Name: targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)
Uploaded: 2019-09-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF at JoVE.com

Dit werk werd deels gesteund door de Tsinghua University-Gates Foundation (nr. OPP1021992), de National Natural Science Foundation of China (nr. 21502103, 21877068 en 041301475), en het nationale sleutel onderzoeks-en ontwikkelingsprogramma van China (nr. 2017YFA0505103).

1. chemische synthese van het hydrazine derivaat van een FC-III peptide
<ol><li>2-cl-(TRT)-cl-hars omzetten in 2-cl-(TRT)-NHNH2 -hars
	<ol>
<li>Weeg 625 mg 2-cl-(TRT)-cl Resin (0,25 mmol) in een 25 mL peptide synthese vat.</li>
		<li>Voeg 5 mL N, N-dimethylformamide (DMF) toe aan de hars van de bovenkant van het vat, zet de dop terug, schud het vat zachtjes gedurende 15 sec. en giet het vervolgens af. Herhaal DMF-wassing nog twee keer.</li>
		<li>Voeg 5 mL dichloormethaan (DCM) toe aan het v...

<ol>
	<li>Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Physiology (4th ed.). , (2003).</li><li>Halstead, S. B., O&#8217;Rourke, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-enhanced+dengue+virus+infection+in+primate+leukocytes.">Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes.</a> Nature. 265, 739-741 (1977).</li><li>Gammon, G., Sercarz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+some+T+cells+escape+tolerance+induction.">How some T cells escape tolerance induction.</a> Nature. 342, 183-185 (1989).</li><li>Takada, A., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-dependent+enhancement+of+viral+infection:+molecular+mechanisms+and+in+vivo+implications.">Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications.</a> Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).</li><li>Boonnak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Dendritic+Cells+in+Antibody-Dependent+Enhancement+of+Dengue+Virus+Infection.">Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection.</a> Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).</li><li>Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis+-+autoantibody+characteristics+and+their+implications+for+therapy.">Myasthenia gravis - autoantibody characteristics and their implications for therapy.</a> Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).</li><li>Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis:+past,+present,+and+future.">Myasthenia gravis: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).</li><li>Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+a+dengue+vaccine.">Progress towards a dengue vaccine.</a> The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).</li><li>Vikas, K., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+Myasthenia+Gravis.">Treatment of Myasthenia Gravis.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+dual-functional+conjugate+of+antigenic+peptide+and+Fc-III+mimetics+(DCAF)+for+targeted+antibody+blocking.">Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking.</a> Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).</li><li>Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+taylor-aris+dispersion+for+measurement+of+a+solute+diffusion+coefficient+in+thin+capillaries.">Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries.</a> Science. 266, 773-776 (1994).</li><li>Fang, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+chemical+synthesis+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).</li><li>Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+chemical+synthesis+of+proteins+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).</li><li>Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+proteins+using+peptide+hydrazides+as+thioester+surrogates.">Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates.</a> Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).</li></ol>

Het protocol hier beschrijft de semi-synthese en detectie van DCAF1 met behulp van NCL benadering, die wordt weergegeven in Figuur 1. Kort, de twee fragmenten van DCAF1 zijn chemisch gesynthetiseerd en recombinantly uitgedrukt, respectievelijk; dan, de volledige lengte DCAF1 molecuul wordt geassembleerd, aangepast en gezuiverd. Voor de door hydrazine afgeleide FC-III-fragment synthese is het gebruik van 2-cl-hars met lage capaciteit heel belangrijk, omdat een hoge capaciteit een negatief eff...

Antilichamen spelen een belangrijke rol in de humorale immuunrespons voor de neutralisatie van pathogene bacteriën en virussen1. Sommige antilichamen vertonen echter schadelijke effecten op de organismen, zoals kruisreactieve antilichamen in het ade-effect tijdens denv-infectie en overmatige reactieve antilichamen in myasthenia gravis, een auto-immuunziekte2,3. ADE-effect wordt gemedieerd door de kruisreactieve antilichamen die de brug maken om denv en FC-receptor met cellen4,5te verbinden, terwijl myasthenia gravis wordt veroorzaakt door de overmatige antilichamen die acetylcholine-receptoren aanvallen tussen de cel-cel knooppunten in spierweefsel6,7. Hoewel er gedeeltelijk effectieve benaderingen zijn ontwikkeld voor de behandeling van deze ziekten8,9, zou ongetwijfeld directe eliminatie van deze schadelijke antilichamen vooruitgang voor de interventies.
Onlangs, DCAF moleculen, die hebben dual-functionele groepen, zijn ontwikkeld voor gerichte antilichamen blokkering10. DCAF is een lange peptide die bestaat uit 3 delen: 1) een antigeen deel dat specifiek kan herkennen de verwant antilichaam, 2) een FC-III of FC-III-4c-tag voor sterk binden aan de FC-regio van het antilichaam voor de remming van ofwel FC receptor of complement component eiwitten , 3) een lange α-spiraalvormige linker die deze twee functionele groepen10conjugaten. Het linker deel, ontworpen vanuit Moesin FERM domein, werd geoptimaliseerd door Rosseta software om ervoor te zorgen dat het antigeen deel en FC-III deel in een DCAF molecuul kan binden aan de Fab en FC regio's van IgG tegelijkertijd. Vier DCAF moleculen zijn gesynthetiseerd om te richten op 4 verschillende antilichamen, onder hen DCAF1 werd gebruikt om te elimineren 4G2 antilichamen, dat is een cross-reactieve antilichaam tijdens DENV-infectie om bij te dragen aan ADE-effect; en DACF4 is ontworpen voor de redding van acetylcholine-receptoren door het blokkeren van mab35 antilichaam in myasthenia gravis10.
In de huidige studie, genomen DCAF1 als het voorbeeld, we toonden de protocollen voor de synthese van DCAF molecuul en de detectie van de interactie tussen een DCAF en haar verwant antilichamen. De DCAF1 wordt semi-gesynthetiseerd door NCL-aanpak11,12,13,14, die het hydrazine derivaat van een FC-III-peptide en de uitgedrukte linker-antigeen delen samen conjugaten. De NCL aanpak heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van volledig chemische synthese en volledig recombinant expressie voor DCAF1 synthese, omdat beide methoden leiden tot lage opbrengst en hoge kosten. De huidige aanpak is niet alleen de meest kosteneffectieve manier om de volledige DCAF te krijgen, maar kan ook de conformatie van de linker deel vergelijkbaar als zijn oorspronkelijke vorm te handhaven. Aangezien verschillende DCAF moleculen vergelijkbare sequenties hebben, met uitzondering van de antigeen onderdelen, kunnen onze methoden voor DCAF1 synthese en de interactie test tussen DCAF1 en 4g2 antilichaam worden toegepast op andere DCAF moleculen om hun verwant antilichamen ook te blokkeren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Chlorotrityl resin</td>
			<td>Tianjin Nankai HECHENG S&#38;T</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>503236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4G2 antibody</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MA5-24387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-mercaptophenylacetic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>H27658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plates</td>
			<td>NEST</td>
			<td>701001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A955</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgOAc</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30164324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GST antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>AE001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076P2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis bag</td>
			<td>Sbjbio</td>
			<td>SBJ132636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80047360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethyl ether</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10009318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH Sepharose</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30095516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrazine hydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80070418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10011018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>12399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-Thiogalactoside</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>5502-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A456</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>90600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>8100771933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide BEH C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piperidine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80104216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Extraction Kit</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B611253-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAexpress Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>32149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>20040718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10020018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;chloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Fmoc-protected amino acids</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilizing pot</td>
			<td>Tomy</td>
			<td>SX-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO Protease</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12588018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stop solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen</td>
			<td>Taihe Biotechnology Compay</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB reagent</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>421101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>91100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>T107252-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 HPLC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>YUHUA</td>
			<td>SHZ-95B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>IVGN0086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)

Eliminatie van schadelijke antilichamen tegen organismen is een waardevolle aanpak voor de interventie van met antilichamen geassocieerde ziekten, zoals dengue hemorragische koorts en auto-immuunziekten. Aangezien duizenden antilichamen met verschillende epitopen in het bloed circuleren, werd er geen universele methode gerapporteerd, met uitzondering van het dubbele functionele conjugaat van antigene peptide en FC-III mimetica (DCAF), om specifieke schadelijke antilichamen aan te richten. De ontwikkeling van DCAF moleculen levert een aanzienlijke bijdrage aan de voortgang van gerichte therapie, die werden aangetoond dat het elimineren van het antilichaam afhankelijke verbetering (ADE) effect in een Denguevirus (DENV) infectie model en ter bevordering van de acetylcholine receptor activiteit in een myasthenia gravis model. Hier beschrijven we een protocol voor de synthese van een DCAF-molecuul (DCAF1), dat selectief 4G2-antilichamen kan blokkeren om het ADE-effect te verzachten tijdens een dengue-virus infectie en de binding van DCAF1 tot 4G2-antilichaam door een ELISA-test te illustreren. In onze methode wordt DCAF1 gesynthetiseerd door de conjugatie van een hydrazine derivaat van een FC-III peptide en een recombinant uitgedrukt lange α-helix met antigene sequentie door inheemse chemische ligatie (NCL). Dit protocol is met succes toegepast op DCAF1 en andere DCAF moleculen voor de targeting van hun verwant antilichamen.

Het stroomdiagram voor de syntheseroute door inheemse chemische ligatie in dit artikel wordt weergegeven in Figuur 1. Figuren 2-6 Toon de chromatogrammen (A) en massa spectra (B) van chemisch gesynthetiseerd hydrazine derivaat van een FC-III-peptide, recombinant uitgedrukt linker-en antigeen-deel, het gezuiverde product van de NCL-reactie, de gezuiverde product uit de ontzwavelings reactie en het gezuiverde eindproduct DCAF1, respectievelijk...

Watch this Scientific Journal Video about Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF at JoVE.com

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

De ontwikkeling van een Dual-functioneel conjugaat van antigene peptide en FC-III mimetica (DCAF) is een roman voor de eliminatie van schadelijke antilichamen. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de synthese van DCAF1 molecuul, dat selectief 4G2 antilichamen kan blokkeren om antilichaam afhankelijke verbeterings effecten te elimineren tijdens een Denguevirus infectie.

Gerichte antilichamen blokkering door een Dual-functioneel conjugaat van antigene peptide en FC-III mimetics (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...

Dit kan dienen om belangrijke vragen te beantwoorden over het synthetiseren van DCAF-moleculen met de beoogde antilichaamneutralisatie. Deze techniek biedt de eenvoudigste manier om de DCAF moleculen te synthetiseren met een hoge productiviteit. De wereld beslist DCAF moleculen hebben de potentiële interventies om het antilichaam in gaat over ziekten zoals de Knokkelkoorts en de myasthenie gravis.Deze methode kan worden toegepast op andere DCAF moleculen met verschillende epitopen om de cognate antilichamen te richten. Het aantonen van de procedure zal Xue Bai zijn, een senior technicus van mijn laboratorium. Om 2-chloor hars om te zetten in hydrazine afgeleid 2-Chloor hars, vanaf de bovenkant van het peptide synthesevat, voeg vijf milliliter DMF aan de 0,25 millimol van 2-Chloor hars.Zet de dop weer op, schud het vat voorzichtig gedurende 15 seconden, en vervolgens afvoer op een ijzeren standaard. Herhaal de DMF wassen nog twee keer. Voeg vervolgens vijf milliliter DCM toe aan het vat, zet de dop weer op, schud het vat voorzichtig gedurende 15 seconden en laat het vervolgens op een ijzeren standaard aftappen.Herhaal de DCM wassen nog twee keer, en herhaal dan de DMF wassen nog drie keer. Voeg vervolgens zes milliliter van 50% volumeconcentratie van DMF toe over DCM om de hars 30 minuten op te zwellen en vervolgens af te voeren. Breng nu zes milliliter van 5% volumeconcentratie hydrazine en DMF over op het reactievat.Plaats het op de shaker op 120 RPM en 30 graden Celsius gedurende 30 minuten, en vervolgens afvoer van de oplossing door vacuümpomp. Om de hydrazinerivaat van een Fc-III peptide te zuiveren, gebruikt u het HPLC-systeem om het peptide te zuiveren met een 30 minuten durende gradiëntingseution met een stroomsnelheid van één milliliter per minuut. Na eiwitzuivering volgens het manuscript, voeg in een nieuwe buis twee milliliter van een milligram per milliliter SUMO gelabeld eiwit, een milliliter sumo protease, een milliliter van 10X SUMO protease buffer, en zes milliliter dubbel gedestilleerd water om de reactie oplossing voor te bereiden.Incubeer het mengsel gedurende 12 tot 16 uur bij vier graden Celsius. Dan aliquot het mengsel in acht 1,5 milliliter Eppendorf buizen, en centrifugeren het mengsel op 15.000 keer G gedurende 10 minuten op vier graden Celsius. Gebruik een pipet om de aggregaten te ontdoen aan de onderkant, dan in de 10 milliliter gewist supernatants, voeg 0,5 milliliter van de 50%nikkel NTA kraal drijfmest in 50 millimolar PBS.Plaats de buis bij een roterende shaker op 200 RPM en vier graden Celsius om zachtjes te mengen gedurende 60 minuten. Laad vervolgens de lisade en het nikkel NTA mengsel in een kolom met de onderste uitlaat dop. Verwijder de onderste dop en sla de stroom door in een 15 milliliter centrifuge buis.Het ZIJN TAG SUMO eiwit is bindend op de kolom. Het linkerantigeendeel, dat met CIS voor inheemse chemische ligatiereactie begint, is in de stroom door. Nu gewicht 1,8 milligram hydrazine derivaat van een Fc-III peptide in een twee milliliter Eppendorf buis en voeg 0,8 milliliter van zes molaire guanidiniumchloride in 0,2 molaire mononatrium fosfaat oplossing op pH 3.Vortex om het poeder op te lossen. Na het centrifugeren van de buis op 7, 200 keer G gedurende een minuut bij kamertemperatuur breng de supernatant in een nieuwe buis. Voeg een roerstaaf in de buis en zet de buis in een ijszout bad op een magnetische roerder om zacht roeren de oplossing voor 15 minuten.Voeg vervolgens 40 microliter natriumnitriet van 0,5 mol aan de oplossing toe om de hydrazinegroep te oxideren. Roer de oplossing voorzichtig nog 15 minuten in het ijszoutbad. Weeg 11 milligram hplc gezuiverd en gevriesdroogd linker antigeen deel, en 13,6 milligram MPAA in de reactiebuis in het ijszout bad.Roer gedurende vijf minuten en pas vervolgens de pH-waarde aan op 6,8 tot 7,0 in de kamer gematigd met zes molaire natriumhydroxide. De meest kritieke stap voor inheemse chemische ligatie is om de pH-waarde zorgvuldig aan te passen om de ligatiereactie te initiëren. Voeg na 12 uur in het ijszoutbad 0,4 milliliter 0,1 molaire TCEP-neutrale oplossing toe aan het reactiesysteem en roer gedurende 20 minuten om de reactie te beëindigen.Na centrifugatie en HPLC-zuivering, verkrijg de conjugaatpiek III voor desulfurisatie. Los het op in 50 microliter van zes molaire guanidiniumchloride in 0,2 molaire mononatriumfosfaatoplossing. Voeg vervolgens 50 microliter van één molaire TCEP, 10 microliter tert-Butylthiol en vijf microliter van 0,1 molaire VAO toe voor vier oplossingen.Pas de uiteindelijke pH van de oplossing aan op 6,9 en houd de oplossing ongeveer vijf uur op 37 graden celsius op een shaker. Centrifugeren en weer zuiveren. Los het bereide peptide op in 200 microliter van 32 millimolar zilveracetaat en roer het reactiemengsel vervolgens vier uur op kamertemperatuur.Om de zilvertholalaten op peptide om te zetten in vrije thiolen, voegt u drie microliters van één molaire DTT toe in zes molaire guanidiniumchloride en 0,2 molair mononatriumfosfaat bij pH 7. Bedien de massaspectrometer in de volledige scanmodus en stel het m/z-bereik in op 300 tot 2.000 en resolutie op 60.000. Open de massaspectragegevens en vind de pieken van het product in elke stap om te bevestigen dat de chemische reactie met succes wordt uitgevoerd.Om elisa-test van de interactie tussen DCAF1 en 4G2-antilichaam uit te voeren, bedekt u elke put van een 96-bron microtiterplaat met één picomole anti-GST-antilichaam in 100 microliter coatingbuffer. Verzegel de plaat met afdichtingsbanden en broed het 's nachts op 4 graden celsius op een shaker. In het ochtendblok elk goed met 200 microliters van 1%BSA en PBS.Verzegel de plaat en uitbroed het ruimte gematigd voor een uur op een shaker. Gebruik vervolgens PBS met 0,05%Tween 20 om elk goed vier keer te wassen. In dit protocol werd de inheemse chemische ligatiemethode gebruikt voor de semisynthese van het DCAF1 molecuul.Het massaspectrum toont aan dat het uiteindelijke DCAF1 molecuul een deconvolutional moleculaire weging heeft van 11.053. Tijdens de ELISA-test remmen antigenpepte Fc-III en DCAF1 4G2-antilichaambinding concurrerend. Zowel antigenpepte als DCAF1 blokkeerden 4G2-binding aanzienlijk, terwijl het Fc-III peptiet geen invloed had op de antigenererende antilichaaminteractie.Na deze ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor een interventie van schadelijke antilichaamgerelateerde ziekten. Lot's van de regio's die worden gebruikt voor peptide synthese en inheemse chemische ligatie zijn zeer giftig. Zorg ervoor dat deze experimenten te nemen in uw chemische kap.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Het overwinnen van reageert niet in experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) Resistant muizenstammen door adoptieve overdracht en Antigene Challenge

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Meten Influenza neuraminidase Remming antilichaamtiters door Enzyme-linked lectine Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analyse van Simian Immunodeficiency Virus-specifieke CD8<sup&gt; +</sup&gt; T-cellen in resusapen door peptide-MHC-I tetrameer kleuring

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Flow Virometry Analyseer antigene Spectra van Virions en extracellulaire blaasjes

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Muizen-lymfocyt Labeling door<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antibody Receptor targeting voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Celverkeer PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

Peptide Scanning-bijgestaan ​​Identificatie van een monoklonaal antilichaam-erkende Lineair B-celepitoop

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Meten van Influenza neutraliserende antilichamen reacties op A(H3N2) virussen in menselijke Sera door Microneutralization testen met behulp van MDCK-SIAT1 cellen

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Een methode voor gerichte 16S sequentiebepaling van menselijke melkmonsters

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Antigene liposomen voor generatie van ziekte-specifieke antilichamen

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

Identificatie van muis en menselijk antilichaam Repertoires door Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...