Name: targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)
Uploaded: 2019-09-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF at JoVE.com

עבודה זו היתה נתמכת בחלקו על ידי קרן שערי אוניברסיטת Tsinghua (לא. OPP1021992), הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (no. 21502103, 21877068 ו 041301475), ואת תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי של סין (no 2017YFA0505103).

1. הסינתזה הכימית של ה הידראזין של פפטיד Fc-III
<ol><li>המרת 2-Cl-(Trt)-Cl שרף ל 2-Cl-(Trt)-NHNH2 שרף
	<ol>
<li>שוקלים 625 מ"ג של 2-Cl-(Trt)-קלרנית שרף (0.25 ממול) לתוך כלי סינתזה של 25 מ"ל.</li>
		<li>הוסף 5 מ ל של N, N-diמתיל (DMF) אל שרף מראש הספינה, לשים את הכובע בחזרה, לנער בעדינות את הכלי עבור 15 s ולאחר מכן לנקז אותו. חזו?...

<ol>
	<li>Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Physiology (4th ed.). , (2003).</li><li>Halstead, S. B., O&#8217;Rourke, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-enhanced+dengue+virus+infection+in+primate+leukocytes.">Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes.</a> Nature. 265, 739-741 (1977).</li><li>Gammon, G., Sercarz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+some+T+cells+escape+tolerance+induction.">How some T cells escape tolerance induction.</a> Nature. 342, 183-185 (1989).</li><li>Takada, A., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-dependent+enhancement+of+viral+infection:+molecular+mechanisms+and+in+vivo+implications.">Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications.</a> Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).</li><li>Boonnak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Dendritic+Cells+in+Antibody-Dependent+Enhancement+of+Dengue+Virus+Infection.">Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection.</a> Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).</li><li>Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis+-+autoantibody+characteristics+and+their+implications+for+therapy.">Myasthenia gravis - autoantibody characteristics and their implications for therapy.</a> Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).</li><li>Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis:+past,+present,+and+future.">Myasthenia gravis: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).</li><li>Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+a+dengue+vaccine.">Progress towards a dengue vaccine.</a> The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).</li><li>Vikas, K., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+Myasthenia+Gravis.">Treatment of Myasthenia Gravis.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+dual-functional+conjugate+of+antigenic+peptide+and+Fc-III+mimetics+(DCAF)+for+targeted+antibody+blocking.">Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking.</a> Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).</li><li>Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+taylor-aris+dispersion+for+measurement+of+a+solute+diffusion+coefficient+in+thin+capillaries.">Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries.</a> Science. 266, 773-776 (1994).</li><li>Fang, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+chemical+synthesis+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).</li><li>Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+chemical+synthesis+of+proteins+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).</li><li>Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+proteins+using+peptide+hydrazides+as+thioester+surrogates.">Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates.</a> Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).</li></ol>

הפרוטוקול מתאר להלן את הסינתזה והזיהוי של DCAF1 באמצעות גישת NCL, המוצגת באיור 1. בקצרה, שני שברי DCAF1 הם מסונתז כימי recombinantly ביטא, בהתאמה; לאחר מכן, אורך מלא DCAF1 מולקולה מורכב, שונה ומטוהר. לצורך הידראזין הנגזר הסינתזה של החלקיק השלישי, שימוש ב-2-Cl בעל קיבולת נמוכה, הוא די חשוב, מכיוו...

נוגדנים לשחק תפקידים חשובים בתגובה החיסונית ומוראלית עבור נטרול של חיידקים פתוגניים ווירוסים1. עם זאת, נוגדנים מסוימים מפגין השפעות מזיקות לאורגניזמים, כגון נוגדנים מתגובתית באפקט ADE במהלך זיהום denv ונוגדנים מגיבים יותר במיאסטניה גראביס, שהיא מחלות אוטואימוניות2,3. האפקט ADE מתווכת על ידי הנוגדנים החוצה תגובתי שעושים את הגשר להתחבר denv ו הקולטן Fc הצגת תאים4,5, בעוד מיאסטניה גרביס נגרמת על ידי נוגדנים מוגזמת התוקפים קולטני אצטילכולין בין הצמתים של תאי התא. ברקמת שריר6,7 למרות שגישות אפקטיביות חלקית פותחו כדי לטפל במחלות אלה8,9, ללא ספק חיסול ישיר של נוגדנים מזיקים אלה יהיה להתקדם התערבויות.
לאחרונה, מולקולות DCAF אשר בעלי פונקציונליות כפולה, פותחו עבור נוגדנים ממוקד חסימת10. Dcaf הוא פפטיד ארוך המורכב מ 3 חלקים: 1) חלק אנטיגן שיכול ספציפי לזהות את הנוגדן קנצוני, 2) fc-iii או השלישי-4c תג עבור מחייב מאוד את האזור fc של נוגדן לעכב או קולטן fc או המשלים חלבונים רכיב , 3) מקשר ארוך α-helical המעלה את שתי הקבוצות האלה פונקציונלי10. החלק המקשר, שתוכנן מתחום מוסין FERM, היה ממוטב על ידי תוכנת Rosseta כדי להבטיח את החלק אנטיגן ו-Fc-III חלק במולקולה DCAF יכול לאגד את האזורים Fab ו Fc של IgG בו. ארבעה מולקולות DCAF יש כבר מסונתז ליעד 4 נוגדנים שונים, ביניהם DCAF1 השתמשו כדי לחסל את הנוגדן 4G2, אשר הוא נוגדן חוצה תגובתי במהלך זיהום DENV לתרום לאפקט ADE; ו DACF4 נועד להצלת קולטני אצטילכולין ידי חסימת mab35 נוגדן במיאסטניה גרביס10.
במחקר הנוכחי, נלקח DCAF1 כדוגמה, הצגנו את הפרוטוקולים לסינתזה של מולקולה dcaf ואת הזיהוי של האינטראקציה בין dcaf ו נוגדן קנצוני שלה. הDCAF1 הוא מסונתז למחצה על ידי הגישה משנת11,12,13,14, אשר מעלה באוב את נגזרות הידראזין של פפטיד Fc-III ואת החלקים מתבטא-אנטיגן ביחד. הגישה NCL יש יתרונות משמעותיים על גבי סינתזה כימית מלאה ביטוי מלא רקומביננטי עבור סינתזה DCAF1, כי שתי שיטות אלה להוביל תשואה נמוכה ועלות גבוהה. הגישה הנוכחית היא לא רק הדרך החסכונית ביותר כדי לקבל את DCAF באורך מלא, אבל גם יכול לשמור על היווצרות של חלק המקשר דומה לצורתו הטבעית. מאז שונים מולקולות dcaf יש רצפים דומים למעט החלקים אנטיגן, השיטות שלנו לסינתזה DCAF1 ואת הקושי האינטראקציה בין DCAF1 ו 4g2 נוגדן ניתן להחיל מולקולות אחרות dcaf כדי ממוקדות לחסום נוגדנים קנצוני שלהם גם.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Chlorotrityl resin</td>
			<td>Tianjin Nankai HECHENG S&#38;T</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>503236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4G2 antibody</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MA5-24387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-mercaptophenylacetic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>H27658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plates</td>
			<td>NEST</td>
			<td>701001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A955</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgOAc</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30164324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GST antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>AE001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076P2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis bag</td>
			<td>Sbjbio</td>
			<td>SBJ132636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80047360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethyl ether</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10009318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH Sepharose</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30095516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrazine hydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80070418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10011018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>12399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-Thiogalactoside</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>5502-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A456</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>90600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>8100771933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide BEH C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piperidine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80104216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Extraction Kit</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B611253-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAexpress Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>32149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>20040718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10020018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;chloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Fmoc-protected amino acids</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilizing pot</td>
			<td>Tomy</td>
			<td>SX-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO Protease</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12588018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stop solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen</td>
			<td>Taihe Biotechnology Compay</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB reagent</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>421101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>91100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>T107252-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 HPLC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>YUHUA</td>
			<td>SHZ-95B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>IVGN0086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)

חיסול של נוגדנים מזיקים מאורגניזמים הוא גישה רבת ערך להתערבות של מחלות הקשורות נוגדן, כגון קדחת דנגה מדמם ומחלות אוטואימוניות. מאחר שאלפי נוגדנים בעלי אפיסקופים שונים מסתובבים בדם, אין שיטה אוניברסלית, למעט המשלים הדו-תפקודי של הפפטיד האנטי-גניים ו-Fc-III (DCAF), דווחה כדי למקד את הנוגדנים המזיקים הספציפיים. הפיתוח של מולקולות DCAF הופכת תרומה משמעותית להתקדמות של טיפול ממוקד, אשר הוכחו לחסל את ההשפעה שיפור הנוגדן (ADE) אפקט של נגיף דנגה (DENV) זיהום המודל כדי להגביר את אצטילכולין הקולטן פעילות במודל מיאסטניה גרביס. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לסינתזה של מולקולה DCAF (DCAF1), אשר ניתן באופן סלקטיבי לחסום נוגדן 4G2 כדי להחליש את אפקט ADE במהלך זיהום וירוס דנגה, ולהמחיש את הכריכה של DCAF1 כדי 4G2 נוגדן על ידי שיטת אליסה. בשיטה שלנו, DCAF1 הוא מסונתז על ידי הקוניוגציה של נגזרת של הידראזין של פפטיד Fc-III ו רקומביננטי הביע לאורך α-סליל עם רצף אנטיגניים באמצעות הקשר הכימי המקורי (NCL). פרוטוקול זה הוחל בהצלחה על DCAF1, כמו גם מולקולות אחרות של dcaf לצורך התמקדות נוגדנים קנצוני שלהם.

תרשים הזרימה של תוואי הסינתזה על-ידי הארכה כימית מקורית במאמר זה מוצג באיור 1. דמויות 2-6 מציגות את כרומטוגרמות (A) וספקטרום מסה (ב) של נגזרות כימיות מסונתז הידראזין של פפטיד Fc-III, רקומביננטי הביע מקשר וחלק אנטיגן, המוצר הטהור מתגובת ncl, הטוהר מוצר מתג...

Watch this Scientific Journal Video about Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF at JoVE.com

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

פיתוח של המשלים כפול תפקודית של פפטיד אנטיגניים ו-Fc-III mimetics (DCAF) הוא הרומן לחיסול של נוגדנים מזיקים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לסינתזה של מולקולה DCAF1, אשר יכול באופן סלקטיבי לחסום נוגדן 4G2 כדי לחסל את ההשפעה התלויה נוגדן שיפור במהלך זיהום וירוס דנגה.

נוגדנים ממוקד חסימה על ידי המשלים כפול תפקודית של פפטיד Antigenic ו-השלישי מימטיקה (בית קפה)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...

זה עשוי לשמש כדי לעזור לענות על שאלות מפתח על איך לסנתז מולקולות DCAF עם נטרול נוגדנים ממוקד. טכניקה זו מספקת את הדרך הפשוטה ביותר לסנתז את מולקולות DCAF עם פרודוקטיביות גבוהה. העולם מחליט שלמולקולות DCAF יש את ההתערבויות הפוטנציאליות לנוגדן בעסקאות עם מחלות כמו קדחת דנגה ומיאסתניה גרוויס.שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מולקולות DCAF אחרות עם אפיטופים שונים כדי למקד את נוגדני הקוגניציה. הדגמת ההליך תהיה שו באי, טכנאי בכיר מהמעבדה שלי. כדי להמיר 2-כלור שדון הידראזין נגזר 2-כלור שדון, מהחלק העליון של כלי סינתזת פפטיד, להוסיף חמישה מיליליטר של DMF כדי 0.25 מילימולים של 2-כלור שדון.שים את הכובע בחזרה על, בעדינות לנער את הכלי במשך 15 שניות, ולאחר מכן לנקז אותו על דוכן ברזל. חזור על שטיפת DMF פעמיים נוספות. לאחר מכן להוסיף חמישה מיליליטר של DCM לכלי, לשים את הכובע בחזרה על, בעדינות לנער את הכלי במשך 15 שניות, ולאחר מכן לנקז אותו על דוכן ברזל.חזור על שטיפת DCM פעמיים נוספות ולאחר מכן חזור על שטיפת DMF שלוש פעמים נוספות. לאחר מכן, להוסיף שישה מיליליטר של 50% ריכוז נפח של DMF מעל DCM כדי להתנפח אתשרף במשך 30 דקות ולאחר מכן לנקז אותו. עכשיו להעביר שישה מיליליטר של 5% ריכוז נפח של הידראזין ו DMF לכלי התגובה.מניחים אותו על השייקר ב 120 סל"ד ו 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ולאחר מכן לנקז את הפתרון על ידי משאבת ואקום. כדי לטהר את הנגזרת ההידראזינית של פפטיד Fc-III, השתמש במערכת HPLC כדי לטהר את הפפטיד באלסטיון שיפוע של 30 דקות בקצב זרימה של מיליליטר לדקה. לאחר טיהור חלבון על פי כתב היד, להוסיף לתוך צינור חדש שני מיליליטר של מיליגרם אחד למיליליטר SUMO מתויג חלבון, מיליליטר אחד של SUMO פרוטאז, מיליליטר אחד של חיץ פרוטאז 10X SUMO, ושישה מיליליטר של מים מזוקקים כפולים כדי להכין את פתרון התגובה.דגירה את התערובת במשך 12 עד 16 שעות בארבע מעלות צלזיוס. ואז aliquot את התערובת לשמונה 1.5 צינורות Eppendorf מיליליטר, ו צנטריפוגה את התערובת ב 15, 000 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השתמש pipet כדי להשליך את הצבירה בתחתית, ולאחר מכן לתוך 10 מיליליטר פינה supernatants, להוסיף 0.5 מיליליטר של תרחיף 50% ניקל NTA חרוזים ב 50 מילימולאר PBS.מניחים את הצינור בשייקר סיבובי ב 200 סל"ד וארבע מעלות צלזיוס לערבב בעדינות במשך 60 דקות. לאחר מכן, לטעון את lisade ואת תערובת ניקל NTA לתוך עמודה עם מכסה שקע התחתון. הסר את המכסה התחתון ולשמור את הזרימה דרך לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.חלבון סומו התג שלו מחייב בעמודה. החלק אנטיגן מקשר, אשר מתחיל עם חבר העמים לתגובת קשירה כימית מקורית, הוא בזרימה דרך. עכשיו משקל 1.8 מיליגרם של נגזרת הידראזין של פפטיד Fc-III לתוך צינור Eppendorf שני מיליליטר ולהוסיף 0.8 מיליליטר של שישה כלוריד guanidinium טוחנות ב 0.2 פתרון מונוסודיום פוספט טוחנות ב pH 3.מערבולת כדי להמיס את האבקה. לאחר צנטריפוגה הצינור ב 7, 200 פעמים G במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר להעביר את supernatant לתוך צינור חדש. מוסיפים בר ערבוב בצינור ומכניסים את הצינור לאמבט מלח קרח על תוך ערבוב מגנטי כדי להתסיס בעדינות את הפתרון במשך 15 דקות.לאחר מכן להוסיף 40 microliters של 0.5 נתרן ניטריס טוחן לפתרון כדי לחמצן את הקבוצה הידראזין. בעדינות להתסיס את הפתרון עוד 15 דקות באמבט מלח קרח. לשקול ב 11 מיליגרם של HPLC מטוהרים להקפיא חלק אנטיגן מקשר מיובש, ו 13.6 מיליגרם של MPAA לתוך צינור התגובה באמבט מלח קרח.מערבבים במשך חמש דקות ולאחר מכן להתאים את ערך ה- pH ל 6.8 עד 7.0 בחדר ממוזג עם שישה נתרן הידרוקסיד טוחן. השלב הקריטי ביותר עבור קשירה כימית מקורית היא להתאים את ערך ה- pH בזהירות כדי ליזום את תגובת הקשירה. לאחר 12 שעות באמבט מלח הקרח, מוסיפים 0.4 מיליליטר של 0.1 פתרון ניטרלי TCEP טוחן למערכת התגובה, ומערבבים במשך 20 דקות כדי לסיים את התגובה.לאחר צנטריפוגה וטיהור HPLC, השג את שיא ההצדעה השלישי לדסולפוריזציה. ממיסים אותו ב 50 microliters של שישה גואנידיניום כלוריד טוחן בתמיסת מונוסודיום פוספט טוחן 0.2. לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטרים של TCEP טוחן אחד, 10 מיקרוליטרים של tert-Butylthiol, וחמישה מיקרוליטרים של 0.1 VAO טוחן לארבעה פתרוןים.התאימו את ה-pH הסופי של הפתרון ל-6.9 ושמור את הפתרון על 37 מעלות צלזיוס על שייקר למשך כחמש שעות. צנטריפוגה ולטהר שוב. ממיסים את הפפטיד המוכן ב-200 מיקרוליטר של אצטט כסף 32 מילימולרים, ואז מערבבים את תערובת התגובה בטמפרטורת החדר במשך ארבע שעות.כדי להמיר את thiolates כסף על פפטיד כדי thiols חינם, להוסיף שלושה microliters של DTT טוחנת אחת בשישה כלוריד guanidinium טוחנת, ו 0.2 מונוסודיום פוספט טוחנת ב pH 7. הפעילו את ספקטרומטר המסה במצב סריקה מלא והגדירו את טווח ה-m/z על 300 עד 2,000 ורזולוציה של 60,000. פתח את נתוני ספקטרום המסה ולמצוא את פסגות המוצר בכל שלב כדי לאשר את התגובה הכימית מבוצעת בהצלחה.כדי לבצע בדיקת ELISA של האינטראקציה בין נוגדן DCAF1 ו- 4G2, מצפים כל באר של צלחת מיקרוטיטר 96 באר עם picomole אחד של נוגדן נגד GST ב 100 microliters של חיץ ציפוי. לאטום את הצלחת עם קלטות איטום דגירה אותו ב 4 מעלות צלזיוס לילה על שייקר. בבוקר לחסום כל באר עם 200 microliters של 1%BSA ו PBS.לאטום את הצלחת ולהדרגר אותו חדר ממוזג במשך שעה על שייקר. לאחר מכן השתמש PBS עם 0.05% Tween 20 לשטוף כל באר ארבע פעמים. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בשיטת הרצועה הכימית המקורית לסינתזה למחצה של מולקולת DCAF1.ספקטרום המסה מראה שלמולקולת DCAF1 הסופית יש משקל מולקולרי דה-קונבנציונלי של 11, 053. במהלך בדיקת ELISA, אנטיגן פפטיד Fc-III ו DCAF1 באופן תחרותי לעכב 4G2 נוגדן מחייב. הן אנטיגן פפטיד ו DCAF1 חסם באופן משמעותי 4G2 מחייב ואילו פפטיט Fc-III לא השפיע על האינטראקציה נוגדן אנטיגן.לאחר התפתחות זו, טכניקה זו סללה את הדרך להתערבות של מחלות הקשורות לנוגדנים מזיקים. לוט של האזורים המשמשים לסינתזת פפטיד ו קשירה כימית מקורית הם רעילים מאוד. הקפד לקחת את הניסויים האלה בשכונה הכימית שלך.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

התגברות על חוסר התגובה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis (EAE) זנים עמידים עכבר ידי העברת המאמצת אתגר אנטיגני

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

ניתוח של CD8 וירוס ספציפי החיסוני Simian<sup&gt; +</sup&gt; T-התאים קופי רזוס ידי פפטיד-MHC-I tetramer מכתים

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

זרימה Virometry לנתח אנטיגני ספקטרה של virions ואת תאי שלפוחית

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murine לימפוציטים תיוג ידי<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-נוגדן קולטן מיקוד עבור<em&gt; In vivo</em&gt; סחר Cell על ידי PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

פפטיד סריקה בסיוע זיהוי של epitope B-cell חד שבטי נוגדן-מוכר לינארי

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

מבחני מדידת שפעת בנטרול תגובות נוגדנים וירוסים A(H3N2) סרה האנושי על-ידי Microneutralization באמצעות תאים MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

שיטה של מטוסי אף-16 יישוב רצף של דגימות חלב

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

ליפוזומים antigenic לדור של נוגדנים מחלות ספציפיות

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

זיהוי של נוגדנים אנושיים Repertoires על ידי הדור הבא רצפי של עכבר

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...