500 microliters de RPMI sem soro contendo não quimiocinas nos últimos 1/3 dos poços. Rotule a tampa na placa claramente com o nome da mídia de transmigração apropriada colocada nos poços inferiores. Em seguida, coloque as inserções transwell de volta nos poços contendo os vários tratamentos.Adicione suavemente 100 microliters de células CD4 T ou ILC2 ao poço superior de cada inserção, certificando-se de não misturar ou pipeta a suspensão celular para cima e para baixo nos Transwells. Rotule a tampa na placa claramente com o tipo de célula colocada em cada poço, e escreva a data e a hora do dia em que as células foram adicionadas. Repita este processo a partir da remoção das pastilhas Transwell da placa até que todas as células tenham sido colocadas em pastilhas Transwell com mídia.Uma vez que as células de interesse são isoladas, os passos mais importantes são manter o controle das quimiocinas e tipos de células que são colocadas em poços particulares, adicionar suavemente células às câmaras superiores e, por último, evitar contato desnecessário com a placa de transmigração durante a incubação de 48 horas. Coloque suavemente a placa em uma incubadora Celsius de 37 graus com 5% de dióxido de carbono e incubar por 48 horas, certificando-se de minimizar o contato com a placa durante o período de incubação. Depois de remover suavemente a placa da incubadora, remova todas as pastilhas Transwell das linhas do meio para os poços vazios logo acima ou abaixo.Colete as células dos poços superior e inferior das pastilhas Transwell em tubos rotulados com parte superior ou inferior com CCL17, CCL22 ou mídia, com o tipo de célula, e com o número de replicação. Enxágüe os poços inferiores com 500 microliters de 1x PBS, colete-o nos tubos correspondentes e faça o mesmo pelos poços superiores. Centrifugar os tubos a 378 vezes g à temperatura ambiente por cinco minutos.Use uma pipeta para remover suavemente todo o supernascer e, em seguida, resuspend células T e pelotas ILC2 com 50 microliters de 1x PBS. Depois de remover 10 microliters da suspensão celular, adicione 90 microliters de 0,4% azul trypan. Conte as células no contador automático de células.E para cada amostra, recorde percentual de viabilidade e contagem de células por mililitro, e determina o número total de células por tratamento na câmara superior e inferior. Quando a expressão CCR4 foi avaliada em ambas as células T CD4-positivas e ILC2 por citometria de fluxo, não houve diferenças entre hospedeiros masculinos e femininos. No entanto, a expressão de CCR4 em uma base por célula no ILC2 foi maior em comparação com as células T CD4 positivas.Quando a câmara inferior do aparelho Transwell estava cheia de mídia de cultura celular não tratada, mídia contendo CCL22, ou mídia contendo CCL17, menos de 14% das células migraram em condições de controle de mídia. Em resposta ao CCL22, ambos os tipos de células, independentemente de serem de hospedeiros masculinos ou femininos, responderam à CCL22. Além disso, o CCL22 induziu maior migração do que o CCL17 no ILC2 masculino.Por outro lado, o CCL17 induziu uma migração significativa das células CD4 T femininas e ILC2 em comparação apenas com a mídia. O tratamento CCL17 não foi diferente da mídia para células T cd4-positivas masculinas ou ILC2 masculinas. Em condições subótimas, quando a placa com células CD4 permaneceu em temperatura ambiente durante as primeiras 24 horas e depois mudou-se para a incubadora, não houve migração para CCL22 e CCL17.Além disso, a viabilidade das células foi notavelmente baixa para as células na câmara inferior, mostrando a importância de usar as temperaturas e condições corretas descritas neste protocolo para alcançar resultados ideais. Uma vez concluído o procedimento de transmigração, deve-se ver uma migração significativa para a quimiocina de interesse em comparação com os poços de controle de mídia. Se não for observada uma migração significativa, pode-se supor que o procedimento não funcionou corretamente ou que os linfócitos não respondem à quimioterapia em questão.Esta técnica pode ser usada amplamente para entender a migração de linfócitos quando esses linfócitos foram submetidos a uma ampla gama de tratamentos in vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Imunologia e Infecção

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Não-invasiva por imagem do Homing leucócitos e Migração In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Avaliação quantitativa de neutrófilos humanos migração através de um Cultivadas bexiga Epitélio

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Avaliando a inata Sensing de HIV-1 CD4 Infected<sup&gt; +</sup&gt; As células T por células dendríticas plasmocitóides Usando um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura do sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de um Ataque de T-Cell dirigiu-Oligodendrocyte em Agudos fatias de cérebro

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Isolamento de linfócitos da pele humana para análise fenotípica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Células

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Isolation and Ex Vivo Culture of VÃƒÅ½Ã‚Â´1+CD4+ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells, an Extrathymic ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â²T-cell Progenitor

Isolamento e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Células T, γδ um Extrathymic αβT de células progenitoras

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Citometria de fluxo de partículas ligadas aos Bet v 1 alérgeno no PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murino Linfócitos Rotulagem por<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antibody Receptor Segmentação para<em&gt; In Vivo</em&gt; Tráfico celular por PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...