Name: targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)
Uploaded: 2019-09-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF at JoVE.com

이 작품은 칭화 대학 - 게이츠 재단 (아니. OPP1021992), 중국 국립 자연 과학 재단 (번호 21502103, 21877068 및 041301475), 그리고 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (번호 2017YFA0505103).

1. Fc-III 펩타이드의 히드라진 유도체의 화학적 합성
<ol><li>2-Cl-(Trt)-Cl 수지 2-Cl-(Rt)-NHNH2 수지로 변환
	<ol>
<li>25 mL 펩티드 합성 용기에 2-Cl-(Trt)-Cl 수지(0.25 mmol)의 625 mg을 계량합니다.</li>
		<li>5 mL의 N,N-디메틸 포름 아미드 (DMF)를 용기 의 상단에서 수지에 넣고 캡을 다시 넣고 용기를 부드럽게 흔들어 15 s용 용기를 흔들어 배수하십시오. DMF 세척을 두 번 더 반복합니다.</li>
		<li>용?...

<ol>
	<li>Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Physiology (4th ed.). , (2003).</li><li>Halstead, S. B., O&#8217;Rourke, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-enhanced+dengue+virus+infection+in+primate+leukocytes.">Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes.</a> Nature. 265, 739-741 (1977).</li><li>Gammon, G., Sercarz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+some+T+cells+escape+tolerance+induction.">How some T cells escape tolerance induction.</a> Nature. 342, 183-185 (1989).</li><li>Takada, A., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-dependent+enhancement+of+viral+infection:+molecular+mechanisms+and+in+vivo+implications.">Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications.</a> Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).</li><li>Boonnak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Dendritic+Cells+in+Antibody-Dependent+Enhancement+of+Dengue+Virus+Infection.">Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection.</a> Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).</li><li>Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis+-+autoantibody+characteristics+and+their+implications+for+therapy.">Myasthenia gravis - autoantibody characteristics and their implications for therapy.</a> Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).</li><li>Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis:+past,+present,+and+future.">Myasthenia gravis: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).</li><li>Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+a+dengue+vaccine.">Progress towards a dengue vaccine.</a> The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).</li><li>Vikas, K., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+Myasthenia+Gravis.">Treatment of Myasthenia Gravis.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+dual-functional+conjugate+of+antigenic+peptide+and+Fc-III+mimetics+(DCAF)+for+targeted+antibody+blocking.">Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking.</a> Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).</li><li>Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+taylor-aris+dispersion+for+measurement+of+a+solute+diffusion+coefficient+in+thin+capillaries.">Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries.</a> Science. 266, 773-776 (1994).</li><li>Fang, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+chemical+synthesis+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).</li><li>Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+chemical+synthesis+of+proteins+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).</li><li>Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+proteins+using+peptide+hydrazides+as+thioester+surrogates.">Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates.</a> Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).</li></ol>

여기서 프로토콜은 도 1에도시된 NCL 접근법을 사용하여 DCAF1의 반합성 및 검출에 대해 설명한다. 간략하게, DCAF1의 두 단편은 각각 화학적으로 합성되고 재조합적으로 발현되는; 그런 다음, 전체 길이 DCAF1 분자가 조립, 변형 및 정제된다. 히드라진 유래 Fc-III 단편 합성의 경우, 고용량이 히드라진 생성에 부정적인 영향을 미치고 제품의 낮은 수율을 유도하기 때문에 저용량 2-C...

항체는 병원성 박테리아 및 바이러스의 중화에 대한 체액 면역 반응에 중요한 역할을 한다1. 그러나, 일부 항체는 자가면역 질환인 중증근무증에서 DENV 감염 및 과민반응성 항체 동안 ADE 효과에서 교차 반응성 항체와 같은 유기체에 유해한 영향을 나타낸다2,3. ADE 효과는 DENV와 Fc 수용체 제시 세포를 연결하는 다리를 만드는 교차 반응성 항체에 의해 매개되는반면,중증근무력증은 아세틸콜린 수용체를 공격하는 과도한 항체에 의해 유발됩니다. 근육 조직에 있는 세포 세포 접합 사이6,7. 부분적으로 효과적인 접근법이 이 질병을 취급하기 위하여 개발되었더라도8,9,의심할 여지없이 이러한 유해한 항체의 직접적인 제거는 내정간섭을 위한 진전을 만들 것입니다.
최근에는 이중 작용기가 있는 DCAF 분자가 표적 항체 차단10을위해 개발되었다. DCAF는 3부분으로 구성된 긴 펩티드이다: 1) 코그네이트 항체를 특이하게 인식할 수 있는 항원 부분, 2) Fc-III 또는 Fc-III-4C 태그는 Fc 수용체 또는 보체 성분 단백질중 하나를 억제하기 위해 항체의 Fc 영역에 강하게 결합한다. , 3) 이들 두 기능성그룹(10)을접합하는 긴 α-헬리칼 링커. Moesin FERM 도메인에서 설계된 링커 부품은 로세타 소프트웨어에 의해 최적화되어 DCAF 분자의 항원 부분과 Fc-III 부품이 IgG의 팹 및 Fc 영역에 동시에 결합할 수 있도록 합니다. 4개의 DCAF 분자가 4개의 상이한 항체를 표적으로 하기 위해 합성되었고, 그 중DCAF1은 4G2 항체를 제거하는데 사용되었으며, 이는 DENV 감염 동안 교차 반응성 항체가 ADE 효과에 기여한다; 및 DACF4는 중증 근무력증10에서mab35 항체를 차단하여 아세틸콜린 수용체의 구조를 위해 설계되었습니다.
본 연구에서, 예로서 DCAF1을 촬영, 우리는 DCAF 분자의 합성 및 DCAF와 그의 동체 항체 사이의 상호 작용의 검출을위한 프로토콜을 보여 주었다. DCAF1은 NCL 접근법11,12,13,14에의해 반합성되며, 이는 Fc-III 펩타이드 및 발현된 링커-항원 부분의 히드라진 유도체를 함께 접합한다. NCL 접근법은 이러한 두 방법 모두 낮은 수율 및 높은 비용으로 이어지기 때문에 DCAF1 합성을 위한 완전 화학적 합성 및 완전 재조합 발현에 비해 상당한 이점이 있다. 현재의 접근 방식은 전체 길이 DCAF를 얻는 가장 비용 효율적인 방법일 뿐만 아니라 링커 부품의 형태를 기본 형태와 유사하게 유지할 수 있습니다. 상이한 DCAF 분자는 항원 부품을 제외한 유사한 서열을 갖기 때문에, DCAF1 과 4G2 항체 사이의 DCAF1 합성 및 상호작용 분석법을 위한 우리의 방법은 그들의 코그네이트 항체를 표적화하기 위해 다른 DCAF 분자에도 적용될 수 있다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Chlorotrityl resin</td>
			<td>Tianjin Nankai HECHENG S&#38;T</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>503236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4G2 antibody</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MA5-24387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-mercaptophenylacetic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>H27658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plates</td>
			<td>NEST</td>
			<td>701001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A955</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgOAc</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30164324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GST antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>AE001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076P2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis bag</td>
			<td>Sbjbio</td>
			<td>SBJ132636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80047360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethyl ether</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10009318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH Sepharose</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30095516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrazine hydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80070418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10011018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>12399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-Thiogalactoside</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>5502-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A456</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>90600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>8100771933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide BEH C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piperidine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80104216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Extraction Kit</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B611253-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAexpress Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>32149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>20040718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10020018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;chloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Fmoc-protected amino acids</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilizing pot</td>
			<td>Tomy</td>
			<td>SX-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO Protease</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12588018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stop solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen</td>
			<td>Taihe Biotechnology Compay</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB reagent</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>421101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>91100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>T107252-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 HPLC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>YUHUA</td>
			<td>SHZ-95B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>IVGN0086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)

유기체에서 유해한 항체의 제거는 뎅기열 출혈열 및 자기 면역 질병과 같은 항체 관련 질병의 개입을 위한 귀중한 접근입니다. 상이한 에피토프를 가진 수천 개의 항체가 혈액에서 순환하기 때문에, 항원 펩타이드 및 Fc-III 모방제(DCAF)의 이중 기능적 컨쥬게이트를 제외한 보편적인 방법은 없으며, 특이적인 유해 항체를 표적으로 하는 것으로 보고되었다. DCAF 분자의 발달은 뎅기열 바이러스 (DENV) 감염 모델에서 항체 의존성 향상 (ADE) 효과를 제거하고 아세틸 콜린을 향상시키는 것으로 입증 된 표적 치료의 진행에 상당한 기여를합니다. 중증 근무모델의 수용체 활성. 여기서, 우리는 뎅기열 바이러스 감염 동안 ADE 효과를 감쇠시키기 위해 4G2 항체를 선택적으로 차단할 수 있는 DCAF 분자(DCAF1)의 합성을 위한 프로토콜을 설명하고, ELISA 분석에 의한 DCAF1 to 4G2 항체의 결합을 예시한다. 본 방법에서, DCAF1은 Fc-III 펩타이드의 히드라진 유도체의 컨쥬레이션에 의해 합성되고 재조합이 네이티브 화학 적 결찰(NCL)을 통해 항원 서열로 긴 α-나선을 발현한다. 이 프로토콜은 그들의 코그네이트 항체를 표적으로 하기 위한 DCAF1 및 그밖 DCAF 분자에 성공적으로 적용되었습니다.

이 문서에서 네이티브 화학 적 결찰에 의한 합성 경로에 대한 순서도는 그림 1에나와 있습니다. 도 2-6은 Fc-III 펩타이드의 화학적 합성 히드라진 유도체의 크로마토그램(A) 및 질량 스펙트럼(B)을 나타내며, 재조합 발현 링커 및 항원 부분, NCL 반응으로부터 정제된 생성물, 정제된 탈황 반응및 정제된 최종 제품 DCAF1로부터의 제품. 크로마?...

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Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

항원 펩타이드 및 Fc-III 모방제(DCAF)의 이중 기능성 컨쥬게이트 개발은 유해한 항체의 제거를 위한 새로운 것입니다. 여기서, 우리는 뎅기열 바이러스 감염 동안 항체 의존성 증강 효과를 제거하기 위해 4G2 항체를 선택적으로 차단할 수 있는 DCAF1 분자의 합성을 위한 상세한 프로토콜을 기술한다.

항원 펩타이드 및 Fc-III 모방제(DCAF)의 이중 기능 성 컨쥬게이트에 의한 표적 항체 차단

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...

이것은 표적으로 한 항체 중화와 DCAF 분자를 합성하는 방법에 관하여 중요한 질문에 대답하는 것을 돕도록 봉사할 수 있습니다. 이 기술은 높은 생산성으로 DCAF 분자를 합성하는 가장 간단한 방법을 제공합니다. 세계는 DCAF 분자가 뎅기열 과 근상증과 같은 질병을 다루는 항체에 잠재적인 내정간섭이 있다는 것을 결정합니다.이 방법은 톱니상 항체를 표적으로 하기 위하여 상이한 전형체를 가진 그밖 DCAF 분자에 적용될 수 있다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 수석 기술자 인 Xue Bai가 될 것입니다. 2-염소 수지를 펩타이드 합성 용기의 상단에서 2-염소 수지유래 수지로 변환하려면 2-염소 수지의 0.25 밀리몰에 DMF 5 밀리리터를 추가합니다.캡을 다시 켜고 15초 동안 부드럽게 용기를 흔들어 철판에 배출합니다. DMF 세척을 두 번 더 반복합니다. 그런 다음 배에 DCM 5 밀리리터를 넣고 캡을 다시 켜고 15초 동안 부드럽게 용기를 흔들어 철판에 배출합니다.DCM 세척을 두 번 더 반복한 다음 DMF 세척을 세 번 더 반복합니다. 다음으로 DCM에 DMF의 50% 부피 농도의 6밀리리터를 추가하여 30분 동안 수지를 팽창시키고 배수합니다. 이제 수드라진과 DMF의 5%의 부피 농도의 6밀리리터를 반응 용기로 이송합니다.셰이커에 120 RPM과 섭씨 30도에서 30분간 30분간 놓고 진공 펌프로 용액을 배출합니다. Fc-III 펩타이드의 수드라진 유도체를 정화하려면 HPLC 시스템을 사용하여 분당 1밀리리터의 유속으로 30분 그라데이션 용출으로 펩티드를 정화합니다. 원고에 따른 단백질 정제 후, 밀리리터 SUMO 태그 단백질 당 1 밀리그램의 새로운 튜브 2 밀리리터, SUMO 프로테아제 1밀리리터, 10X SUMO 프로테아제 버퍼 1밀리리터, 이중 증류수 6밀리리터를 추가하여 반응 용액을 준비합니다.4섭씨에서 12~16시간 동안 혼합물을 배양합니다. 그런 다음 혼합물을 8 개의 1.5 밀리리터 Eppendorf 튜브로 알리쿼트하고 혼합물을 섭씨 4도에서 10 분 동안 15, 000 배 G에서 원심 분리합니다. 파이펫을 사용하여 하단의 골재를 폐기한 다음 10 밀리리터 클리어 슈퍼나티에 넣고 50 밀리플러 PBS에 50% 니켈 NTA 비드 슬러리 0.5 밀리리터를 추가합니다.튜브를 회전 셰이커에 200 RPM과 섭씨 4도에 놓고 60분간 부드럽게 섞습니다. 다음으로, 리사데와 니켈 NTA 혼합물을 바닥 콘센트 캡이 있는 컬럼에 적재한다. 하단 캡을 제거하고 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 흐름을 저장합니다.HIS 태그 SUMO 단백질은 컬럼에 결합합니다. 네이티브 화학 결찰 반응을 위한 CIS로 시작하는 링커 항원 부분은 관통하는 흐름에 있습니다. 이제 무게 1.8 2 밀리리터 에펜도르프 튜브에 Fc-III 펩타이드의 수드라진 유도체의 무게 1.8 밀리그램과 pH 3에서 0.2 어금니화 인산염 용액에 6개의 어금니 구아니듐 염화물의 0.8 밀리리터를 추가합니다.분말을 용해 하는 소용돌이. 7에서 튜브를 원심 분리 한 후, 실온에서 1 분 동안 200 배 G는 새로운 튜브로 상체를 전송합니다. 튜브에 교반 바를 넣고 튜브를 자기 교반기위에 얼음 소금 욕조에 넣고 15 분 동안 부드럽게 저어줍니다.그런 다음 용액에 0.5 개의 어금니 나트륨 아질산염의 40 마이크로 리터를 추가하여 하이드라진 그룹을 산화시하십시오. 얼음 소금 목욕에서 15 분 동안 용액을 부드럽게 교반하십시오. HPLC의 11 밀리그램에 무게를 정하고 건조 된 링커 항원 부분을 동결, 그리고 13.6 얼음 소금 목욕의 반응 튜브에 MPAA의 밀리 그램.5분간 저은 다음 6개의 어금니 나트륨수산화물로 방온화시 pH 값을 6.8~7.0으로 조정합니다. 네이티브 화학 적 결찰에 대한 가장 중요한 단계는 pH 값을 신중하게 조정하여 결찰 반응을 시작하는 것입니다. 얼음 소금 목욕에서 12 시간 후, 반응 시스템에 0.1 어금니 TCEP 중립 용액의 0.4 밀리리터를 추가하고 20 분 동안 저어 반응을 종료합니다.원심분리 및 HPLC 정제 후, 탈황을 위한 공주 피크 III를 얻습니다. 0.2 어금니 나트륨 인산염 용액에 6개의 어금다과니듐 염화물50 마이크로리터에 녹입니다. 그런 다음 어금니 TCEP 1개, 테르트 부틸티올 10마이크로리터, 4가지 용액에 0.1 마이크로리터 5개를 추가합니다.용액의 최종 pH를 6.9로 조정하고 약 5시간 동안 셰이커에서 섭씨 37도까지 용액을 유지합니다. 원심 분리기를 다시 정화합니다. 준비된 펩티드를 32밀리머 실버 아세테이트의 200마이크로리터에 녹인 다음, 4시간 동안 실온에서 반응 혼합물을 저어줍니다.펩타이드의 은틸레이트를 프리 티올로 변환하려면 6개의 어금니 구니듐 염화물에 1개의 어금다 DTT의 마이크로리터 3개, pH 7에서 0.2개의 어금니 모노나트륨 인산염을 첨가한다. 전체 스캔 모드에서 질량 분광계를 작동하고 m/z 범위를 300에서 2, 000으로 설정하고 해상도를 60, 000으로 설정합니다. 질량 스펙트럼 데이터를 열고 각 단계에서 제품의 피크를 찾아 화학 반응이 성공적으로 수행되고 있는지 확인합니다.DCAF1과 4G2 항체 간의 상호작용에 대한 ELISA 분석을 수행하기 위해, 코팅 완충제의 100 마이크로리터에서 안티 GST 항체의 피코몰 1개를 가진 96웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰을 코팅한다. 밀봉 테이프로 접시를 밀봉하고 셰이커에 하룻밤 4도에서 배양. 아침에 는 1 %BSA및 PBS의 200 마이크로 리터와 함께 각각 잘 차단합니다.접시를 밀봉하고 셰이커에 1 시간 동안 방 온대인을 인큐베이션하십시오. 그런 다음 0.05 %의 Tween 20을 가진 PBS를 사용하여 각각 4 번 잘 씻습니다. 이 프로토콜에서 네이티브 화학 적 결찰 방법은 DCAF1 분자의 반합성을 위해 사용되었다.질량 스펙트럼은 최종 DCAF1 분자가 11, 053의 분자 무게를 갖는다는 것을 보여줍니다. ELISA 분석 중, 항원 펩티드 Fc-III 및 DCAF1은 4G2 항체 결합을 경쟁적으로 억제한다. 항원 펩티드와 DCAF1 모두 4G2 결합을 현저히 차단한 반면 Fc-III 펩티트는 항원 항체 상호작용에 영향을 미치지 않았다.이 발달 후에, 이 기술은 유해한 항체 관련 질병의 내정간섭을 위한 도로를 포장했습니다. 펩티드 합성 및 네이티브 화학 결찰에 사용되는 영역의 Lot's는 매우 독성이 있다. 화학 후드에 이러한 실험을 해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

입양 이전 및 Antigenic 챌린지에 의해 실험적 면역 Encephalomyelitis (EAE) 모성 마우스 변종에 응답하지 않는 문제를 극복

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

연구

면역학 및 감염병학

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

유인원 면역 결핍 바이러스 특정 CD8 분석<sup&gt; +</sup&gt; 펩티드 - MHC-I 테트라 머 염색에 의해 붉은 털 원숭이의 T 세포

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

비리의 항원 스펙트럼과 세포 외 소포를 분석하는 Virometry 흐름

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

에 의해 쥐 림프구 라벨링<sup&gt; (64)</sup&gt; CU-항체 수용체는 대한 타겟팅<em&gt; 생체</em&gt; PET / CT에 의한 세포 트래 피킹

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

펩타이드 모노클로 날 항체 인식 선형 B 세포 에피토프의 확인을 스캔 보조

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

사용 하 여 MDCK SIAT1 세포 분석 실험 측정 인플루엔자 항 체 응답 Microneutralization에 의해 인간의 세라에 A(H3N2) 바이러스를 중화

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

인간의 우유 샘플의 타겟된 16S 시퀀싱 하는 방법

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

질병-특정 항 체의 생성에 대 한 항 원 리

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

마우스와 차세대 시퀀싱에 의해 인간의 항 체 레파토리의 식별

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...