Name: targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)
Uploaded: 2019-09-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل جزئيا مؤسسة جامعة تسينغهوا - غيتس (لا. OPP1021992)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 21502103 و 21877068 و041301475)، والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (رقم 2017YFA0505103).

1- التركيب الكيميائي لمشتق الهيدرازين لببتيد Fc-III
<ol><li>تحويل 2-Cl-(Trt)-Cl الراتنج إلى 2-Cl-(Trt)-NHNH2 الراتنج
	<ol>
<li>وزن 625 ملغ من 2-Cl-(Trt)-Cl الراتنج (0.25 ملمول) في وعاء توليف الببتيد 25 مل.</li>
		<li>إضافة 5 مل من N، N-dimethylformamide (DMF) إلى الراتنج من الجزء العلوي من السفينة، ووضع الغطاء مرة أخرى، يهز بلط?...

<ol>
	<li>Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Physiology (4th ed.). , (2003).</li><li>Halstead, S. B., O&#8217;Rourke, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-enhanced+dengue+virus+infection+in+primate+leukocytes.">Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes.</a> Nature. 265, 739-741 (1977).</li><li>Gammon, G., Sercarz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+some+T+cells+escape+tolerance+induction.">How some T cells escape tolerance induction.</a> Nature. 342, 183-185 (1989).</li><li>Takada, A., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-dependent+enhancement+of+viral+infection:+molecular+mechanisms+and+in+vivo+implications.">Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications.</a> Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).</li><li>Boonnak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Dendritic+Cells+in+Antibody-Dependent+Enhancement+of+Dengue+Virus+Infection.">Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection.</a> Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).</li><li>Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis+-+autoantibody+characteristics+and+their+implications+for+therapy.">Myasthenia gravis - autoantibody characteristics and their implications for therapy.</a> Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).</li><li>Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis:+past,+present,+and+future.">Myasthenia gravis: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).</li><li>Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+a+dengue+vaccine.">Progress towards a dengue vaccine.</a> The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).</li><li>Vikas, K., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+Myasthenia+Gravis.">Treatment of Myasthenia Gravis.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+dual-functional+conjugate+of+antigenic+peptide+and+Fc-III+mimetics+(DCAF)+for+targeted+antibody+blocking.">Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking.</a> Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).</li><li>Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+taylor-aris+dispersion+for+measurement+of+a+solute+diffusion+coefficient+in+thin+capillaries.">Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries.</a> Science. 266, 773-776 (1994).</li><li>Fang, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+chemical+synthesis+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).</li><li>Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+chemical+synthesis+of+proteins+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).</li><li>Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+proteins+using+peptide+hydrazides+as+thioester+surrogates.">Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates.</a> Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).</li></ol>

يصف البروتوكول هنا شبه التوليف والكشف عن DCAF1 باستخدام نهج NCL، والذي يظهر في الشكل 1. وباختصار، فإن جزتي اللجنة الثانية للقوات المسلحة هي أجزاء كيميائية مركبة ومعبر عنها بصورة مُدمجة، على التوالي؛ ثم، يتم تجميع جزيء DCAF1 طول كامل، وتعديلها وتنقيتها. بالنسبة لتوليف جزء Fc-III الم...

الأجسام المضادة تلعب أدوارا هامة في الاستجابة المناعية الفكاهية لتحييد البكتيريا المسببة للأمراض والفيروسات1. ومع ذلك، فإن بعض الأجسام المضادة تظهر آثار ضارة على الكائنات الحية، مثل الأجسام المضادة عبر رد الفعل في تأثير ADE أثناء عدوى DENV والأجسام المضادة المفرطة في رد الفعل في الوهن العضلي الوبيل، وهو أمراض المناعة الذاتية2،3. يتم التوسط تأثير ADE من قبل الأجسام المضادة عبر رد الفعل التي تجعل الجسر لربط DENV ومستقبلات Fc تقديم الخلايا4,5, في حين أن الوهن العضلي الوبيل هو سبب الأجسام المضادة المفرطة التي تهاجم مستقبلات أستيل بين تقاطعات الخلايا في أنسجة العضلات6،7. على الرغم من أنه تم وضع نُهج فعالة جزئياً لعلاج هذه الأمراض8و9،فإن القضاء المباشر على هذه الأجسام المضادة الضارة من شأنه أن يحرز تقدماً في التدخلات.
في الآونة الأخيرة، تم تطوير جزيئات DCAF، التي لديها مجموعات مزدوجة الوظائف، لحجب الأجسام المضادة المستهدفة10. DCAF هو الببتيد الطويل الذي يتكون من 3 أجزاء: 1) جزء مستضد التي يمكن أن تعترف محددة الأجسام المضادة كونيات، 2) علامة Fc-III أو Fc-III-4C لربط بقوة إلى منطقة Fc من الأجسام المضادة لمنع مستقبلات Fc أو تكملة البروتينات المكون ، 3) وصلة طويلة α-حلزونية التي تترافق بين هاتين المجموعتين الوظيفيتين10. تم تحسين جزء الرابط، الذي تم تصميمه من مجال Moesin FERM، من قبل برنامج Rosseta لضمان الجزء مستضد وجزء Fc-III في جزيء DCAF يمكن ربط إلى مناطق Fab وFc من IgG في وقت واحد. وقد تم تصنيع أربعة جزيئات من قوات جنيف للرقابة الديمقراطية على الرقابة على المواد النارية لاستهداف 4 أجسام مضادة مختلفة، من بينها استخدام DCAF1 للقضاء على الأجسام المضادة 4G2، وهو جسم مضاد عبر رد الفعل أثناء عدوى DENV للمساهمة في تأثير ADE. وتم تصميم DACF4 لإنقاذ مستقبلات أستيل عن طريق منع ماب35 الأجسام المضادة في الوهن العضلي الوبيل10.
في هذه الدراسة، التي أخذت DCAF1 على سبيل المثال، أظهرنا بروتوكولات لتركيب جزيء DCAF والكشف عن التفاعل بين مركز جنيف للرقابة الديمقراطية على القوات المسلحة وجسمه المضاد للكونيات. وDCAF1 هو شبه توليفها من قبل نهج NCL11،12،13،14، الذي يترافق مشتق الهيدرازين من الببتيد Fc-III وأجزاء مستضد الرابط أعرب معا. وللنهج الذي تتبعه اللجنة مزايا كبيرة على التركيب الكيميائي الكامل والتعبير المؤتلف بالكامل لتوليف مركز جنيف للرقابة الديمقراطية على الفي مكاف، لأن هاتين الطريقتين تؤديان إلى انخفاض الغلة وارتفاع التكلفة. النهج الحالي ليس فقط الطريقة الأكثر فعالية من حيث التكلفة للحصول على مركز جنيف للرقابة الديمقراطية على القوات المسلحة، ولكن أيضا يمكن الحفاظ على مطابقة جزء الرابط مماثلة لشكله الأصلي. وبما أن جزيئات مركز جنيف للرقابة الديمقراطية على القوات المسلحة المختلفة لها تسلسلات مماثلة باستثناء أجزاء المستضد، فإن أساليبنا لتوليف DCAF1 والفحص التفاعلي بين DCAF1 و4G2 يمكن تطبيقها على جزيئات DCAF الأخرى لمنع أجسامها المضادة من الكونات أيضاً.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Chlorotrityl resin</td>
			<td>Tianjin Nankai HECHENG S&#38;T</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>503236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4G2 antibody</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MA5-24387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-mercaptophenylacetic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>H27658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plates</td>
			<td>NEST</td>
			<td>701001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A955</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgOAc</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30164324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GST antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>AE001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076P2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis bag</td>
			<td>Sbjbio</td>
			<td>SBJ132636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80047360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethyl ether</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10009318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH Sepharose</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30095516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrazine hydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80070418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10011018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>12399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-Thiogalactoside</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>5502-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A456</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>90600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>8100771933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide BEH C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piperidine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80104216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Extraction Kit</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B611253-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAexpress Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>32149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>20040718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10020018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;chloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Fmoc-protected amino acids</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilizing pot</td>
			<td>Tomy</td>
			<td>SX-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO Protease</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12588018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stop solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen</td>
			<td>Taihe Biotechnology Compay</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB reagent</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>421101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>91100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>T107252-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 HPLC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>YUHUA</td>
			<td>SHZ-95B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>IVGN0086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)

القضاء على الأجسام المضادة الضارة من الكائنات الحية هو نهج قيم لتدخل الأمراض المرتبطة بالأجسام المضادة، مثل حمى الضنك النزفية وأمراض المناعة الذاتية. منذ الآلاف من الأجسام المضادة مع النعوت مختلفة تنتشر في الدم، أي طريقة عالمية، باستثناء conjugate مزدوجة وظيفية من الببتيد المضادة للجينات وfc-III mimetics (DCAF)، وذكر لاستهداف الأجسام المضادة الضارة محددة. تطوير جزيئات DCAF يساهم بشكل كبير في تقدم العلاج المستهدف، والتي ثبت للقضاء على تأثير تعزيز تعتمد على الأجسام المضادة (ADE) في نموذج عدوى فيروس حمى الضنك (DENV) وتعزيز أستيل نشاط مستقبلات في نموذج الوهن العضلي الوبيل. هنا، نقوم بوصف بروتوكول لتركيب جزيء DCAF (DCAF1)، الذي يمكن أن يمنع بشكل انتقائي الأجسام المضادة 4G2 للتخفيف من تأثير ADE أثناء عدوى فيروس حمى الضنك، ويوضح ربط DCAF1 إلى 4G2 الأجسام المضادة عن طريق فحص ELISA. في طريقتنا، يتم تصنيع DCAF1 عن طريق اقتران مشتق الهيدرازين من الببتيد Fc-III ومؤتلف أعرب طويل α-اللولب مع تسلسل مضاد للجينات من خلال الربط الكيميائي الأصلي (NCL). وقد تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح على مركز جنيف للرقابة الديمقراطية على القوات المسلحة 1 وكذلك على جزيئات أخرى من قوات جنيف للرقابة على الأجسام المضادة.

يظهر المخطط الانسيابي لمسار التوليف بواسطة الربط الكيميائي الأصلي في هذه المقالة في الشكل 1. تظهر الأرقام 2-6 الكروماتوغرام(أ)والأطياف الكتلية(B)من مشتق الهيدرازين الكيميائي المركب من الببتيد Fc-III، المؤتلف أعرب linker ومستضد جزء، والمنتج النقي من رد...

Watch this Scientific Journal Video about Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF at JoVE.com

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

تطوير متقارن مزدوج الوظائف من الببتيد المضاد للجينات وfc-III mimetics (DCAF) هو رواية للقضاء على الأجسام المضادة الضارة. هنا، ونحن نصف بروتوكول مفصل لتركيب جزيء DCAF1، والتي يمكن أن تمنع بشكل انتقائي 4G2 الأجسام المضادة للقضاء على تأثير تعزيز الأجسام المضادة تعتمد خلال عدوى فيروس حمى الضنك.

حجب الأجسام المضادة المستهدفة بواسطة متقارن مزدوج الوظائف من الببتيد المضاد للجينات وFc-III Mimetics (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...

وهذا قد يفيد في المساعدة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول كيفية توليف جزيئات DCAF مع تحييد الأجسام المضادة المستهدفة. توفر هذه التقنية أبسط طريقة لتجميع جزيئات DCAF مع إنتاجية عالية. يقرر العالم أن جزيئات DCAF لديها التدخلات المحتملة للأجسام المضادة في التعامل مع أمراض مثل حمى الضنك والذرة العضلية.ويمكن تطبيق هذه الطريقة على جزيئات DCAF الأخرى مع epitopes مختلفة لاستهداف الأجسام المضادة cognate. إثبات الإجراء سيكون شيويه باي، وهو فني كبير من مختبري. لتحويل راتنج 2-الكلور إلى هيدروزين مشتقة 2-الكلور الراتنج، من أعلى وعاء التوليف الببتيد، إضافة خمسة ملليلتر من DMF إلى 0.25 ملليمول من راتنج 2-الكلور.ضع الغطاء مرة أخرى على، يهز بلطف السفينة لمدة 15 ثانية، ومن ثم استنزاف على موقف الحديد. كرر غسل DMF مرتين اُلّاً. ثم إضافة خمسة ملليلتر من DCM إلى السفينة، ووضع الغطاء مرة أخرى على، يهز بلطف السفينة لمدة 15 ثانية، ثم استنزاف على موقف الحديد.كرر غسل DCM مرتين االأكثر، ثم كرر غسل DMF ثلاث مرات أخرى. بعد ذلك، إضافة ستة ملليلتر من 50٪ تركيز حجم DMF على DCM لتضخم الراتنج لمدة 30 دقيقة ومن ثم استنزافه. الآن نقل ستة ملليلتر من 5٪ حجم تركيز هيدرازين وDMF إلى وعاء التفاعل.وضعه على شاكر في 120 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم استنزاف الحل عن طريق مضخة فراغ. لتنقية مشتق هيدرازين من ببتيد FC-III، استخدم نظام HPLC لتنقية الببتيد عن طريق 30 دقيقة من التلميحات المتدرجة بمعدل تدفق ميليلتر واحد في الدقيقة. بعد تنقية البروتين وفقا للمخطوطة، إضافة إلى أنبوب جديد ملليلتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر سومو الموسومة البروتين، ومليلتر واحد من بروتياز سومو، وميليلتر واحد من 10X سومو protease العازلة، وستة ملليلتر من الماء المقطر مزدوجة لإعداد حل التفاعل.احتضان الخليط لمدة 12 إلى 16 ساعة في أربع درجات مئوية. ثم aliquot الخليط في ثمانية 1.5 ملليلتر Eppendorf أنابيب، والطرد المركزي الخليط في 15، 000 مرات G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. استخدام الأنابيب لتجاهل المجاميع في الجزء السفلي، ثم في 10 ملليلتر مسح supernatants، إضافة 0.5 ملليلتر من 50٪ النيكل NTA الخرز الطين في 50 ملليمولار PBS.ضع الأنبوب عند شاكر دوار عند 200 دورة في الدقيقة وأربع درجات مئوية لخلطه بلطف لمدة 60 دقيقة. المقبل، تحميل ليزاد والنيكل NTA خليط في عمود مع سقف منفذ أسفل. إزالة الغطاء السفلي وحفظ تدفق من خلال إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر.بروتين SUMO له TAG هو ملزم على العمود. جزء مستضد الرابط ، الذي يبدأ مع رابطة الدول المستقلة لتفاعل الربط الكيميائي الأصلي ، هو في التدفق من خلال. الآن الوزن 1.8 ملليغرام من مشتق هيدرازين من ببتيد Fc-III في أنبوب Eppendorf milliliter اثنين وإضافة 0.8 ملليلتر من ستة كلوريد غواندينيوم مولار في 0.2 مولار محلول فوسفات أحادي الصوديوم في pH 3.دوامة لإذابة المسحوق. بعد الطرد المركزي للأنبوب في 7، 200 مرات G لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة نقل سوبرناتبيرت إلى أنبوب جديد. إضافة شريط ضجة في أنبوب ووضع الأنبوب في حمام ملح الجليد على مُحرك مغناطيسي لإثارة الحل لطيف لمدة 15 دقيقة.ثم إضافة 40 ميكرولترات من 0.5 نيتريت الصوديوم الضرس إلى حل لأكسدة مجموعة هيدرازين. يهيج بلطف الحل لمدة 15 دقيقة أخرى في حمام الملح الجليدي. تزن في 11 ملليغرام من HPLC تنقية وتجميد المجففة رابط مستضد جزء, و 13.6 ملليغرام من MPAA في أنبوب التفاعل في حمام ملح الجليد.اثارة لمدة خمس دقائق ثم ضبط قيمة درجة اله PH إلى 6.8 إلى 7.0 في غرفة معتدلة مع ستة هيدروكسيد الصوديوم الضرس. الخطوة الأكثر أهمية للسلّ الربط الكيميائي الأصلي هو ضبط قيمة درجة PH بعناية لبدء تفاعل الربط. بعد 12 ساعة في حمام ملح الثلج، إضافة 0.4 ملليلتر من 0.1 المولى TCEP الحل محايدة لنظام رد الفعل، ويحرك لمدة 20 دقيقة لإنهاء رد الفعل.بعد الطرد المركزي وتنقية HPLC، الحصول على ذروة اقتران الثالث لل desulfurization. تذوب في 50 ميكرولتردات من ستة كلوريد غواندينيوم المولار في 0.2 مولار محلول فوسفات الصوديوم الأحادي. ثم إضافة 50 microliters من واحد TCEP الضرس، 10 ميكرولترات من ثلاثية-بوتيلثيوول، وخمسة ميكرولترات من 0.1 مولار VAO لأربعة حل.ضبط درجة الH النهائي من الحل إلى 6.9 والحفاظ على الحل في 37 درجة مئوية على شاكر لمدة خمس ساعات تقريبا. الطرد المركزي وتنقية مرة أخرى. يُحل الببتيد المُعد في 200 ميكرولترات من خلات الفضة 32 ملليمولار، ثم يُحرّك خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات.لتحويل ثيولاتس الفضة على الببتيد إلى ثيول مجانا، إضافة ثلاثة ميكرولترات من دات واحد مول في ستة كلوريد غواندينيوم المولار، و 0.2 فوسفات أحادية الصوديوم المولر في 7 pH. تشغيل مطياف الكتلة في وضع المسح الضوئي الكامل وتعيين نطاق m / z في 300 إلى 2، 000، والقرار في 60،000. فتح بيانات الأطياف الكتلة والعثور على قمم المنتج في كل خطوة للتأكد من أن يتم تنفيذ التفاعل الكيميائي بنجاح.لأداء فحص ELISA للتفاعل بين الأجسام المضادة DCAF1 و 4G2 ، معطف كل بئر من لوحة 96-جيدا microtiter مع picomole واحد من الأجسام المضادة مضادة ا لجيست في 100 ميكرولترات من العازلة طلاء. ختم لوحة مع أشرطة الختم واحتضان في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها على شاكر. في كتلة الصباح كل بئر مع 200 microliters من 1٪ BSA وBBS.ختم لوحة واحتضان غرفة المعتدلة لمدة ساعة واحدة على شاكر. ثم استخدام برنامج تلفزيوني مع 0.05٪ توين 20 لغسل كل أربع مرات. في هذا البروتوكول تم استخدام طريقة الربط الكيميائي الأصلي لأشباه جزيء DCAF1.الطيف الشامل يظهر جزيء DCAF1 النهائي لديه وزن الجزيئية deconvolutional من 11، 053. خلال فحص ELISA ، يمنع مستضد الببتيد Fc-III و DCAF1 بشكل تنافسي ربط الأجسام المضادة 4G2. كل من الببتيد المستضد وDCAF1 منعت بشكل كبير 4G2 ملزمة في حين أن ببتيت FC-III لم يؤثر على التفاعل مستضد الأجسام المضادة.بعد هذا التطور ، مهدت هذه التقنية الطريق لتدخل الأمراض الضارة المرتبطة بالأجسام المضادة. الكثير من المناطق المستخدمة في تركيب الببتيد وربط المواد الكيميائية الأصلية هي شديدة السمية. تأكد من إجراء هذه التجارب في غطاء محرك السيارة الكيميائي.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

التغلب على عدم التجاوب في التجارب الذاتية التهاب الدماغ (EAE) سلالات الفئران المقاومة للنقل بواسطة بالتبني والتحدي الأنتيجين

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

قياس الأنفلونزا النورامينيداز تثبيط الجسم المضاد التتر من قبل انزيم مرتبط كتين الفحص

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

تحليل قردي نقص المناعة CD8 للفيروسات محددة<sup&gt; +</sup&gt; خلايا تي في القرد قرود المكاك التي كتبها الببتيد-MHC-I Tetramer تلطيخ

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

تدفق Virometry لتحليل الأنتيجين أطياف Virions وخارج الخلية الحويصلات

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

الفئران اللمفاويات وسمها من قبل<sup&gt; 64</sup&gt; النحاس والأجسام المضادة مستقبلات استهداف ل<em&gt; في فيفو</em&gt; الاتجار خلية بواسطة PET / ط م

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

تحديد حاتمة الخطي B-خلية المعترف بها الأجسام المضادة وحيدة النسيلة-الببتيد الضوئي بمساعدة

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

قياس الإنفلونزا تحييد ردود الأجسام المضادة للفيروسات A(H3N2) في الأمصال البشرية قبل درياقي فحوصات باستخدام خلايا مدكك-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

أسلوب لتسلسل 16S المستهدفة من عينات اللبن البشري

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

الدهنية مولده لتوليد الأجسام المضادة الخاصة بالمرض

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

تحديد الماوس وجسم الإنسان مبدع بتسلسل الجيل المقبل

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...