Name: targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)
Uploaded: 2019-09-17T13:30:00
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Ce travail a été soutenu en partie par la Fondation Tsinghua University-Gates (non. OPP1021992), la National Natural Science Foundation of China (no. 21502103, 21877068 et 041301475), et le National Key Research and Development Program of China (no. 2017YFA0505103).

1. Synthèse chimique du dérivé de l'hydrazine d'un peptide Fc-III
<ol><li>Conversion 2-Cl-(Trt)-Cl résine à 2-Cl-(Trt)-NHNH2 résine
	<ol>
<li>Peser 625 mg de résine de 2-Cl-(Trt)-Cl (0,25 mmol) dans un récipient de synthèse peptide de 25 ml.</li>
		<li>Ajouter 5 mL de N,N-dimethylformamide (DMF) à la résine du haut du navire, remettre le bouchon, secouer doucement le navire pendant 15 s, puis le vider. Répétez le lavage DMF pour deux fois de plus.</li>
		<li>Ajouter 5 ml de dich...

<ol>
	<li>Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Physiology (4th ed.). , (2003).</li><li>Halstead, S. B., O&#8217;Rourke, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-enhanced+dengue+virus+infection+in+primate+leukocytes.">Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes.</a> Nature. 265, 739-741 (1977).</li><li>Gammon, G., Sercarz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+some+T+cells+escape+tolerance+induction.">How some T cells escape tolerance induction.</a> Nature. 342, 183-185 (1989).</li><li>Takada, A., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-dependent+enhancement+of+viral+infection:+molecular+mechanisms+and+in+vivo+implications.">Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications.</a> Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).</li><li>Boonnak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Dendritic+Cells+in+Antibody-Dependent+Enhancement+of+Dengue+Virus+Infection.">Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection.</a> Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).</li><li>Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis+-+autoantibody+characteristics+and+their+implications+for+therapy.">Myasthenia gravis - autoantibody characteristics and their implications for therapy.</a> Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).</li><li>Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis:+past,+present,+and+future.">Myasthenia gravis: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).</li><li>Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+a+dengue+vaccine.">Progress towards a dengue vaccine.</a> The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).</li><li>Vikas, K., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+Myasthenia+Gravis.">Treatment of Myasthenia Gravis.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+dual-functional+conjugate+of+antigenic+peptide+and+Fc-III+mimetics+(DCAF)+for+targeted+antibody+blocking.">Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking.</a> Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).</li><li>Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+taylor-aris+dispersion+for+measurement+of+a+solute+diffusion+coefficient+in+thin+capillaries.">Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries.</a> Science. 266, 773-776 (1994).</li><li>Fang, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+chemical+synthesis+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).</li><li>Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+chemical+synthesis+of+proteins+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).</li><li>Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+proteins+using+peptide+hydrazides+as+thioester+surrogates.">Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates.</a> Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).</li></ol>

Le protocole décrit ici la semi-synthèse et la détection de DCAF1 en utilisant l'approche NCL, qui est montrée dans la figure 1. En bref, les deux fragments de DCAF1 sont synthétisés chimiquement et recombinantement exprimés, respectivement ; ensuite, la molécule DCAF1 pleine longueur est assemblée, modifiée et purifiée. Pour la synthèse de fragments de Fc-III dérivée de l'hydrazine, l'utilisation de résine 2-Cl de faible capacité est très importante, car la capacité élev?...

Les anticorps jouent un rôle important dans la réponse immunitaire humoristique pour la neutralisation des bactéries pathogènes et des virus1. Cependant, certains anticorps présentent des effets nocifs sur les organismes, tels que les anticorps réactifs croisés dans l'effet ADE pendant l'infection à DENV et les anticorps surréactifs dans les gravis de myasthénie, qui est une maladie auto-immune2,3. L'effet ADE est médié par les anticorps réactifs qui font le pont pour relier les cellules de présentation de DENV et de récepteur fc4,5, tandis que la myasthénie gravis est causée par les anticorps excessifs qui attaquent les récepteurs de l'acétylcholine entre les jonctions cellule-cellule dans le tissu musculaire6,7. Bien que des approches partiellement efficaces aient été développées pour traiter ces maladies8,9, sans aucun doute l'élimination directe de ces anticorps nocifs ferait des progrès pour les interventions.
Récemment, des molécules de DCAF, qui ont des groupes dual-fonctionnels, ont été développées pour le blocage ciblé d'anticorps10. DCAF est un long peptide qui est composé de 3 parties: 1) une partie d'antigène qui peut reconnaître spécifiquement l'anticorps cognate, 2) une étiquette Fc-III ou Fc-III-4C pour fortement lier à la région Fc de l'anticorps pour inhiber soit les récepteurs Fc ou compléter les protéines composant , 3) un long lien hélicoïdal qui conjugue ces deux groupes fonctionnels10. La partie de liaison, conçue à partir du domaine Moesin FERM, a été optimisée par le logiciel Rosseta pour s'assurer que la partie antigène et la partie Fc-III d'une molécule DCAF peuvent se lier simultanément aux régions Fab et Fc d'IgG. Quatre molécules de DCAF ont été synthétisées pour cibler 4 anticorps différents, dont DCAF1 a été utilisé pour éliminer l'anticorps 4G2, qui est un anticorps réactif croisé pendant l'infection de DENV pour contribuer à l'effet ADE ; et DACF4 a été conçu pour le sauvetage des récepteurs de l'acétylcholine en bloquant l'anticorps mab35 dans myasthenia gravis10.
Dans la présente étude, prise DCAF1 comme exemple, nous avons montré les protocoles pour la synthèse de la molécule DCAF et la détection de l'interaction entre un DCAF et son anticorps cognate. Le DCAF1 est semi-synthétisé par nCL approche11,12,13,14, qui conjugue le dérivé de l'hydrazine d'un peptide Fc-III et les parties exprimées linker-antigène ensemble. L'approche NCL présente des avantages significatifs par rapport à la synthèse entièrement chimique et à l'expression entièrement recombinante pour la synthèse DCAF1, car ces deux méthodes entraînent un faible rendement et un coût élevé. L'approche actuelle est non seulement le moyen le plus rentable d'obtenir le DCAF pleine longueur, mais peut également maintenir la conformation de la partie de liaison semblable à sa forme indigène. Puisque différentes molécules de DCAF ont des séquences semblables excepté les parties d'antigène, nos méthodes pour la synthèse de DCAF1 et l'analyse d'interaction entre l'anticorps de DCAF1 et 4G2 peuvent être appliquées à d'autres molécules de DCAF pour bloquer de cible leurs anticorps de cognate aussi bien.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Chlorotrityl resin</td>
			<td>Tianjin Nankai HECHENG S&#38;T</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>503236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4G2 antibody</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MA5-24387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-mercaptophenylacetic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>H27658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plates</td>
			<td>NEST</td>
			<td>701001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A955</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgOAc</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30164324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GST antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>AE001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076P2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis bag</td>
			<td>Sbjbio</td>
			<td>SBJ132636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80047360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethyl ether</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10009318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH Sepharose</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30095516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrazine hydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80070418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10011018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>12399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-Thiogalactoside</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>5502-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A456</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>90600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>8100771933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide BEH C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piperidine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80104216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Extraction Kit</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B611253-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAexpress Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>32149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>20040718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10020018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;chloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Fmoc-protected amino acids</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilizing pot</td>
			<td>Tomy</td>
			<td>SX-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO Protease</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12588018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stop solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen</td>
			<td>Taihe Biotechnology Compay</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB reagent</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>421101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>91100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>T107252-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 HPLC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>YUHUA</td>
			<td>SHZ-95B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>IVGN0086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)

L'élimination des anticorps nocifs des organismes est une approche précieuse pour l'intervention de maladies associées aux anticorps, telles que la dengue hémorragique et les maladies auto-immunes. Puisque des milliers d'anticorps avec différentes épitopes circulent dans le sang, aucune méthode universelle, excepté la conjugaison dual-fonctionnelle du peptide antigénique et de la mimétique de Fc-III (DCAF), n'a été rapportée pour cibler les anticorps nocifs spécifiques. Le développement de molécules DCAF apporte une contribution significative aux progrès de la thérapie ciblée, qui ont été démontrés pour éliminer l'effet d'amélioration dépendante des anticorps (ADE) dans un modèle d'infection par le virus de la dengue (DENV) et pour stimuler l'acétylcholine l'activité des récepteurs dans un modèle de myasthénie gravis. Ici, nous décrivons un protocole pour la synthèse d'une molécule de DCAF (DCAF1), qui peut bloquer sélectivement l'anticorps 4G2 pour atténuer l'effet d'ADE pendant l'infection de virus de dengue, et illustrer la liaison de l'anticorps de DCAF1 à 4G2 par un test d'ELISA. Dans notre méthode, DCAF1 est synthétisé par la conjugaison d'un dérivé d'hydrazine d'un peptide fc-III et d'un recombinant exprimé longtemps -helix avec séquence antigénique par la ligature chimique indigène (NCL). Ce protocole a été appliqué avec succès à DCAF1 ainsi qu'à d'autres molécules d'ADFA pour cibler leurs anticorps cognate.

Le diagramme de flux pour la voie de synthèse par ligature chimique indigène dans cet article est montré dans la figure 1. Les figures 2-6 montrent les chromatogrammes (A) et les spectres de masse (B) de dérivés chimiques d'hydrazine synthétisée d'un peptide Fc-III, lien recombinant exprimé et partie antigène, le produit purifié de la réaction NCL, le purifié produit de la réaction de désulfuration et du produit final purifié ...

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Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

Le développement d'une conjugaison bifonctionnelle de peptide antigénique et de mimétique Fc-III (DCAF) est nouveau pour l'élimination des anticorps nocifs. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la synthèse de la molécule DCAF1, qui peut bloquer sélectivement l'anticorps 4G2 pour éliminer l'effet d'amélioration dépendant des anticorps pendant l'infection de virus de dengue.

Blocage ciblé d'anticorps par un conjugaison bifonctionnel de peptide antigénique et de mimétrie fc-III (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...

Cela pourrait aider à répondre à des questions clés sur la façon de synthétiser les molécules DCAF avec la neutralisation ciblée des anticorps. Cette technique fournit le moyen le plus simple de synthétiser les molécules DCAF avec une productivité élevée. Le monde décide que les molécules du DCAF ont les interventions potentielles à l’anticorps dans le traitement de maladies telles que la dengue et la myasthénie gravis.Cette méthode peut être appliquée à d’autres molécules du DCAF avec différents épitopes pour cibler les anticorps cognés. Xue Bai, technicien principal de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour convertir la résine de 2 chlore en résine 2 chlore dérivée de l’hydrazine, du haut du récipient de synthèse peptidique, ajoutez cinq millilitres de DMF aux 0,25 millimoles de résine de 2 chlore.Remettre le bouchon, secouer doucement le récipient pendant 15 secondes, puis le égoutter sur un support en fer. Répétez le lavage DMF deux fois de plus. Ajouter ensuite cinq millilitres de DCM au navire, remettre le bouchon, secouer doucement le récipient pendant 15 secondes, puis le vider sur un support en fer.Répétez le lavage DCM deux fois de plus, puis répétez le lavage DMF trois fois de plus. Ensuite, ajoutez six millilitres de concentration de 50% de volume de DMF sur DCM pour gonfler la résine pendant 30 minutes, puis égouttez-la. Transférez maintenant six millilitres de concentration en volume de 5 % d’hydrazine et de DMF au vaisseau réactionnaire.Placez-le sur le shaker à 120 RPM et 30 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis égouttez la solution par pompe à vide. Pour purifier le dérivé hydrazine d’un peptide Fc-III, utilisez le système HPLC pour purifier le peptide par une elution d’allusion de gradient de 30 minutes à un débit d’un millilitre par minute. Après purification des protéines selon le manuscrit, ajouter dans un nouveau tube deux millilitres d’un milligramme par millilitre sumo marqué protéine, un millilitre de protéase SUMO, un millilitre de tampon de protéase SUMO 10X, et six millilitres d’eau distillée double pour préparer la solution de réaction.Incuber le mélange de 12 à 16 heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, aliquot le mélange en huit tubes Eppendorf de 1,5 millilitre, et centrifuger le mélange à 15.000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Utilisez un pipet pour jeter les agrégats au fond, puis dans les supernatants défrichés de 10 millilitres, ajouter 0,5 millilitres de la boue de perles NTA de 50 % nickel dans 50 millimolaires PBS.Placer le tube à un shaker rotatif à 200 rpm et quatre degrés Celsius pour mélanger doucement pendant 60 minutes. Ensuite, chargez le lisade et le mélange nickel NTA dans une colonne avec le bouchon de sortie inférieur. Retirez le bouchon inférieur et économisez le flux dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres.La protéine HIS TAG SUMO est contraignante sur la colonne. La partie antigène linker, qui commence avec la CEI pour la réaction de ligature chimique indigène, est dans le flux à travers. Maintenant, le poids 1,8 milligrammes de dérivé hydrazine d’un peptide Fc-III dans un tube eppendorf de deux millilitres et ajouter 0,8 millilitres de six guanidinium chlorure molaire dans 0,2 molar solution de phosphate monosodique au pH 3.Vortex pour dissoudre la poudre. Après avoir centrifugé le tube à 7200 fois G pendant une minute à température ambiante transférer le supernatant dans un nouveau tube. Ajouter une barre de remue-glace dans le tube et mettre le tube dans un bain de sel de glace sur un agitateur magnétique pour agiter doucement la solution pendant 15 minutes.Ajouter ensuite 40 microlitres de nitrite de sodium molaire de 0,5 molaire à la solution pour oxyder le groupe hydrazine. Agiter doucement la solution pendant encore 15 minutes dans le bain de sel de glace. Peser à 11 milligrammes de la partie antigène de liaison purifié et lyophilisé HPLC, et 13,6 milligrammes de MPAA dans le tube de réaction dans le bain de sel de glace.Remuer pendant cinq minutes, puis ajuster la valeur du pH à 6,8 à 7,0 à la chambre tempérée avec six hydroxyde de sodium molaire. L’étape la plus critique pour la ligature chimique indigène est d’ajuster la valeur de pH soigneusement pour initier la réaction de ligature. Après 12 heures dans le bain de sel de glace, ajouter 0,4 millilitres de 0,1 molar TCEP solution neutre au système de réaction, et remuer pendant 20 minutes pour mettre fin à la réaction.Après centrifugation et purification hplc, obtenir le pic conjugué III pour la désulfuration. Dissolvez-le dans 50 microlitres de six chlorure molaire de guanidinium dans la solution molaire de phosphate de monosodium. Ajoutez ensuite 50 microlitres d’un TCEP molaire, 10 microlitres de tert-Butylthiol et cinq microlitres de 0,1 VAO molaire pour quatre solutions.Ajustez le pH final de la solution à 6,9 et maintenez la solution à 37 degrés Celsius sur un shaker pendant environ cinq heures. Centrifugeuse et purifier à nouveau. Dissoudre le peptide préparé en 200 microlitres d’acétate d’argent de 32 millimlaires, puis remuer le mélange de réaction à température ambiante pendant quatre heures.Pour convertir les thiolates d’argent sur le peptide en thiols libres, ajoutez trois microlitres d’une molaire DTT dans six chlorure molaires de guanidinium, et 0,2 phosphate monosodique molaire au pH 7. Actionnez le spectromètre de masse en mode scan complet et réglez la plage m/z à 300 à 2000, et la résolution à 60 000. Ouvrez les données des spectres de masse et trouvez les pics du produit à chaque étape pour confirmer que la réaction chimique est effectuée avec succès.Pour effectuer l’analyse ELISA de l’interaction entre l’anticorps DCAF1 et 4G2, enduire chaque puits d’une plaque de microtiter de 96 puits avec un picomole d’anticorps anti-TPS dans 100 microlitres de tampon de revêtement. Sceller la plaque avec des rubans d’étanchéité et l’incuber à 4 degrés Celsius pendant la nuit sur un shaker. Dans le bloc du matin chaque puits avec 200 microlitres de 1%BSA et PBS.Sceller la plaque et l’incuber tempérée pendant une heure sur un shaker. Ensuite, utilisez PBS avec 0,05%Tween 20 pour laver chaque puits quatre fois. Dans ce protocole, la méthode de ligature chimique indigène a été utilisée pour la semisynthèse de la molécule DCAF1.Le spectre de masse montre que la molécule finale DCAF1 a un poids moléculaire déconvolutionnel de 11 053. Pendant l’essai ELISA, le peptide antigène Fc-III et le DCAF1 inhibent de façon compétitive la liaison anticorps 4G2. Le peptide d’antigène et le DCAF1 ont sensiblement bloqué la liaison 4G2 tandis que le peptite de Fc-III n’a pas affecté l’interaction d’anticorps d’antigène.Après ce développement, cette technique a ouvert la voie à une intervention de maladies nocives associées aux anticorps. Lot des régions utilisées pour la synthèse peptidique et la ligature chimique indigène sont très toxiques. Assurez-vous de prendre ces expériences dans votre hotte chimique.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Surmonter Absence de réaction dans encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) souches de souris résistantes par transfert adoptif et une stimulation antigénique

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Recherche

Immunologie et infection

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Mesure de la grippe neuraminidase Inhibition Titres d&#39;anticorps par-enzymatique lectine Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analyse de l&#39;immunodéficience simienne CD8 spécifiques Virus<sup&gt; +</sup&gt; T-cellules dans rhésus macaques par Peptide-CMH-I tétramère Coloration

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Débit Virometry pour l&#39;analyse antigénique Spectra de virions et extracellulaires Vésicules

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murine lymphocytaire par étiquetage<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-anticorps du récepteur de ciblage pour<em&gt; In Vivo</em&gt; Le trafic cellulaire par PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

L&#39;identification d&#39;un épitope linéaire des cellules B monoclonales d&#39;anticorps reconnus par le peptide à balayage assistée

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Grippe neutralisante d’anticorps aux virus a (H3N2) dans le sérum humain par micro-neutralisation de mesure des analyses utilisant des cellules de MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Une méthode de séquençage ciblé 16 s d’échantillons de lait maternel

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Liposomes antigéniques pour la production d’anticorps spécifiques à certaines maladies

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

Identification des souris et des répertoires d’anticorps humain par séquençage de prochaine génération

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...