Name: targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)
Uploaded: 2019-09-17T13:30:00
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Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla Tsinghua University-Gates Foundation (n. OPP1021992), la National Natural Science Foundation of China (n. 21502103, 21877068 e 041301475), e il National Key Research and Development Program of China (n. 2017YFA0505103).

1. Sintesi chimica del derivato dell'idzina di un peptide Fc-III
<ol><li>Conversione della resina 2-Cl-(Trt)-Cl in resina 2-Cl-(Trt)-NHNH2
	<ol>
<li>Pesare 625 mg di resina 2-Cl-(Trt)-Cl (0,25 mmol) in un recipiente di sintesi peptide da 25 ml.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di N,N-dimethylformamide (DMF) alla resina dalla parte superiore del vaso, mettere il tappo indietro, scuotere delicatamente il vaso per 15 s e quindi scolarlo. Ripetere il lavaggio DMF per altre due volte.</li>
		<li>Aggiun...

<ol>
	<li>Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Physiology (4th ed.). , (2003).</li><li>Halstead, S. B., O&#8217;Rourke, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-enhanced+dengue+virus+infection+in+primate+leukocytes.">Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes.</a> Nature. 265, 739-741 (1977).</li><li>Gammon, G., Sercarz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+some+T+cells+escape+tolerance+induction.">How some T cells escape tolerance induction.</a> Nature. 342, 183-185 (1989).</li><li>Takada, A., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-dependent+enhancement+of+viral+infection:+molecular+mechanisms+and+in+vivo+implications.">Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications.</a> Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).</li><li>Boonnak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Dendritic+Cells+in+Antibody-Dependent+Enhancement+of+Dengue+Virus+Infection.">Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection.</a> Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).</li><li>Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis+-+autoantibody+characteristics+and+their+implications+for+therapy.">Myasthenia gravis - autoantibody characteristics and their implications for therapy.</a> Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).</li><li>Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis:+past,+present,+and+future.">Myasthenia gravis: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).</li><li>Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+a+dengue+vaccine.">Progress towards a dengue vaccine.</a> The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).</li><li>Vikas, K., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+Myasthenia+Gravis.">Treatment of Myasthenia Gravis.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+dual-functional+conjugate+of+antigenic+peptide+and+Fc-III+mimetics+(DCAF)+for+targeted+antibody+blocking.">Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking.</a> Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).</li><li>Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+taylor-aris+dispersion+for+measurement+of+a+solute+diffusion+coefficient+in+thin+capillaries.">Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries.</a> Science. 266, 773-776 (1994).</li><li>Fang, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+chemical+synthesis+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).</li><li>Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+chemical+synthesis+of+proteins+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).</li><li>Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+proteins+using+peptide+hydrazides+as+thioester+surrogates.">Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates.</a> Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).</li></ol>

Il protocollo qui descrive la semisintesi e il rilevamento di DCAF1 utilizzando l'approccio NCL, come illustrato nella Figura 1. In breve, i due frammenti di DCAF1 sono sintetizzati chimicamente e ricombinantemente espressi, rispettivamente; quindi, la molecola DCAF1 di intera lunghezza viene assemblata, modificata e purificata. Per la sintesi del frammento fc-III derivato da idzina, l'utilizzo di resina a 2 Cl a bassa capacità è molto importante, perché l'alta capacità ha un effetto neg...

Gli anticorpi svolgono un ruolo importante nella risposta immunitaria umorale per la neutralizzazione di batteri e virus patogeni1. Tuttavia, alcuni anticorpi presentano impatti nocivi per gli organismi, come anticorpi cross-reattivi nell'effetto ADE durante l'infezione Da DENV e anticorpi sovrareattivi nella mioasthenia gravis, che è una malattia autoimmune2,3. L'effetto ADE è mediato dagli anticorpi cross-reattivi che rendono il ponte per collegare DENV e il recettore Fc presentando le cellule4,5, mentre la mioastenia gravis è causata dagli anticorpi eccessivi che attaccano i recettori dell'acetilcolina tra le giunzioni cellule-cellule nel tessuto muscolare6,7. Sebbene siano stati sviluppati approcci parzialmente efficaci per il trattamento di queste malattie8,9, senza dubbio l'eliminazione diretta di questi anticorpi nocivi farebbe progressi per gli interventi.
Recentemente, le molecole DCAF, che hanno gruppi dual-funzionali, sono state sviluppate per il blocco mirato degli anticorpi10. DCAF è un lungo peptide composto da 3 parti: 1) una parte dell'antigene in grado di riconoscere specifiche le sostanze anticorpi cognati, 2) un tag Fc-III o Fc-III-4C per legare fortemente alla regione Fc dell'anticorpo per inibire il recettore Fc o proteine componenti del complemento , 3) un lungo linker con elica a z che coniuga questi due gruppi funzionali10. La parte del linker, progettata dal dominio Moesin FERM, è stata ottimizzata dal software Rosseta per garantire che la parte antigene e la parte Fc-III in una molecola DCAF possano legarsi contemporaneamente alle regioni Fab e Fc di IgG. Quattro molecole DCAF sono state sintetizzate per colpire 4 diversi anticorpi, tra cui DCAF1 è stato utilizzato per eliminare l'anticorpo 4G2, che è un anticorpo cross-reattivo durante l'infezione da DENV per contribuire all'effetto ADE; e DACF4 è stato progettato per il salvataggio dei recettori dell'acetilcolina bloccando l'anticorpo mab35 in myasthenia gravis10.
Nel presente studio, preso DCAF1 come esempio, abbiamo mostrato i protocolli per la sintesi della molecola DCAF e la rilevazione dell'interazione tra una DCAF e il suo anticorpo cognato. La DCAF1 è semi-sintetizzata dall'approccio NCL11,12,13,14, che coniuga il derivato dell'iddrina di un peptide Fc-III e le parti linker-antigene espresse insieme. L'approccio NCL ha vantaggi significativi rispetto alla sintesi completamente chimica e all'espressione completamente ricombinante per la sintesi DCAF1, perché entrambi questi metodi portano a una bassa resa e ad un costo elevato. L'approccio attuale non è solo il modo più conveniente per ottenere l'intera lunghezza DCAF, ma può anche mantenere la conformazione della parte del linker simile alla sua forma nativa. Poiché diverse molecole DCAF hanno sequenze simili ad eccezione delle parti dell'antigene, i nostri metodi per la sintesi DCAF1 e l'analisi di interazione tra gli anticorpi DCAF1 e 4G2 possono essere applicati ad altre molecole DCAF per bloccare mirati anche i loro anticorpi cognati.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Chlorotrityl resin</td>
			<td>Tianjin Nankai HECHENG S&#38;T</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>503236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4G2 antibody</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MA5-24387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-mercaptophenylacetic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>H27658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plates</td>
			<td>NEST</td>
			<td>701001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A955</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgOAc</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30164324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GST antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>AE001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076P2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis bag</td>
			<td>Sbjbio</td>
			<td>SBJ132636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80047360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethyl ether</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10009318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH Sepharose</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30095516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrazine hydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80070418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10011018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>12399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-Thiogalactoside</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>5502-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A456</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>90600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>8100771933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide BEH C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piperidine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80104216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Extraction Kit</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B611253-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAexpress Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>32149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>20040718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10020018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;chloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Fmoc-protected amino acids</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilizing pot</td>
			<td>Tomy</td>
			<td>SX-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO Protease</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12588018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stop solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen</td>
			<td>Taihe Biotechnology Compay</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB reagent</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>421101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>91100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>T107252-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 HPLC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>YUHUA</td>
			<td>SHZ-95B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>IVGN0086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)

L'eliminazione di anticorpi nocivi dagli organismi è un approccio prezioso per l'intervento di malattie associate agli anticorpi, come la febbre emorragica dengue e le malattie autoimmuni. Poiché migliaia di anticorpi con epitopi diversi circolano nel sangue, nessun metodo universale, ad eccezione del coniugato dual-funzionale di peptidi antigenici e mimetici Fc-III (DCAF), è stato segnalato per colpire specifici anticorpi nocivi. Lo sviluppo di molecole DCAF dà un contributo significativo al progresso della terapia mirata, che sono stati dimostrati per eliminare l'effetto di miglioramento dipendente dagli anticorpi (ADE) in un modello di infezione del virus Dengue (DENV) e per aumentare l'acetilcolina l'attività recettore in un modello di myasthenia gravis. Qui, descriviamo un protocollo per la sintesi di una molecola DCAF (DCAF1), che può bloccare selettivamente l'anticorpo 4G2 per attenuare l'effetto ADE durante l'infezione da virus Dengue e illustrare il legame dell'anticorpo DCAF1-4G2 da un saggio ELISA. Nel nostro metodo, la DCAF1 è sintetizzata dalla coniugazione di un derivato idrossizzante di un peptide Fc-III e un ricombinante espresso lungo elicoia con sequenza antigenica attraverso la legatura chimica nativa (NCL). Questo protocollo è stato applicato con successo a DCAF1 e ad altre molecole DCAF per colpire i loro anticorpi cognati.

Il diagramma di flusso per il percorso di sintesi per legatura chimica nativa in questo articolo è illustrato nella Figura 1. Le figure 2-6 mostrano i cromatogrammi (A) e gli spettri di massa (B) del derivato di iddrina sintetizzato chimico di un peptide Fc-III, linker espresso ricombinante e parte dell'antigene, il prodotto purificato dalla reazione NCL, il purificato reazione di desulfurazione e del prodotto finale purificato DCAF1, rispe...

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Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

Lo sviluppo di un coniugato dual-funzionale di peptidi antigenici e mimetici Fc-III (DCAF) è nuovo per l'eliminazione di anticorpi nocivi. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la sintesi della molecola DCAF1, che può bloccare selettivamente l'anticorpo 4G2 per eliminare l'effetto di miglioramento dipendente dagli anticorpi durante l'infezione da virus Dengue.

Blocco mirato degli anticorpi da parte di un coniugato dual-funzionale di Peptide antigenico e mimetica Fc-III (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...

Questo potrebbe servire a rispondere a domande chiave su come sintetizzare le molecole DCAF con la neutralizzazione degli anticorpi mirati. Questa tecnica fornisce il modo più semplice per sintetizzare le molecole DCAF con un'alta produttività. Il mondo decide che le molecole DCAF hanno i potenziali interventi all'anticorpo in si occupa di malattie come la febbre dengue e la miastenia gravis.Questo metodo può essere applicato ad altre molecole DCAF con epitopi diversi per colpire gli anticorpi affini. A dimostrare la procedura sarà Xue Bai, un tecnico senior del mio laboratorio. Per convertire la resina 2-cloro in resina di 2 cloro derivata dall'idrazina, dalla parte superiore del contenitore di sintesi peptidica, aggiungere cinque millilitri di DMF agli 0,25 millimoli di resina 2-cloro.Riposizionare il cappuccio, scuotere delicatamente il recipiente per 15 secondi e quindi scolarlo su un supporto di ferro. Ripetere il lavaggio DMF altre due volte. Quindi aggiungere cinque millilitri di DCM al recipiente, rimettere il cappuccio, scuotere delicatamente il recipiente per 15 secondi e quindi scolarlo su un supporto di ferro.Ripetere il lavaggio DCM altre due volte, quindi ripetere il lavaggio DMF altre tre volte. Successivamente, aggiungere sei millilitri di concentrazione del 50% in volume di DMF su DCM per gonfiare la resina per 30 minuti e quindi scolarla. Ora trasferisci sei millilitri di concentrazione del 5% di volume di idrazina e DMF sul recipiente di reazione.Posizionarlo sullo shaker a 120 giri/min e 30 gradi celsius per 30 minuti, quindi scolare la soluzione con pompa per vuoto. Per purificare la derivata idrazina di un peptide Fc-III, utilizzare il sistema HPLC per purificare il peptide con un'eluizione di allusione gradiente di 30 minuti ad una portata di un millilitro al minuto. Dopo la purificazione delle proteine secondo il manoscritto, aggiungere in un nuovo tubo due millilitri di un milligrammo per millilitro proteina taggata SUMO, un millilitro di proteasi SUMO, un millilitro di tampone di proteasi SUMO 10X e sei millilitri di acqua doppia distillata per preparare la soluzione di reazione.Incubare la miscela per 12-16 ore a quattro gradi Celsius. Quindi aliquotare la miscela in otto tubi Eppendorf da 1,5 millilitri e centrifugare la miscela a 15.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi celsius. Utilizzare una pipetta per scartare gli aggregati nella parte inferiore, quindi nei supernaganti cancellati da 10 millilitri, aggiungere 0,5 millilitri del liquame di perline NTA al 50% di nichel in PBS da 50 millimolare.Posizionare il tubo su uno shaker rotante a 200 giri/min e quattro gradi celsius per mescolare delicatamente per 60 minuti. Quindi, caricare la lisade e la miscela di nichel NTA in una colonna con il tappo di uscita inferiore. Rimuovere il cappuccio inferiore e salvare il flusso attraverso un tubo di centrifuga da 15 millilitri.La proteina HIS TAG SUMO si lega sulla colonna. La parte antigene del linker, che inizia con la CSI per la reazione di legatura chimica nativa, è nel flusso attraverso. Ora pesa 1,8 milligrammi di derivato dell'idrazina di un peptide Fc-III in un tubo Eppendorf a due millilitri e aggiungi 0,8 millilitri di cloruro di guanidinio molare in soluzione di fosfato monosodico molare a pH 3.Vortice per sciogliere la polvere. Dopo aver centrifugato il tubo a 7.200 volte G per un minuto a temperatura ambiente, trasferire il supernatante in un nuovo tubo. Aggiungere una barra di agitazione nel tubo e mettere il tubo in un bagno di sale ghiacciato su un agitatore magnetico per agitare delicatamente la soluzione per 15 minuti.Quindi aggiungere 40 microlitri di nitrito di sodio molare 0,5 alla soluzione per ossidare il gruppo dell'idrazina. Agitare delicatamente la soluzione per altri 15 minuti nel bagno di sale ghiacciato. Pesare 11 milligrammi della parte antigene del linker purificato e liofilizzato HPLC e 13,6 milligrammi di MPAA nel tubo di reazione nel bagno di sale ghiacciato.Mescolare per cinque minuti e quindi regolare il valore del pH a 6,8 a 7,0 a temperatura ambiente temperata con sei idrossido di sodio molare. Il passo più critico per la legatura chimica nativa è quello di regolare attentamente il valore del pH per avviare la reazione di legatura. Dopo 12 ore nel bagno di sale ghiacciato, aggiungere 0,4 millilitri di soluzione neutra TCEP molare al sistema di reazione e mescolare per 20 minuti per terminare la reazione.Dopo la centrifugazione e la purificazione HPLC, ottenere il picco coniugato III per la desolforazione. Sciogliere in 50 microlitri di cloruro di guanidinio molare in soluzione di fosfato monosodico molare 0,2. Aggiungere quindi 50 microlitri di un TCEP molare, 10 microlitri di tert-butiltiolo e cinque microlitri di VAO molare 0,1 per quattro soluzioni.Regolare il pH finale della soluzione a 6,9 e mantenere la soluzione a 37 gradi Celsius su uno shaker per circa cinque ore. Centrifugare e purificare di nuovo. Sciogliere il peptide preparato in 200 microlitri di acetato d'argento millimolare, quindi mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente per quattro ore.Per convertire i tiolati d'argento sul peptide in tioli liberi, aggiungere tre microlitri di un DTT molare in sei cloruro di guanidinio molare e 0,2 fosfato monosodico molare a pH 7. Aziona lo spettrometro di massa in modalità di scansione completa e imposta l'intervallo m/z da 300 a 2.000 e la risoluzione a 60.000. Aprire i dati degli spettri di massa e trovare i picchi del prodotto in ogni fase per confermare che la reazione chimica viene eseguita con successo.Per eseguire il test ELISA dell'interazione tra anticorpo DCAF1 e 4G2, rivestire ogni pozzo di una piastra di microtitolo da 96 porri con un picomolo di anticorpo anti-GST in 100 microlitri di tampone di rivestimento. Sigillare la piastra con nastri di tenuta e incubarla a 4 gradi Celsius durante la notte su uno shaker. Al mattino bloccare ogni bene con 200 microlitri di 1%BSA e PBS.Sigillare il piatto e incubarlo in camera temperata per un'ora su uno shaker. Quindi utilizzare PBS con 0,05%Tween 20 per lavare ogni bene quattro volte. In questo protocollo è stato utilizzato il metodo di legatura chimica nativa per la semisintesi della molecola DCAF1.Lo spettro di massa mostra che la molecola finale di DCAF1 ha un peso molecolare deconvoluzionale di 11.053. Durante il test ELISA, il peptide antigene Fc-III e DCAF1 inibiscono in modo competitivo il legame anticorpale 4G2. Sia il peptide antigene che il DCAF1 bloccarono significativamente il legame 4G2, mentre il peptite Fc-III non influenzò l'interazione dell'anticorpo antigene.Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada a un intervento di malattie dannose associate agli anticorpi. Molte delle regioni utilizzate per la sintesi peptidica e la legatura chimica nativa sono altamente tossiche. Assicurati di fare questi esperimenti nella tua cappa chimica.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Superare blocco nel encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) ceppi di topi resistenti dal trasferimento adottivo e uno stimolo antigenico

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Misurare Influenza neuraminidasi Inibizione anticorpo I titoli da Enzyme-linked lectina Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

L&#39;analisi dei Simian Immunodeficiency Virus specifici CD8<sup&gt; +</sup&gt; T-cellule in Rhesus macachi di peptide-MHC-I Tetramero colorazione

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Flusso Virometry per analizzare antigenica spettri di virioni e extracellulare vescicole

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murino linfociti Etichettatura da<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-anticorpo recettore Targeting per<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Traffico da PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

Identificazione di un Epitopo Lineare B-cell monoclonale riconosciuto Peptide scansione-assistito

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizzando le risposte dell'anticorpo al virus A(H3N2) in sieri umani di Microneutralization l'Influenza di misurazione analisi utilizzando cellule MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Un metodo per il sequenziamento del 16S mirato di campioni di latte umano

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Liposomi antigenici per la generazione di anticorpi specifici per la malattia

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

Identificazione dei Mouse e dei repertori di anticorpo umano mediante sequenziamento di nuova generazione

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...