Name: assessment of lymphocyte migration in an ex vivo transmigration system
Uploaded: 2019-09-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System at JoVE.com

Эта работа была профинансирована Американской ассоциацией легких (K.J.W.), Фондом Мемориала Евгения Кенни, присужденным T.A.W. и K.J.W., щедрой поддержкой стартапа от Университета штата юта для K.J.W., и наградой Департамента по делам ветеранов T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. является лауреатом премии научно-исследовательской карьеры (IK6 BX003781) от Департамента по делам ветеранов. Авторы хотят отметить редакционную помощь от г-жи Лизы Чудомелько. Авторы благодарят ядро ЦИтометрии потока UNMC за их поддержку в сборе данных цитометрии потока, генерируемых для этой рукописи.

Все описанные здесь методы были рассмотрены и одобрены институциональными комитетами по уходу за животными и использованию в Медицинском центре Университета штата Небраска (UNMC) и Университете штата
1. Установка и подготовка реагентов
<ol><li>
Подготовьте полный RPMI (Ро...

<ol>
	<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Moser, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+History+of+Chemoattractant+Research.">Editorial: History of Chemoattractant Research.</a> Frontiers in Immunology. 6, 548 (2015).</li><li>Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+sound+the+alarmin:+The+role+of+atypical+chemokine+in+inflammation+and+cancer.">Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer.</a> Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).</li><li>Charo, I. F., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+roles+of+chemokines+and+chemokine+receptors+in+inflammation.">The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation.</a> The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).</li><li>Abboud, D., Hanson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+neutralization+as+an+innovative+therapeutic+strategy+for+atopic+dermatitis.">Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis.</a> Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).</li><li>Aldinucci, D., Casagrande, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+CCL5/CCR5+Axis+against+the+Progression+of+Gastric+Cancer.">Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477 (2018).</li><li>Chonco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+DNA+Aptamers+Against+CCL21+Protein:+Characterization+and+Biomedical+Applications+for+Targeted+Drug+Delivery+to+T+Cell-Rich+Zones.">Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones.</a> Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).</li><li>Trivedi, P. J., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+Chemokine+Receptors+as+Therapeutic+Targets+in+Inflammatory+Bowel+Disease;+Pitfalls+and+Promise.">Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise.</a> Journal of Crohn's and Colitis. 12 (12), 1508 (2018).</li><li>Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+of+chemotaxis+as+a+window+into+mechanisms+of+toxicant-induced+immunomodulation.">In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation.</a> Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).</li><li>Davis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+studying+the+immune+system+leads+us+to+new+medicines.">How studying the immune system leads us to new medicines.</a> Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).</li><li>Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+chemokine+expression+following+respiratory+virus+infection+reflects+Th1-+or+Th2-biased+immunopathology.">Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology.</a> Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).</li><li>Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+chemokines+CCL2+and+CXCL10+by+matrix+metalloproteinases-2+and+-9:+implications+for+chemotaxis.">Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis.</a> Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).</li><li>Burrell, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+Node+Stromal+Fiber+ER-TR7+Modulates+CD4++T+Cell+Lymph+Node+Trafficking+and+Transplant+Tolerance.">Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance.</a> Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).</li><li>Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminins+affect+T+cell+trafficking+and+allograft+fate.">Laminins affect T cell trafficking and allograft fate.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).</li><li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th2+cell+differentiation+from+naive+CD4(+)+T+cells+is+enhanced+by+autocrine+CC+chemokines+in+atopic+diseases.">Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases.</a> Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).</li><li>Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Arrestin-2-Dependent+Signaling+Promotes+CCR4-mediated+Chemotaxis+of+Murine+T-Helper+Type+2+Cells.">beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+antagonist+for+CCR4+attenuates+allergic+lung+inflammation+in+a+mouse+model+of+asthma.">A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma.</a> Science Reports. 7 (1), 15038 (2017).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+helper+CD4+T+cells+during+acute+and+stable+allergic+asthma.">Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma.</a> Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).</li><li>Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Group+2+Innate+Lymphoid+Cells+in+Allergic+Airway+Inflammation+Models+in+the+Mouse.">Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse.</a> Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).</li><li>Li, B. W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group+2+Innate+Lymphoid+Cells+Exhibit+a+Dynamic+Phenotype+in+Allergic+Airway+Inflammation.">Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1684 (2017).</li><li>Warren, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+differences+in+activation+of+lung-related+type-2+innate+lymphoid+cells+in+experimental+asthma.">Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma.</a> Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).</li><li>Warren, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovalbumin-sensitized+mice+have+altered+airway+inflammation+to+agriculture+organic+dust.">Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust.</a> Respiratory Research. 20 (1), 51 (2019).</li><li>Poole, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphabeta+T+cells+and+a+mixed+Th1/Th17+response+are+important+in+organic+dust-induced+airway+disease.">alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease.</a> Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).</li><li>Matsuo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CCR4+antagonist+ameliorates+atopic+dermatitis-like+skin+lesions+induced+by+dibutyl+phthalate+and+a+hydrogel+patch+containing+ovalbumin.">A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin.</a> Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).</li><li>Mikhak, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+CCR4+and+CCR8+to+antigen-specific+T(H)2+cell+trafficking+in+allergic+pulmonary+inflammation.">Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).</li><li>Monticelli, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells+promote+lung-tissue+homeostasis+after+infection+with+influenza+virus.">Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus.</a> Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).</li><li>Saenz, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL25+elicits+a+multipotent+progenitor+cell+population+that+promotes+T(H)2+cytokine+responses.">IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses.</a> Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).</li><li>Hoyler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+GATA-3+controls+cell+fate+and+maintenance+of+type+2+innate+lymphoid+cells.">The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells.</a> Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).</li><li>Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+cytokine+receptor+gamma+chain+plays+an+essential+role+in+regulating+lymphoid+homeostasis.">The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).</li><li>Warren, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSV-specific+anti-viral+immunity+is+disrupted+by+chronic+ethanol+consumption.">RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption.</a> Alcohol. , (2016).</li><li>Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+association+between+MMP-9+and+impaired+T+cell+migration+in+ethanol-fed+BALB/c+mice+infected+with+Respiratory+Syncytial+Virus-2A.">An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A.</a> Alcohol. , (2018).</li><li>Molteni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+device+to+concurrently+assess+leukocyte+extravasation+and+interstitial+migration+within+a+defined+3D+environment.">A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment.</a> Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).</li><li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+in+vitro+3D+co-culture+model+to+engineer+vascularized+bone-mimicking+tissues+combining+computational+tools+and+statistical+experimental+approach.">Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach.</a> Biomaterials. 76, 157-172 (2016).</li><li>Jeon, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+3D+vascularized+organotypic+microfluidic+assays+to+study+breast+cancer+cell+extravasation.">Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).</li></ol>

В этом виде мы представляем устоявшийся метод оценки миграции лимфоцитов, индуцированной хемокином, в системе трансмиграции ex vivo. Есть несколько критических шагов в протоколе, первый из которых является проверка экспрессии правильного рецептора хемокина на иммунных клетках в экспери...

Этот оригинальный метод трансмиграции был представлен Стивен бойден в 1962 году в журнале экспериментальной медицины1. Многое из того, что мы знаем о химоксике и хемокинетике, было бы невозможно без развития Бойденской камеры. До открытия первого хемокина в 1977 году, ex vivo трансмиграции системы были использованы, чтобы узнать о сыворотки-факторов, которые могли бы остановить клеточное движение в макрофагах при одновременном усилении подвижности клеток в нейтрофилов1,2. Массивное богатство знаний было разработано в отношении миграции иммунных клеток, и на сегодняшний день, 47 хемокины в настоящее время обнаружены с 19 соответствующих рецепторов3,4. Кроме того, множество ингибиторов /усилителей этих хемокиновых путей претерпели развитие в терапевтических целях5,6,7,8. Многие из этих соединений были протестированы в аналогичных камерах трансмиграции, чтобы понять прямое взаимодействие между соединениями и иммунной реакции клеток к данному хемокину9.
Трансмиграция, или диапедез, в воспаленные ткани является важным процессом для здорового воспалительного ответа на ясную инфекцию10,11. Камера Бойдена, трансмиграционная система или трансвелл-аппарат, как правило, состоят из двух камер, разделенных пористой мембраной1,12. Нижняя камера чаще всего содержит средства, содержащие хемокин интерес, в то время как лейкоциты помещаются в верхней камере. Размер поры в мембране может быть выбран в зависимости от размера клетки интереса. Для этого проекта мы выбрали пористую мембрану площадью 3 мкм, так как лимфоидные клетки имеют размер 7-20 мкм в зависимости от стадии клеточного развития. Этот размер пор гарантирует, что эти клетки не пассивно падают через поры, но что они активно мигрируют в ответ на градиент хемокина.
Основным преимуществом этого протокола является его рентабельность. Инвиво трансмиграция трудна, потому что она требует обширной подготовки в области обращения с животными и хирургии, и часто включает в себя мощную микроскопию, которая не всегда доступна исследователю. Экономически эффективный скрининг соединений, которые, как считается, усиливают или подавляют трансмиграцию, может быть выполнен до создания in vivo изображений. Поскольку система трансмиграции жестко контролируется, клетки могут быть обработаны сначала затем добавлены в трансвелл аппарат, или, наоборот, хемокин может рассматриваться сначала с ингибитором хемокина, а затем клетки, добавленные в трансвелл аппарата. Наконец, эндотелиальные клетки и/или белки мембраны в подвале могут быть добавлены в нижней части вставки трансуэлла за 1-2 дня до эксперимента по трансмиграции, чтобы понять, как эти барьерные клетки существуют в химиокинетике. Опять же, эти манипуляции системы обеспечивают мощное средство определения важной информации об эффективности данного соединения до более сложных исследований in vivo.
Использование системы камер ы трансмиграции является эффективным способом оценки подвижности лимфоцитов в различных условиях in vivo и in vitro12,13,14. В этом мы описываем оптимизированный метод оценки реакции экзиво-лимфоцитов к хемокины в камере трансмиграции. В этом примере эксперимента, CD4и Т-клеток и группы 2 врожденных лимфоидных клеток (ILC2) были изолированы от мужчин и женщин, BALB /c мышей после ova-аллерген воздействия. Была выдвинута гипотеза о том, что CCR4и CD45- Lineage- (LIN-) ILC2 от аллергенов-проблемных мышей будут мигрировать более эффективно к CCL17 и CCL22, чем CCR4и CD4и T клетки-помощники. CCL17 и CCL22 являются хемокины обычно производятся дендритных клеток и макрофагов М2 (аллергический) фенотип, среди других клеток, в аллергии15,16. CCL17 и CCL22 можно рассматривать как биомаркеры аллергического воспаления, поскольку они легко обнаруживаются в легких во время обострений дыхательных путей16,17,18. Важно отметить, что выражение CCR4 повышено по сравнению с необработанным контролем, как показано в биоинформатичных данных, полученных из ILC2, изолированных от домашней пыли клеща обработанных животных, и аналогичным образом ILC2 от наивных животных, обработанных ex vivo с IL-33 ( аллерген-сопродвигая врожденный цитокин) upregulates CCR419,20. Кроме того, согласно данным для ILC2 в базе данных Проекта иммунологического генома (www.immgen.org), CCR4 mRNA высоко выражен в этих врожденных иммунных клетках. На сегодняшний день мало что известно о торговле ILC2 в тканях, но вполне вероятно, что ILC2 и CD4- Т-клетки используют аналогичные хемокины и рецепторы для хемотаксиса и хемокинетики, поскольку они выражают аналогичные транскрипционные факторы и рецепторы. Таким образом, мы сравнили CCL17 по сравнению с отзывчивостью CCL22, iLC2 и CD4и T лимфоцитов, как от мужчин, так и от женщин, с ova-challenged животных.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15250061</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>329424</td>
			<td>U-100 Syringes Micro-Fine 28G 1/2&#34; 1cc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td>Dilute to 1x in RPMI media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td>polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 um transwell inserts</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-288</td>
			<td>24-well plate containing 12 transwell inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3x stabilizing fixative</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>338036</td>
			<td>Prepare 1x solution according to manufacturers protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene tubes</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>38007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-106</td>
			<td>polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-chamber easy separation magnet</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>18103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>A1049201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced cell strainer, 40 um</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-375</td>
			<td>nylon mesh, 40 micron strainers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Hydroxide, Reagent Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239186-25G</td>
			<td>20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- mouse CCR4; APC-conjugated</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>131211</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>557396</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11c; PE eFluor 610</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>61-0114-82</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD16/32, Fc block</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553141</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>47-0193-82</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>552774</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD45; PE conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>56087</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse ICOS (CD278)</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>564070</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553164</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>145311</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1450102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Dissociator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td>0.5% in serum-free RPMI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter Clides</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1450015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Egg Ovalbumin, Grade V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5503-10G</td>
			<td>500 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1, Filtered</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216)</td>
			<td>25 U/mL in RPMI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compensation beads</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>01-1111-41</td>
			<td>1 drop per contol tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation Tubes</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-335</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>554657</td>
			<td>1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated-FBS</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-525H</td>
			<td>10% in complete RPMI &#38; ILC2 Expansion Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CCL17</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02954-20</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CCL22</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02856-20</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CD4+ T cell enrichment kit</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>19852</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse IL-2</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02764-20</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse ILC2 enrichment kit</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>19842</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse recombinant IL-33</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>78044</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>22400071</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation Buffer</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>20144</td>
			<td>1 X PBS + 2% FBS; stored at 4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small animal nebulizer and chamber</td>
			<td>Data Sciences International</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7124; NDC 0338-0048-04</td>
			<td>0.9% Sodium Chloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of lymphocyte migration in an ex vivo transmigration system

В этом случае мы представляем эффективный метод, который может быть выполнен с помощью базовых лабораторных навыков и материалов для оценки лимфоцитов хемокинетического движения в системе экс-виво-трансмиграции. Группа 2 врожденных лимфоидных клеток (ILC2) и CD4T помощник клетки были выделены из селезенки и легких куриного яичного овальбумина (OVA) оспаривается BALB / c мышей. Мы подтвердили выражение CCR4 на обоих CD4и Т-клетках и ILC2, сравнительно. CCL17 и CCL22 являются известными лигандами для CCR4; Поэтому, используя этот метод экс-виво-трансмиграции, мы изучили CCL17- и CCL22-индуцированное движение CCR4и лимфоцитов. Для установления градиентов хемокина, CCL17 и CCL22 были помещены в нижнюю камеру системы трансмиграции. Изолированные лимфоциты затем были добавлены в верхние камеры и в течение 48 ч период лимфоциты активно мигрировали через 3 мкм поры к хемокину в нижней камере. Это эффективная система определения хемокинетики лимфоцитов, но, понятно, не имитирует сложности, обнаруженные в микросреде органов in vivo. Это одно ограничение метода, который может быть преодолен путем добавления на месте изображения органа и лимфоцитов в исследовании. В отличие от этого метода является то, что может быть выполнена начального уровня техник на гораздо более экономически эффективным и в том, что такое живая визуализация. Как терапевтические соединения становятся доступными для повышения миграции, как и в случае опухоли инфильтрации цитотоксических иммунных клеток, или ингибировать миграцию, возможно, в случае аутоиммунных заболеваний, где иммунопатология вызывает озабоченность, этот метод может быть использован в качестве инструмент скрининга. В целом, метод эффективен, если хемокин интереса последовательно генерации хемокинетии на статистически более высоком уровне, чем контроль средств массовой информации. В таких случаях также может быть определена степень торможения/усиления данным соединением.

Выражение CCR4 на CD4 "Т-клетки и ILC2.
Для успеха эксперимента ex vivo трансмиграции, необходимо определить, являются ли лимфоциты реагировать на CCL17 и CCL22 через CCR4; Поэтому мы определили экспрессию CCR4 на обоих CD4и Т-клетках и ILC2 по цитометрии потока. Хотя хорошо изве?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System at JoVE.com

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

В этом протоколе лимфоциты помещаются в верхнюю камеру системы трансмиграции, отделенную от нижней камеры пористой мембраной. Хемокин добавляется в нижнюю камеру, что индуцирует активную миграцию вдоль градиента хемокина. После 48 ч лимфоциты учитываются в обеих камерах для количественной оценки трансмиграции.

Оценка миграции лимфоцитов в системе трансмиграции Ex Vivo

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Лимфоцитная трансмиграция является важной особенностью любого иммунного ответа. Таким образом, этот протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет исследователю оценить подвижность лимфоцитов в четко определенной системе in vitro. Основным преимуществом этого метода является то, что различные хемокины могут быть оценены, чтобы определить их эффективность индуцирования миграции в недавно определенных клетках, таких как группа 2 врожденных лимфоидных клеток, или ILC2.Вторым преимуществом является то, что ингибиторы или биологические методы лечения, направленные на блокирование конкретных путей хемокина могут быть проверены с помощью этого метода до выполнения более дорогостоящих экспериментов с животными. Начните с excising легких и селезенки от усыпанных ova-обработанных мышей и женщин используя 2 до 3 животных в группу. Поместите вырезанные ткани в отдельные диссоциацианые трубки в зависимости от типа тканей и пола животных.Поместите легочную ткань в 500 микролитров средств диссоциации легких в диссоциарной трубке, поместите трубку в автоматизированный диссоциатор ткани и отмежевать ее с помощью протокола легких. Повторите эти шаги в общей сложности два раза. Чтобы разобщить ткани селезенки, поместите его в 500 микролитров полного RPMI сми в диссоциатор, а затем использовать протокол селезенки.Работая в кабинете биологической безопасности, используя стерильную технику отныне, фильтруйте каждую разобщенной ткани через 40-микрометровый клеточный ситечко и собирайте в 50-миллилитровые конические трубки. Промыть диссоциарные трубки, содержащие гомогенаты легких с пятью миллилитров дополнительных средств диссоциации легких, трубки, содержащие селезенки гомогенатов с пятью миллилитров полного RPMI, и фильтр их содержимое через фильтры, используемые для их соответствующих тканей. Для дальнейшего разобщения легочной ткани, инкубировать легких гомогенатов в течение 15 до 30 минут в 37-градусный инкубатор по Цельсию с 5%углекислого газа.Затем добавьте пять миллилитров полного RPMI как к гомогенатам легких и селезенки, так и к центрифуге. После отбрасывания супернатанта, объединить гранулы, содержащие спеноциты и клетки легких из группы животных того же пола в одну 50-миллилитровую коническую трубку. Добавьте 10 миллилитров полного RPMI к каждой трубке и повторно посовещение.Определите общее количество ячеек с помощью автоматизированного счетчика ячеек. Отрегулируйте мужские и женские клеточные суспензии до 100 миллионов клеток на миллилитр в буфере разделения, а затем добавьте в пятимиллилитровую полистироловую трубку. После изоляции группы 2 врожденных лимфоидных клеток от 2/3 от общего числа клеток, описанных в рукописи, используйте оставшиеся клетки для cd4-положительной процедуры изоляции Т-клеток.Чтобы начать CD4-положительную изоляцию Т-клеток, добавьте крысиную сыворотку к подвеске обогащения клеток CD4 T. Затем добавьте изоляционный коктейль в образец клетки и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. Вихрь быстрых сфер в течение 30 секунд, и добавить в образец клетки для достижения разбавления 75 микролитров на миллилитр.Аккуратно перемешать и инкубировать в течение 2 1/2 минут при комнатной температуре. Топ образцов с примерно двумя миллилитров разделения буфера до трех миллилитров, место пятими миллилитров труб в восьмикамерный легкое разделение магнита, и инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем наконечник магнит вперед, и пипетка каждой ячейки подвески в чистой пятими миллилитровой трубки.Добавьте 1,5 миллилитров RPMI без сыворотки в каждую трубку и центрифугу. Слейте супернатант, и resuspend CD4-положительных Т-клеток гранулы на 10 миллионов клеток на миллилитр в сыворотке свободной RPMI. Чтобы начать эту часть протокола, определите количество вставок Transwell, необходимых для эксперимента как для ILC2, так и для CD4-положительных Т-клеток, описанных в рукописи.Аккуратно переместите трехмирновые вставки Transwell из средних рядов пластины из 24 к началу и нижним рядам той же 24-хорошой пластины с наконечником пипетки и руками в перчатках. Добавьте 500 микролитров миграционных средств массовой информации с CCL17 до 1/3 скважин в среднем ряду пластины из 24 скважин. Добавьте 500 микролитров миграционных средств массовой информации с CCL22 к другим 1/3 скважин.И, наконец, добавить 500 микролитров сыворотки без RPMI, не содержащие хемокина в последние 1/3 скважин. Этикетка крышки на пластине четко с именем соответствующих трансмиграционных средств массовой информации, размещенных в нижних скважинах. Затем поместите Transwell вставки обратно в скважины, содержащие различные процедуры.Аккуратно добавьте 100 микролитров клеток CD4 T или ILC2 в верхний колодец каждой вставки, убедившись, что не смешивать или пипетки клеточной подвески вверх и вниз в Transwells. Этикетка крышку на пластине четко с типом ячейки размещены в каждой хорошо, и написать дату и время суток, что клетки были добавлены. Повторите этот процесс, начиная с удаления вставок Transwell с пластины до тех пор, пока все ячейки не будут помещены в вставки Transwell со средствами массовой информации.После того, как клетки, представляющие интерес изолированы, наиболее важными шагами являются отслеживание хемокинов и типов клеток, которые помещаются в определенные скважины, чтобы аккуратно добавить клетки в верхние камеры, и, наконец, чтобы избежать ненужного контакта с трансмиграционными пластинами во время 48-часовой инкубации. Аккуратно поместите пластину в 37-градусный инкубатор по Цельсию с 5%-ным углекислым газом и инкубировать в течение 48 часов, убедившись, что свести к минимуму контакт с пластиной в течение инкубации периода. После аккуратного удаления пластины из инкубатора, удалите все вставки Transwell из средних рядов в пустые колодцы чуть выше или ниже.Соберите ячейки из верхних и нижних колодцев Transwell вставки в трубки помечены сверху или снизу с CCL17, CCL22, или средств массовой информации, с типом ячейки, и с номером репликации. Промыть нижние скважины 500 микролитров 1x PBS, собрать его в соответствующие трубы, и сделать то же самое для верхних скважин. Центрифуга труб при 378 г при комнатной температуре в течение пяти минут.Используйте пипетку, чтобы аккуратно удалить все супернатанты, а затем повторно использовать T ячейки и ILC2 гранулы с 50 микролитров 1x PBS. После удаления 10 микролитров клеточной подвески добавьте 90 микролитров 0,4%трипан синего цвета. Подсчитайте ячейки на автоматизированном счетчике ячеек.И для каждого образца, рекордный процент жизнеспособности и количества клеток на миллилитр, и определить общее количество клеток на лечение в верхней и нижней камере. Когда выражение CCR4 оценивалось как на CD4-положительных Т-клетках, так и на ILC2 по цитометрии потока, не было никаких различий между мужскими и женскими хозяевами. Однако экспрессия CCR4 на клеточной основе на ILC2 была выше по сравнению с CD4-положительными Т-клетками.Когда нижняя камера аппарата Transwell была заполнена необработанными средствами массовой информации культуры клеток, средствами массовой информации, содержащими CCL22, или средствами массовой информации, содержащими CCL17, менее 14% ячеек мигрировали в условиях контроля мультимедиа. В ответ на CCL22, оба типа клеток, независимо от того, были ли они от мужчин или женщин хозяев, ответил на CCL22. Кроме того, CCL22 индуцированных большую миграцию, чем CCL17 в мужской ILC2.С другой стороны, CCL17 индуцированных значительную миграцию женских клеток CD4 T и ILC2 по сравнению со средствами массовой информации в одиночку. Лечение CCL17 не отличалось от средств массовой информации для мужских CD4-положительных Т-клеток или мужского ILC2. В неоптимальных условиях, когда пластина с клетками CD4 оставалась при комнатной температуре в течение первых 24 часов, а затем перемещалась в инкубатор, не было никакой миграции в сторону CCL22 и CCL17.Кроме того, жизнеспособность клеток была особенно низкой для клеток в нижней камере, показывая важность использования правильных температур и условий, описанных в этом протоколе для достижения оптимальных результатов. Как только процедура трансмиграции будет завершена, следует увидеть значительную миграцию в химиокин, представляющий интерес по сравнению с скважинами контроля над средствами массовой информации. Если не наблюдается существенной миграции, можно предположить, что процедура не работает должным образом или что лимфоциты не реагируют на хемокин в вопросе.Этот метод может быть широко использован для понимания миграции лимфоцитов, когда эти лимфоциты прошли широкий спектр инво лечения.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Человеческий Т-лимфоцитов изоляции, культуры и анализ миграции In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Неинвазивная Визуализация лейкоцитов самонаведения и миграции В естественных условиях</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Количественная оценка миграции нейтрофилов человека во культурный мочевого эпителия

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Оценка Врожденная зондирование инфицированных ВИЧ-1 CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток плазмоцитов дендритных клеток с помощью<em&gt; Экс естественных</em&gt; Совместное культивирование системы.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

<em&gt; Экс естественных</em&gt; Модель олигодендроцит-направленного Т-клеток Атака в острых мозга Ломтики

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Лимфоцит Изоляция из человеческой кожи для фенотипического анализа и<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Культура клеток

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Isolation and Ex Vivo Culture of VÃƒÅ½Ã‚Â´1+CD4+ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells, an Extrathymic ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â²T-cell Progenitor

Выделение и<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Культура Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ Т-клеток, А.Н. Extrathymic αβT-клеток-предшественников

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Поток Cytometric Анализ связанного с твердыми частицами Bet v 1 аллергена в PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Мышиные лимфоцит Этикетировочное по<sup&gt; 64</sup&gt; Си-антитело к рецептору Ориентация на<em&gt; В Vivo</em&gt; Cell Торговля ПЭТ / КТ

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...