Name: assessment of lymphocyte migration in an ex vivo transmigration system
Uploaded: 2019-09-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System at JoVE.com

Detta arbete finansierades av American lung Association (K.J.W.), minnesmärket Eugene Kenney Fund tilldelas T.A.W. och K.J.W., generösa start-up stöd från University of Utah för K.J.W., och en avdelning för Veterans Affairs Award till T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. är mottagare av en forskarkarriär Scientist Award (IK6 BX003781) från Department of Veterans Affairs. Författarna vill erkänna redaktionellt stöd från MS Lisa Chudomelka. Författarna tackar UNMC Flow flödescytometrianalys Core för deras stöd för att samla in flödet flödescytometrianalys data som genereras för detta manuskript.

Alla metoder som beskrivs här granskades och godkändes av den institutionella djuromsorg och använda kommittéer vid University of Nebraska Medical Center (UNMC) och University of Utah.
1. inställning och beredning av reagenser
<ol><li>
Förbered komplett RPMI (Roswell Park Memorial Institute) media.
	<ol>
<li>Tillsätt 10 mL värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS) till 90 mL RPMI.</li>
		<li>Tillsätt 1 mL 100x penicillin-streptomycin-glutamin till 100 mL 10% FBS RP...

<ol>
	<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Moser, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+History+of+Chemoattractant+Research.">Editorial: History of Chemoattractant Research.</a> Frontiers in Immunology. 6, 548 (2015).</li><li>Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+sound+the+alarmin:+The+role+of+atypical+chemokine+in+inflammation+and+cancer.">Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer.</a> Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).</li><li>Charo, I. F., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+roles+of+chemokines+and+chemokine+receptors+in+inflammation.">The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation.</a> The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).</li><li>Abboud, D., Hanson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+neutralization+as+an+innovative+therapeutic+strategy+for+atopic+dermatitis.">Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis.</a> Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).</li><li>Aldinucci, D., Casagrande, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+CCL5/CCR5+Axis+against+the+Progression+of+Gastric+Cancer.">Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477 (2018).</li><li>Chonco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+DNA+Aptamers+Against+CCL21+Protein:+Characterization+and+Biomedical+Applications+for+Targeted+Drug+Delivery+to+T+Cell-Rich+Zones.">Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones.</a> Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).</li><li>Trivedi, P. J., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+Chemokine+Receptors+as+Therapeutic+Targets+in+Inflammatory+Bowel+Disease;+Pitfalls+and+Promise.">Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise.</a> Journal of Crohn's and Colitis. 12 (12), 1508 (2018).</li><li>Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+of+chemotaxis+as+a+window+into+mechanisms+of+toxicant-induced+immunomodulation.">In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation.</a> Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).</li><li>Davis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+studying+the+immune+system+leads+us+to+new+medicines.">How studying the immune system leads us to new medicines.</a> Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).</li><li>Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+chemokine+expression+following+respiratory+virus+infection+reflects+Th1-+or+Th2-biased+immunopathology.">Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology.</a> Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).</li><li>Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+chemokines+CCL2+and+CXCL10+by+matrix+metalloproteinases-2+and+-9:+implications+for+chemotaxis.">Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis.</a> Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).</li><li>Burrell, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+Node+Stromal+Fiber+ER-TR7+Modulates+CD4++T+Cell+Lymph+Node+Trafficking+and+Transplant+Tolerance.">Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance.</a> Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).</li><li>Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminins+affect+T+cell+trafficking+and+allograft+fate.">Laminins affect T cell trafficking and allograft fate.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).</li><li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th2+cell+differentiation+from+naive+CD4(+)+T+cells+is+enhanced+by+autocrine+CC+chemokines+in+atopic+diseases.">Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases.</a> Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).</li><li>Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Arrestin-2-Dependent+Signaling+Promotes+CCR4-mediated+Chemotaxis+of+Murine+T-Helper+Type+2+Cells.">beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+antagonist+for+CCR4+attenuates+allergic+lung+inflammation+in+a+mouse+model+of+asthma.">A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma.</a> Science Reports. 7 (1), 15038 (2017).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+helper+CD4+T+cells+during+acute+and+stable+allergic+asthma.">Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma.</a> Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).</li><li>Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Group+2+Innate+Lymphoid+Cells+in+Allergic+Airway+Inflammation+Models+in+the+Mouse.">Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse.</a> Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).</li><li>Li, B. W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group+2+Innate+Lymphoid+Cells+Exhibit+a+Dynamic+Phenotype+in+Allergic+Airway+Inflammation.">Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1684 (2017).</li><li>Warren, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+differences+in+activation+of+lung-related+type-2+innate+lymphoid+cells+in+experimental+asthma.">Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma.</a> Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).</li><li>Warren, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovalbumin-sensitized+mice+have+altered+airway+inflammation+to+agriculture+organic+dust.">Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust.</a> Respiratory Research. 20 (1), 51 (2019).</li><li>Poole, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphabeta+T+cells+and+a+mixed+Th1/Th17+response+are+important+in+organic+dust-induced+airway+disease.">alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease.</a> Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).</li><li>Matsuo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CCR4+antagonist+ameliorates+atopic+dermatitis-like+skin+lesions+induced+by+dibutyl+phthalate+and+a+hydrogel+patch+containing+ovalbumin.">A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin.</a> Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).</li><li>Mikhak, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+CCR4+and+CCR8+to+antigen-specific+T(H)2+cell+trafficking+in+allergic+pulmonary+inflammation.">Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).</li><li>Monticelli, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells+promote+lung-tissue+homeostasis+after+infection+with+influenza+virus.">Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus.</a> Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).</li><li>Saenz, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL25+elicits+a+multipotent+progenitor+cell+population+that+promotes+T(H)2+cytokine+responses.">IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses.</a> Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).</li><li>Hoyler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+GATA-3+controls+cell+fate+and+maintenance+of+type+2+innate+lymphoid+cells.">The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells.</a> Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).</li><li>Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+cytokine+receptor+gamma+chain+plays+an+essential+role+in+regulating+lymphoid+homeostasis.">The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).</li><li>Warren, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSV-specific+anti-viral+immunity+is+disrupted+by+chronic+ethanol+consumption.">RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption.</a> Alcohol. , (2016).</li><li>Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+association+between+MMP-9+and+impaired+T+cell+migration+in+ethanol-fed+BALB/c+mice+infected+with+Respiratory+Syncytial+Virus-2A.">An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A.</a> Alcohol. , (2018).</li><li>Molteni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+device+to+concurrently+assess+leukocyte+extravasation+and+interstitial+migration+within+a+defined+3D+environment.">A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment.</a> Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).</li><li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+in+vitro+3D+co-culture+model+to+engineer+vascularized+bone-mimicking+tissues+combining+computational+tools+and+statistical+experimental+approach.">Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach.</a> Biomaterials. 76, 157-172 (2016).</li><li>Jeon, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+3D+vascularized+organotypic+microfluidic+assays+to+study+breast+cancer+cell+extravasation.">Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).</li></ol>

Häri presenterar vi en väl etablerad metod för att bedöma Chemokine-inducerad migration av lymfocyter i ett ex vivo transmigration system. Det finns flera kritiska steg i protokollet, varav den första är att kontrollera uttrycket av rätt Chemokine receptor på immuncellerna i experimentet. I våra händer valde vi CCR4 på grund av kroppen av litteratur som belyser vikten av CCR4 på Th2 helper T-celler i allergisk inflammation. Ovalbumin-inducerad inflammation visades tidigare att begränsas av minst två CCR4-an...

Denna ursprungliga transmigration metod presenterades av Stephen Boyden i 1962 i Journal of experimental Medicine1. Mycket av vad vi vet om chemotaxis och chemokinetics skulle inte vara möjligt utan utvecklingen av Boyden kammaren. Före upptäckten av den första Chemokine i 1977, ex vivo transmigration system användes för att lära sig om serum-faktorer som kan gripa cellulära rörligheten i makrofager samtidigt förstärka cellulära motilitet i neutrofiler1,2. En massiv rikedom av kunskap har utvecklats när det gäller immun cell migration, och hittills har 47 chemokiner nu upptäckts med 19 motsvarande receptorer3,4. Dessutom, mängder av hämmare/förstärkare av dessa Chemokine vägar har genomgått utveckling för terapeutiska ändamål5,6,7,8. Många av dessa föreningar har testats i liknande transmigration kammare för att förstå direkt interaktion mellan föreningarna och immuncellernas reaktionsförmåga till en given Chemokine9.
Transmigration, eller diapedesis, till inflammerad vävnad är en viktig process för att en hälsosam inflammatorisk reaktion på klar infektion10,11. En Boyden kammare, transmigration system, eller transwell apparater är i allmänhet består av två kammare åtskilda av ett poröst membran1,12. Botten kammaren oftast innehar media som innehåller Chemokine av intresse, medan leukocyter placeras i den övre kammaren. Storleken på pore i membranet kan väljas baserat på storleken på den cell av intresse. För detta projekt valde vi ett 3 μm poröst membran, eftersom lymfoida celler är 7-20 μm i storlek, beroende på stadiet av cellulära utveckling. Denna porstorlek säkerställer att dessa celler inte passivt faller genom porerna, men att de aktivt migrerar som svar på Chemokine lutning.
Den stora fördelen med detta protokoll är dess kostnadseffektivitet. In vivo transmigration är svårt eftersom det kräver omfattande utbildning i djurhantering och kirurgi, och ofta innebär hög driven mikroskopi som inte alltid är tillgänglig för en forskare. Kostnadseffektiv screening av föreningar som tros förbättra eller hämma transmigration kan åstadkommas i förväg av in vivo Imaging. Eftersom transmigration systemet är tätt kontrollerad, celler kan behandlas initialt sedan läggas till transwell apparaten, eller vice versa, Chemokine kan behandlas först med en Chemokine hämmare sedan celler läggas till transwell apparaten. Slutligen, endotelceller och/eller basalmembran proteiner kan läggas till botten av transwell infoga 1-2 dagar före transmigration experimentet att förstå inblandning av dessa barriär celler i chemokinetics. Återigen, dessa manipulationer av systemet ger ett kraftfullt sätt att fastställa viktig information om effektiviteten av en given förening i förväg av mer komplicerade in vivo studier.
Att använda ett transmigrations kammar system är ett effektivt sätt att bedöma lymfocytrörligheten under olika in vivo-och in vitro-villkor12,13,14. Häri, beskriver vi en optimerad metod för att bedöma ex vivo lymfocytreaktionsförmåga till chemokiner i en transmigration kammare. I detta exempel experiment, CD4+ T-celler och grupp 2 medfödda lymfoida celler (ILC2) isolerades från manliga och kvinnliga, Balb/c möss efter OVA-allergen exponering. En hypotes genererades att CCR4+ CD45+ Lineage-(LIN-) ILC2 från allergen-utmanade möss skulle MIGRERA mer effektivt mot CCL17 och CCL22 än CCR4+ CD4+ T Helper celler. CCL17 och CCL22 är chemokines vanligen produceras av dendritiska celler och makrofager av m2 (allergisk) fenotyp, bland andra celler, i allergi15,16. CCL17 och CCL22 kan betraktas som biomarkörer för allergisk inflammation eftersom de lätt upptäcks i lungorna under luftvägarna exacerbationer16,17,18. Viktigt, CCR4 uttrycket är förhöjd i jämförelse med obehandlade kontroller, som avslöjas i bioinformatiska data som genereras från ILC2 isolerade från hus dammkvalster behandlade djur, och likaså ILC2 från naiva djur behandlade ex vivo med IL-33 ( allergen-främja medfödda cytokin) uppreglerar CCR419,20. Dessutom, enligt uppgifter för ILC2 i den immunologiska genomprojektet databas (www.immgen.org), CCR4 mRNA är starkt uttryckt i dessa medfödda immunceller. Hittills är lite känt om handel med ILC2 i vävnader, men det är troligt att ILC2 och CD4+ T-celler använder liknande chemokines och receptorer för chemotaxis och chemokinetics som de uttrycker liknande transkriptionsfaktorer och receptorer. Således jämförde vi CCL17 kontra CCL22 lyhördhet, av ILC2 och CD4+ T-lymfocyter, från både manliga och kvinnliga, OVA-utmanade djur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15250061</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>329424</td>
			<td>U-100 Syringes Micro-Fine 28G 1/2&#34; 1cc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td>Dilute to 1x in RPMI media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td>polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 um transwell inserts</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-288</td>
			<td>24-well plate containing 12 transwell inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3x stabilizing fixative</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>338036</td>
			<td>Prepare 1x solution according to manufacturers protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene tubes</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>38007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-106</td>
			<td>polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-chamber easy separation magnet</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>18103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>A1049201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced cell strainer, 40 um</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-375</td>
			<td>nylon mesh, 40 micron strainers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Hydroxide, Reagent Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239186-25G</td>
			<td>20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- mouse CCR4; APC-conjugated</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>131211</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>557396</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11c; PE eFluor 610</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>61-0114-82</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD16/32, Fc block</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553141</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>47-0193-82</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>552774</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD45; PE conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>56087</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse ICOS (CD278)</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>564070</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553164</td>
			<td>0.25 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>145311</td>
			<td>0.5 ug/test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1450102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Dissociator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td>0.5% in serum-free RPMI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter Clides</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1450015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Egg Ovalbumin, Grade V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5503-10G</td>
			<td>500 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1, Filtered</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216)</td>
			<td>25 U/mL in RPMI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compensation beads</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>01-1111-41</td>
			<td>1 drop per contol tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation Tubes</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-335</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>554657</td>
			<td>1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated-FBS</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-525H</td>
			<td>10% in complete RPMI &#38; ILC2 Expansion Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CCL17</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02954-20</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CCL22</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02856-20</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CD4+ T cell enrichment kit</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>19852</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse IL-2</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z02764-20</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse ILC2 enrichment kit</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>19842</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse recombinant IL-33</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>78044</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>22400071</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation Buffer</td>
			<td>STEM Cell Technologies</td>
			<td>20144</td>
			<td>1 X PBS + 2% FBS; stored at 4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small animal nebulizer and chamber</td>
			<td>Data Sciences International</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7124; NDC 0338-0048-04</td>
			<td>0.9% Sodium Chloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of lymphocyte migration in an ex vivo transmigration system

Häri presenterar vi en effektiv metod som kan utföras med grundläggande laboratorie kunskaper och material för att bedöma lymfocytkemokinetiska rörelser i ett transmigrations system ex vivo. Grupp 2 medfödda lymfoida celler (ILC2) och CD4+ T Helper celler isolerades från mjälte och lungor av kyckling ägg äggalbumin (ova)-ifrågasatte Balb/c möss. Vi bekräftade uttrycket av CCR4 på både CD4+ T-celler och ILC2, jämförelsevis. CCL17 och CCL22 är de kända liganderna för CCR4; Därför, med hjälp av denna ex vivo transmigration metod undersökte vi CCL17- och CCL22-inducerad förflyttning av CCR4+ lymfocyter. För att fastställa Chemokine gradienter, CCL17 och CCL22 placerades i botten kammaren av transmigration systemet. Isolerade lymfocyter lades sedan till översta kamrarna och över en 48 h period lymfocyter aktivt migreras genom 3 μm porer mot Chemokine i botten kammaren. Detta är ett effektivt system för bestämning av chemokinetik av lymfocyter, men, förståeligt, inte efterlikna de komplikationer som finns i in vivo organ mikromiljöer. Detta är en begränsning av den metod som kan övervinnas genom tillsats av in situ-avbildning av det organ och de lymfocyter som studeras. Fördelen med denna metod är däremot att den kan utföras av en tekniker på ingångsnivå med en mycket mer kostnadseffektiv hastighet än Live Imaging. Som terapeutiska föreningar blir tillgängliga för att förbättra migration, som i fallet med tumör infiltrerande cytotoxiska immunceller, eller att hämma migration, kanske i fallet med autoimmuna sjukdomar där immunopatologi är oroande, denna metod kan användas som en screening verktyg. I allmänhet är metoden effektiv om Chemokine av intresse konsekvent genererar chemokinetics på en statistiskt högre nivå än Media kontroll. I sådana fall kan graden av hämning/förbättring av en viss förening bestämmas också.

CCR4 uttryck på CD4 + T-celler och ILC2.
För att lyckas med ex vivo transmigration experiment, är det absolut nödvändigt att avgöra om lymfocyterna är mottagliga för CCL17 och CCL22 genom CCR4; Därför bestämde vi CCR4 uttryck på både CD4+ T-celler och ILC2 av flödescytometri. Även om det är väl känt att OVA-specifika CD4+ helper T-celler Express CCR4, mindre är känt för uttrycket av CCR4 på ILC2. Figur 1...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System at JoVE.com

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

I detta protokoll är lymfocyter placeras i den övre kammaren i ett transmigration system, separerade från botten kammaren av ett poröst membran. Chemokine läggs till botten kammaren, som inducerar aktiv migration längs en Chemokine lutning. Efter 48 h räknas lymfocyter i båda kamrarna för att kvantifiera transmigration.

Bedömning av Lymfocytmigration i ett transmigrations system ex vivo

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Lymfocyt transmigration är ett viktigt inslag i alla immunsvar. Därför är detta protokoll betydande eftersom det gör det möjligt för en forskare att bedöma rörligheten av lymfocyter i ett väldefinierat in vitro-system. Den största fördelen med denna teknik är att olika kemokiner kan bedömas för att bestämma deras effektivitet att inducera migration i nyligen definierade celler, såsom gruppen två medfödda lymfoida celler, eller ILC2.En andra fördel är att hämmare eller biologiska terapier som syftar till att blockera vissa chemokine vägar kan testas med denna metod innan du gör dyrare experiment med djur. Börja med att excising lungor och mjälte från avlivade äggbehandlade han- och honmöss med två till tre djur per grupp. Placera strukna vävnader i separata dissociationsrör enligt vävnadstyp och djurs kön.Placera lungvävnaden i 500 mikroliter av lunga dissociation media i en dissociation rör, placera röret i den automatiserade vävnad dissociator, och dissociate den med hjälp av lungprotokollet. Upprepa dessa steg för totalt två gånger. För att dissociera mjältevävnad, placera den i 500 mikroliter av kompletta RPMI-media i dissociator, och använd sedan mjältprotokollet.Arbeta i ett biologiskt säkerhetsskåp med steril teknik från och med nu, filtrera varje dissocierad vävnad genom en 40-mikrometer cell sil, och samla in i 50-milliliter koniska rör. Skölj dissociationsrören som innehåller lunghomogenater med fem milliliter av ytterligare lung-dissociationsmedia, rör som innehåller mjälte homogenater med fem milliliter komplett RPMI, och filtrera deras innehåll genom de filter som används för deras motsvarande vävnader. För att ytterligare dissociera lungvävnad, inkubera lung homogenater i 15 till 30 minuter i en 37-graders Celsius inkubator med 5%koldioxid.Tillsätt sedan fem milliliter av komplett RPMI till både lungan och mjälten homogenates, och centrifug. Efter att supernatanten kastats överbord, kombinera de pellets som innehåller splenocyter och lungceller från gruppen av djur av samma kön till ett enda koniskt rör på 50 milliliter. Tillsätt 10 milliliter av komplett RPMI till varje rör, och återanvänd.Bestäm totalt antal celler med hjälp av en automatiserad cellräknare. Justera manliga och kvinnliga cell suspensioner till 100 miljoner celler per milliliter i separation buffert, och sedan lägga till en fem-milliliter polystyren rör. Efter att isolera grupp två medfödda lymfoida celler från 2/3 av de totala cellerna som beskrivs i manuskriptet, använd de återstående cellerna för CD4-positiva T cell isolering förfarande.För att starta CD4-positiv T-cellisolering, tillsätt råttserum till CD4 T-cellens anrikningsupphängning. Tillsätt sedan isolering cocktail till cellprovet, och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. Vortex snabba sfärer i 30 sekunder, och lägg till cellprovet för att uppnå en utspädning av 75 mikroliter per milliliter.Blanda försiktigt, och inkubera i 2 1/2 minuter i rumstemperatur. Toppa proverna med cirka två milliliter separationsbuffert upp till tre milliliter, placera fem-milliliterrören i åttakammars separationsmagneten och inkubera i fem minuter i rumstemperatur. Tippa sedan magneten framåt och pipettera varje cellupphängning i ett rent fem-milliliterrör.Tillsätt 1,5 milliliter serumfritt RPMI till varje rör, och centrifug. Häll av supernatanten och resuspend cd4-positiva T cell pellet på 10 miljoner celler per milliliter i serum-free RPMI. För att börja denna del av protokollet, bestämma antalet Transwell skär som behövs för experimentet för både ILC2 och CD4-positiva T-celler som beskrivs i manuskriptet.Flytta försiktigt tre-micron Transwell skär från mitten raderna i en 24-väl platta till toppen och nedre rader av samma 24-väl platta med en pipett spets och handskar händer. Lägg till 500 mikroliter av migrationsmedia med CCL17 till 1/3 av brunnarna i mittenraden på 24-brunnsplattan. Lägg till 500 mikroliter av migrationsmedia med CCL22 till en annan 1/3 av brunnarna.Och slutligen, tillsätt 500 mikroliter av serumfria RPMI som innehåller ingen chemokine till den sista 1/3 av brunnarna. Märk locket på plattan tydligt med namnet på lämpligt transmigrationsmedia som placeras i bottenvälnarna. Placera sedan Transwell-skären tillbaka i brunnarna som innehåller de olika behandlingarna.Tillsätt försiktigt 100 mikroliter av CD4 T-celler eller ILC2 till toppbrunnarna i varje skär, se till att inte blanda eller pipettera cellupphängningen upp och ner i Transwells. Märk locket på plattan tydligt med celltypen som placeras i varje brunn, och skriv det datum och den tid på dagen som cellerna lades till. Upprepa denna process med början från att transwellskären tas bort från plattan tills alla celler har placerats i Transwell-skär med media.När väl de celler av intresse är isolerade, de viktigaste stegen är att hålla reda på de cellgifter och celltyper som placeras i synnerhet brunnar, att försiktigt lägga till celler till de översta kamrarna, och slutligen för att undvika onödig kontakt med transmigration plattan under 48-timmars inkubation. Placera försiktigt plattan i en 37-graders Celsius inkubator med 5%koldioxid, och inkubera i 48 timmar, se till att minimera kontakten med plattan över inkubationstiden. Efter att försiktigt ha tagit bort plattan från inkubatorn, avlägsna alla Transwell-skär från de mellersta raderna i de tomma brunnarna strax ovanför eller nedanför.Samla in cellerna från transwell-skärens övre och nedre brunnar i rör som är märkta med över- eller undersida med CCL17, CCL22 eller media, med celltypen och med replikatnumret. Skölj botten brunnarna med 500 mikroliter av 1x PBS, samla in den i motsvarande rör, och gör samma sak för toppen brunnar. Centrifugera rören vid 378 gånger g vid rumstemperatur i fem minuter.Använd en pipett för att försiktigt ta bort alla supernatant, och sedan resuspend T cell och ILC2 pellets med 50 mikroliter av 1x PBS. Efter att ha tagit bort 10 mikroliter av cellen suspension, tillsätt 90 mikroliter av 0,4%trypan blå. Räkna cellerna på den automatiserade cellräknaren.Och för varje prov, registrera andelen av livskraft och cellantal per milliliter, och bestämma det totala antalet celler per behandling i toppen och den nedre kammaren. När CCR4 uttryck bedömdes på både CD4-positiva T-celler och ILC2 av flöde cytometry, fanns det inga skillnader mellan manliga och kvinnliga värdar. Uttrycket av CCR4 på per-cell basis på ILC2 var dock högre i jämförelse med CD4-positiva T-celler.När den nedre kammaren i Transwell apparaten var fylld med obehandlad cellkultur media, media som innehåller CCL22, eller medier som innehåller CCL17, mindre än 14%av cellerna migreras i media kontrollförhållanden. Som svar på CCL22 svarade båda celltyperna, oavsett om de var från manliga eller kvinnliga värdar, till CCL22. Även CCL22 inducerad större migration än CCL17 i manliga ILC2.Å andra sidan inducerade CCL17 betydande migration av de kvinnliga CD4 T-cellerna och ILC2 jämfört med media ensam. CCL17 behandling var inte annorlunda än media för manliga CD4-positiva T-celler eller manliga ILC2. Under suboptimala förhållanden, när plattan med CD4-celler förblev vid rumstemperatur under de första 24 timmarna och sedan flyttade in i inkubatorn, fanns det ingen migration mot CCL22 och CCL17.Vidare var cellernas livskraft betydligt låg för cellerna i den nedersta kammaren, vilket visar vikten av att använda de korrekta temperaturer och förhållanden som beskrivs i detta protokoll för att uppnå optimala resultat. När transmigrationsförfarandet är avslutat bör man se betydande migration till chemokine av intresse i jämförelse med media kontroll brunnar. Om det inte finns betydande migration sett, kan man anta att förfarandet inte fungerade korrekt eller att lymfocyterna inte är lyhörda för chemokine i fråga.Denna teknik kan användas i stort sett för att förstå lymfocyt migration när dessa lymfocyter har genomgått ett brett spektrum av in vivo behandlingar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Humana T-lymfocyter Isolering, Kultur och analys av migration In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Icke-invasiv avbildning av Leukocyt Homing och migration In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Kvantitativ bedömning av Human neutrofilmigrationen över en Odlade blåsans epitel

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Bedömning av Innate Sensing av HIV-1 infekterade CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler från Plasmacytoid dendritiska celler med en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Samodlingssystemet.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modell av en Oligodendrocyte styrt T-Cell Attack i akut hjärnan skivor

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymfocytisolering från human hud för fenotypisk analys och<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Isolation and Ex Vivo Culture of VÃƒÅ½Ã‚Â´1+CD4+ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells, an Extrathymic ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â²T-cell Progenitor

Isolering och<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T-celler, en Extrathymic αβT-cellstamfader

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flödescytometrisk analys av partikelbundna Bet v 1 Allergen i PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murina Lymfocyt Märkning av<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-antikroppreceptor Targeting för<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Trafficking med PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...