Name: targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)
Uploaded: 2019-09-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af Tsinghua University-Gates Foundation (nr. OPP1021992), den nationale naturvidenskabelige fond i Kina (nr. 21502103, 21877068 og 041301475), og det nationale centrale forsknings-og udviklings program i Kina (no. 2017YFA0505103).

1. kemisk syntese af hydrazinderivatet af et FC-III peptid
<ol><li>Konvertering af 2-CL-(TRT)-CL harpiks til 2-CL-(TRT)-NHNH2 harpiks
	<ol>
<li>Vejer 625 mg 2-CL-(TRT)-CL harpiks (0,25 mmol) i et 25 mL peptidsyntese fartøj.</li>
		<li>Der tilsættes 5 mL N, N-dimethylformamid (DMF) til harpiksen fra toppen af beholderen, sættes hætten tilbage, rystes forsigtigt beholderen i 15 s og derefter dræne den. Gentag DMF-vask i to gange.</li>
		<li>Tilsæt 5 mL dichlormethan (DCM) til beholderen,...

<ol>
	<li>Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Physiology (4th ed.). , (2003).</li><li>Halstead, S. B., O&#8217;Rourke, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-enhanced+dengue+virus+infection+in+primate+leukocytes.">Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes.</a> Nature. 265, 739-741 (1977).</li><li>Gammon, G., Sercarz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+some+T+cells+escape+tolerance+induction.">How some T cells escape tolerance induction.</a> Nature. 342, 183-185 (1989).</li><li>Takada, A., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-dependent+enhancement+of+viral+infection:+molecular+mechanisms+and+in+vivo+implications.">Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications.</a> Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).</li><li>Boonnak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Dendritic+Cells+in+Antibody-Dependent+Enhancement+of+Dengue+Virus+Infection.">Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection.</a> Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).</li><li>Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis+-+autoantibody+characteristics+and+their+implications+for+therapy.">Myasthenia gravis - autoantibody characteristics and their implications for therapy.</a> Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).</li><li>Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis:+past,+present,+and+future.">Myasthenia gravis: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).</li><li>Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+a+dengue+vaccine.">Progress towards a dengue vaccine.</a> The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).</li><li>Vikas, K., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+Myasthenia+Gravis.">Treatment of Myasthenia Gravis.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+dual-functional+conjugate+of+antigenic+peptide+and+Fc-III+mimetics+(DCAF)+for+targeted+antibody+blocking.">Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking.</a> Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).</li><li>Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+taylor-aris+dispersion+for+measurement+of+a+solute+diffusion+coefficient+in+thin+capillaries.">Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries.</a> Science. 266, 773-776 (1994).</li><li>Fang, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+chemical+synthesis+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).</li><li>Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+chemical+synthesis+of+proteins+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).</li><li>Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+proteins+using+peptide+hydrazides+as+thioester+surrogates.">Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates.</a> Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).</li></ol>

Protokollen her beskriver semi-syntese og påvisning af DCAF1 ved hjælp af NCL tilgang, som er vist i figur 1. Kort, de to fragmenter af DCAF1 er kemiske syntetiseret og rekombinant udtrykt, henholdsvis; derefter, den fulde længde DCAF1 molekyle er samlet, modificeret og renset. For den hydrazin afledte FC-III fragment syntese, ved hjælp af lav kapacitet 2-CL harpiks er ganske vigtigt, fordi høj kapacitet har en negativ effekt for hydrazin generation og fører til lav udbytte af produkte...

Antistoffer spiller vigtige roller i humorale immunrespons for neutralisering af patogene bakterier og vira1. Men, nogle antistoffer udviser skadelige virkninger for organismer, såsom cross-reaktive antistoffer i ade effekt under DENV infektion og over-reaktive antistoffer i myasthenia gravis, som er en autoimmune sygdomme2,3. ADE effekt er medieret af de Cross-reaktive antistoffer, der gør broen til at forbinde DENV og FC receptor præsenterer celler4,5, mensmyasthenia gravis er forårsaget af de overdrevneantistoffer, derangriber acetylcholin receptorer mellem celle-celle vejkryds i muskelvæv6,7. Selv om delvis effektive tilgange er blevet udviklet til behandling af disse sygdomme8,9, vil uden tvivl direkte eliminering af disse skadelige antistoffer gøre fremskridt for interventionerne.
For nylig er DCAF-molekyler, som har dual-funktionelle grupper, blevet udviklet til målrettet antistof blokering10. DCAF er et langt peptid, der består af 3 dele: 1) en antigen del, der specifikt kan genkende det cognate antistof, 2) en FC-III eller FC-III-4C-tag for stærkt binding til FC-området af antistoffet for at hæmme enten FC-receptoren eller komplement komponent proteiner , 3) en lang α-spiralformet linker, der konjugater disse to funktionelle grupper10. Linker-delen, der er designet fra Moesin FERM Domain, blev optimeret af Rosseta-software for at sikre, at antigen delen og FC-III-delen i et DCAF-molekyle kan binde sig til de fabelagtige og FC-regioner i IgG samtidigt. Fire DCAF molekyler er blevet syntetiseret til at målrette 4 forskellige antistoffer, blandt dem DCAF1 blev brugt til at fjerne 4G2 antistof, som er et kryds reaktivt antistof under DENV infektion at bidrage til ADE effekt; og DACF4 blev designet til redning af acetylcholin receptorer ved at blokere mab35 antistof i myasthenia gravis10.
I denne undersøgelse, der blev taget DCAF1 som eksemplet, viste vi protokollerne for syntesen af DCAF-molekyle og påvisning af samspillet mellem en DCAF og det deraf følgende cognate-antistof. DCAF1 er semi-syntetiseret af NCL approach11,12,13,14, som konjugater hydrazin derivatet af et FC-III peptid og de udtrykte linker-antigen dele sammen. NCL tilgang har betydelige fordele i forhold til fuldt kemisk syntese og fuldt rekombinant udtryk for DCAF1 syntese, fordi begge disse metoder fører til lav udbytte og høje omkostninger. Den nuværende tilgang er ikke kun den mest omkostningseffektive måde at få fuld længde DCAF, men også kan opretholde konstellationen af linker del lignende som sin oprindelige form. Da forskellige DCAF-molekyler har lignende sekvenser bortset fra antigen delene, kan vores metoder til DCAF1 syntese og interaktions analysen mellem DCAF1 og 4G2 antistof anvendes på andre DCAF-molekyler til målrettet blokering af deres cognate-antistoffer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Chlorotrityl resin</td>
			<td>Tianjin Nankai HECHENG S&#38;T</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>503236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4G2 antibody</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MA5-24387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-mercaptophenylacetic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>H27658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plates</td>
			<td>NEST</td>
			<td>701001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A955</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgOAc</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30164324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GST antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>AE001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076P2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis bag</td>
			<td>Sbjbio</td>
			<td>SBJ132636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80047360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethyl ether</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10009318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH Sepharose</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30095516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrazine hydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80070418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10011018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>12399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-Thiogalactoside</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>5502-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A456</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>90600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>8100771933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide BEH C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piperidine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80104216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Extraction Kit</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B611253-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAexpress Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>32149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>20040718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10020018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;chloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Fmoc-protected amino acids</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilizing pot</td>
			<td>Tomy</td>
			<td>SX-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO Protease</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12588018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stop solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen</td>
			<td>Taihe Biotechnology Compay</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB reagent</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>421101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>91100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>T107252-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 HPLC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>YUHUA</td>
			<td>SHZ-95B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>IVGN0086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)

Eliminering af skadelige antistoffer fra organismer er en værdifuld tilgang til intervention af antistof-associerede sygdomme, såsom Dengue hæmoragisk feber og autoimmune sygdomme. Da tusinder af antistoffer med forskellige epitoper cirkulerer i blodet, blev ingen universel metode, bortset fra Dual-funktionelle konjugat af antigene peptid og FC-III MIME (DCAF), rapporteret til at målrette specifikke skadelige antistoffer. Udviklingen af DCAF-molekyler bidrager betydeligt til udviklingen af målrettet terapi, som blev påvist at eliminere antistof afhængige ekstraudstyr (ADE) effekt i en dengue virus (DENV) infektion model og at øge acetylcholin receptor aktivitet i en myasthenia gravis-model. Her beskriver vi en protokol for syntesen af et DCAF-molekyle (DCAF1), som selektivt kan blokere 4G2-antistof for at dæmpe ADE-effekten under Denguevirus infektion og illustrere bindingen af DCAF1 til 4G2-antistof ved en ELISA-analyse. I vores metode, DCAF1 er syntetiseret ved konjugering af en hydrazin derivat af en FC-III peptid og en rekombinant udtrykt lang α-Helix med antigen sekvens gennem Native kemisk ligering (NCL). Denne protokol er blevet anvendt med succes på DCAF1 samt andre DCAF-molekyler til målretning af deres cognate-antistoffer.

Rutediagrammet for syntese ruten efter Native Chemical ligering i denne artikel er vist i figur 1. Figur 2-6 viser kromatogrammer (A) og massespektre (B) af kemisk syntetiseret HYDRAZIN derivat af et FC-III peptid, rekombinant udtrykt linker og antigen del, det rensede produkt fra NCL-reaktion, den rensede produkt fra desulfurisering-reaktionen og det rensede endelige produkt DCAF1. Kromatogrammerne viser, at rensningen af alle produkterne e...

Watch this Scientific Journal Video about Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF at JoVE.com

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

Udvikling af en dual-funktionelle konjugat af antigene peptid og FC-III MIME (DCAF) er en roman til eliminering af skadelige antistoffer. Her beskriver vi en detaljeret protokol for syntesen af DCAF1 molekyle, som selektivt kan blokere 4G2 antistof for at eliminere antistof afhængige ekstraudstyr effekt under dengue virus infektion.

Målrettet antistof blokering ved et dobbelt funktionelt konjugat af antigene peptid og FC-III-Mimetika (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...

Dette kan tjene til at hjælpe med at besvare centrale spørgsmål om, hvordan man syntetisere DCAF molekyler med målrettet antistof neutralisering. Denne teknik giver den enkleste måde at syntetisere af DCAF molekyler med høj produktivitet. Verden beslutter DCAF molekyler har de potentielle indgreb til antistoffet i beskæftiger sig med sygdomme som Dengue feber og myasthenia gravis.Denne metode kan anvendes på andre DCAF molekyler med forskellige epitoper til at målrette cognat antistoffer. Demonstration af proceduren vil være Xue Bai, en ledende tekniker fra mit laboratorium. For at konvertere 2-Klor harpiks til hydrazin afledt 2-Klor harpiks, fra toppen af peptid syntese fartøj, tilføje fem milliliter DMF til 0,25 millimoles af 2-Klor harpiks.Sæt hætten på igen, ryst forsigtigt beholderen i 15 sekunder, og aftømmes det derefter på et jernstativ. Gentag DMF vask to gange mere. Derefter tilsættes fem milliliter DCM til fartøjet, sæt hætten på igen, rys forsigtigt fartøjet i 15 sekunder, og aftømmes det derefter på en jernstativ.Gentag DCM vask to gange mere, og gentag derefter DMF vask tre gange mere. Dernæst tilsættes seks milliliter 50% volumenkoncentration af DMF over DCM for at svulme harpiksen i 30 minutter og derefter dræne den. Overfør nu seks milliliter 5% volumenkoncentration af hydrazin og DMF til reaktionsbeholderen.Anlækning på shakeren ved 120 omdr./min. og 30 grader celsius i 30 minutter, og aftap derefter opløsningen med vakuumpumpe. For at rense hydrazinderivatet af et Fc-III-peptid skal du bruge HPLC-systemet til at rense peptidet med en 30 minutters gradientalionseuer ved en strømningshastighed på en milliliter pr. minut. Efter proteinrensning i henhold til manuskriptet tilsættes to milliliter et milligram pr. milliliter SUMO-mærket protein, en milliliter SUMO-protease, en milliliter 10X SUMO proteasebuffer og seks milliliter dobbeltdestilleret vand for at forberede reaktionsopløsningen.Inkuber blandingen i 12 til 16 timer ved fire grader celsius. Derefter aliquot blandingen i otte 1,5 milliliter Eppendorf rør, og centrifuge blandingen ved 15, 000 gange G i 10 minutter ved fire grader celsius. Brug en pipet til at kassere aggregaterne i bunden, derefter i de 10 milliliter ryddet supernatanter, tilsæt 0,5 milliliter af 50% nikkel NTA perle gylle i 50 millimolar PBS.Rørret røret ved en drejeskryser ved 200 omdr./min. og fire grader celsius, der forsigtigt blandes i 60 minutter. Dernæst indlæse lisade og nikkel NTA blandingen i en kolonne med den nederste outlet cap. Fjern bundhætten og gem strømmen igennem til et 15 milliliter centrifugerør.HIS TAG SUMO-proteinet er bindende for kolonnen. Linker antigen del, som starter med CIS for indfødte kemiske ligation reaktion, er i strømmen igennem. Nu vægt 1,8 milligram hydrazin derivat af en Fc-III peptid i en to milliliter Eppendorf rør og tilsæt 0,8 milliliter af seks molar guanidiniumchlorid i 0,2 molar monosodium fosfat opløsning ved pH 3.Vortex at opløse pulveret. Efter centrifugering af røret ved 7, 200 gange G i et minut ved stuetemperatur overføre supernatant i et nyt rør. Tilsæt en røre bar i røret og læg røret i et issaltbad på en magnetisk omrører for at forsigtigt omrøre opløsningen i 15 minutter.Derefter tilsættes 40 mikroliter af 0,5 molar natriumnitrid til opløsningen for at oxidere hydrazingruppen. Ryst forsigtigt opløsningen i yderligere 15 minutter i issaltbadet. Vejer ind på 11 milligram af HPLC renset og frysetørret linker antigen del, og 13,6 milligram MPAA i reaktionsrøret i issaltbad.Rør i fem minutter og derefter justere pH-værdien til 6,8 til 7,0 på værelse tempereret med seks molar natriumhydroxid. Det mest kritiske trin for indbygget kemisk ligation er at justere pH-værdien omhyggeligt for at starte ligationsreaktionen. Efter 12 timer i issaltbadet tilsættes 0,4 milliliter 0,1 molar TCEP-neutral opløsning til reaktionssystemet, og reaktionen omrøres i 20 minutter for at afslutte reaktionen.Efter centrifugering og HPLC-rensning opnås konjugatens top III til desulfurisering. Det opløses i 50 mikroliter af seks molar guanidiniumchlorid i 0,2 molære mononatriumphosphatopløsning. Derefter tilsættes 50 mikroliter af en molar TCEP, 10 mikroliter tert-Butylthiol, og fem mikroliter af 0,1 molar VAO til fire opløsning.Opløsningens endelige pH-overensstemmelse med 6,9, og opløsningen opbevares ved 37 grader celsius på en shaker i ca. fem timer. Centrifuge og rense igen. Opløsning af det forberedte peptid i 200 mikroliter af 32 millimolar sølvacetat, og rør derefter reaktionsblandingen ved stuetemperatur i fire timer.For at konvertere sølv thiolates på peptid til gratis thioler, tilsættes tre mikroliter af en molar DTT i seks molar guanidiniumchlorid, og 0,2 molar monosodium fosfat ved pH 7. Fyld massespektrometeret i fuld scanningstilstand, og sæt m/z-området til 300 til 2.000 og opløsning ved 60.000. Åbn massespektredataene, og find toppene af produktet i hvert trin for at bekræfte, at den kemiske reaktion udføres med succes.For at udføre ELISA-analyse af samspillet mellem DCAF1 og 4G2 antistof, pels hver brønd af en 96-godt microtiter plade med en picomole af anti-GST antistof i 100 mikroliter af belægning buffer. Forsegle pladen med forsegling bånd og inkubere det ved 4 grader celsius natten over på en shaker. Om morgenen blok hver brønd med 200 mikroliter af 1% BSA og PBS.Forsegle pladen og inkubere det værelse tempereret i en time på en shaker. Brug derefter PBS med 0,05% Tween 20 til at vaske hver brønd fire gange. I denne protokol blev den oprindelige kemiske ligationsmetode anvendt til semisyntesen af DCAF1 molekylet.Massespektret viser det endelige DCAF1 molekyle har en deconvolutional molekylær vejer 11, 053. Under ELISA-analysen hæmmer antigen peptid Fc-III og DCAF1 konkurrencedygtigt 4G2-antistofbindingen. Både antigen peptid og DCAF1 blokerede signifikant 4G2-bindingen, mens Fc-III-peptitten ikke påvirkede antigenantistofinteraktionen.Efter denne udvikling banede denne teknik vejen for en intervention af skadelige antistof-associerede sygdomme. Lot's af de regioner, der anvendes til peptid syntese og indfødte kemiske ligation er meget giftige. Sørg for at tage disse eksperimenter i din kemiske hætte.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overvinde unresponsiveness i eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) Resistente musestammer ved adoptiv overførsel og antigenudfordring

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Måling Influenza neuraminidase Inhibering Antistoftitere af Enzyme-linked lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analyse af Simian Immunodeficiency Virus-specifikke CD8<sup&gt; +</sup&gt; T-celler i makakaber efter Peptid-MHC-I tetramerfarvning

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Flow Virometry at analysere Antigen Spectra af Virioner og ekstracellulære vesikler

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Muse lymfocyt Mærkning af<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-antistofreceptor Målretning for<em&gt; In vivo</em&gt; Cell Trafficking af PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

Peptid Scanning-assisteret Identifikation af et monoklonalt antistof-anerkendt Linear B-celleepitop

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Måling af Influenza neutraliserende antistof svar til A(H3N2) virus i menneskelige Sera af Microneutralization undersøgelser, som ved hjælp af MDCK-SIAT1 celler

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

En metode til målrettede 16S sekvensering af modermælk prøver

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Antigene Liposomer for Generation af sygdoms-specifikke antistoffer

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

Identifikation af mus og humant antistof repertoirer af næste generations sekventering

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...