Name: targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)
Uploaded: 2019-09-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet delvis av Tsinghua University-Gates Foundation (nr. OPP1021992), National Natural Science Foundation i Kina (nr. 21502103, 21877068 og 041301475), og National Key forskning og utvikling program of China (no. 2017YFA0505103).

1. kjemisk syntese av hydrazin derivat av en FC-III peptid
<ol><li>Konvertere 2-CL-(TRT)-CL harpiks til 2-CL-(TRT)-NHNH2 harpiks
	<ol>
<li>Veie 625 mg 2-CL-(TRT)-CL Resin (0,25 mmol) til en 25 mL peptid syntese fartøy.</li>
		<li>Tilsett 5 mL N, N-dimethylformamide (DMF) til harpiks fra toppen av fartøyet, sett hetten tilbake, rist fartøyet forsiktig i 15 s og tapp det deretter. Gjenta DMF vask for to ganger.</li>
		<li>Tilsett 5 mL diklormetan (DCM) til fartøyet, sett hetten tilbake, ri...

<ol>
	<li>Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Physiology (4th ed.). , (2003).</li><li>Halstead, S. B., O&#8217;Rourke, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-enhanced+dengue+virus+infection+in+primate+leukocytes.">Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes.</a> Nature. 265, 739-741 (1977).</li><li>Gammon, G., Sercarz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+some+T+cells+escape+tolerance+induction.">How some T cells escape tolerance induction.</a> Nature. 342, 183-185 (1989).</li><li>Takada, A., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-dependent+enhancement+of+viral+infection:+molecular+mechanisms+and+in+vivo+implications.">Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications.</a> Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).</li><li>Boonnak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Dendritic+Cells+in+Antibody-Dependent+Enhancement+of+Dengue+Virus+Infection.">Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection.</a> Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).</li><li>Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis+-+autoantibody+characteristics+and+their+implications+for+therapy.">Myasthenia gravis - autoantibody characteristics and their implications for therapy.</a> Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).</li><li>Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis:+past,+present,+and+future.">Myasthenia gravis: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).</li><li>Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+a+dengue+vaccine.">Progress towards a dengue vaccine.</a> The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).</li><li>Vikas, K., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+Myasthenia+Gravis.">Treatment of Myasthenia Gravis.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+dual-functional+conjugate+of+antigenic+peptide+and+Fc-III+mimetics+(DCAF)+for+targeted+antibody+blocking.">Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking.</a> Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).</li><li>Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+taylor-aris+dispersion+for+measurement+of+a+solute+diffusion+coefficient+in+thin+capillaries.">Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries.</a> Science. 266, 773-776 (1994).</li><li>Fang, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+chemical+synthesis+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).</li><li>Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+chemical+synthesis+of+proteins+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).</li><li>Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+proteins+using+peptide+hydrazides+as+thioester+surrogates.">Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates.</a> Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).</li></ol>

Protokollen her beskriver semi-syntese og påvisning av DCAF1 ved hjelp NCL tilnærming, som er vist i figur 1. Kort, de to fragmenter av DCAF1 er kjemisk syntetisert og recombinantly uttrykt, henholdsvis; deretter full lengde DCAF1 molekylet er montert, modifisert og renset. For hydrazin avledet FC-III fragment syntese, ved hjelp av lav kapasitet 2-CL harpiks er ganske viktig, fordi høy kapasitet har en negativ effekt for hydrazin generasjon og fører til lav avkastning av produktet. Den l...

Antistoffer spille viktige roller i humoral immunrespons for nøytralisering av patogene bakterier og virus1. Noen antistoffer viser imidlertid skadelige virkninger på organismer, slik som tverr reaktive antistoffer i ADE-effekten under DENV infeksjon og over-reaktive antistoffer i myasthenia gravis, som er en autoimmun sykdom2,3. ADE effekten er formidlet av tverr reaktive antistoffer som gjør broen for å koble DENV og FC reseptoren presentere celler4,5, mens myasthenia gravis er forårsaket av overdreven antistoffer som angriper acetylkolin reseptorer mellom celle-celle veikryss i muskel vev6,7. Selv om delvis effektive tilnærminger har blitt utviklet for å behandle disse sykdommene8,9, utvilsomt direkte eliminering av disse skadelige antistoffer ville gjøre fremskritt for intervensjoner.
Nylig har DCAF molekyler, som har dual-funksjonelle grupper, blitt utviklet for målrettede antistoff blokkering10. DCAF er en lang peptid som består av 3 deler: 1) et antigen del som kan spesifikke gjenkjenne beslektet antistoff, 2) en FC-III eller FC-III-4C kode for sterkt bindende for FC regionen av antistoff å hemme enten FC reseptor eller utfylle komponent proteiner , 3) en lang α-spiral linker som konjugater disse to funksjonelle gruppene10. Den linker del, designet fra Moesin FERM domene, ble optimalisert av Rosseta programvare for å sikre antigen del og FC-III del i et DCAF molekyl kan binde til fab og FC regioner av IgG samtidig. Fire DCAF-molekyler har blitt syntetisert for å målrette mot 4 forskjellige antistoffer, blant dem DCAF1 ble brukt til å eliminere 4G2-antistoff, som er et tverr reaktiv antistoff under DENV-smitte for å bidra til ADE-effekten; og DACF4 ble designet for redning av acetylkolin reseptorer ved å blokkere mab35 antistoff i myasthenia gravis10.
I denne studien, tatt DCAF1 som eksempel, viste vi protokollene for syntesen av DCAF molekyl og påvisning av samspillet mellom en DCAF og dens beslektet antistoff. Den DCAF1 er halvt syntetisert av NCL tilnærming11,12,13,14, som konjugater den hydrazin derivat av en FC-III peptid og uttrykt linker-antigen deler sammen. Den NCL tilnærmingen har betydelige fordeler over fullt kjemisk syntese og fullt rekombinant uttrykk for DCAF1 syntese, fordi begge disse metodene føre til lav avkastning og høye kostnader. Den nåværende tilnærmingen er ikke bare den mest kostnadseffektive måten å få full lengde DCAF, men også kan opprettholde konformasjon av linker del lignende som sin opprinnelige form. Siden ulike DCAF molekyler har lignende sekvenser bortsett fra antigen deler, våre metoder for DCAF1 syntese og samspillet analysen mellom DCAF1 og 4G2 antistoff kan brukes til andre DCAF molekyler til målrettede blokkere sine beslektet antistoffer også.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Chlorotrityl resin</td>
			<td>Tianjin Nankai HECHENG S&#38;T</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>503236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4G2 antibody</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MA5-24387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-mercaptophenylacetic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>H27658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plates</td>
			<td>NEST</td>
			<td>701001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A955</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgOAc</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30164324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GST antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>AE001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076P2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis bag</td>
			<td>Sbjbio</td>
			<td>SBJ132636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80047360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethyl ether</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10009318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH Sepharose</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30095516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrazine hydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80070418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10011018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>12399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-Thiogalactoside</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>5502-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A456</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>90600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>8100771933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide BEH C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piperidine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80104216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Extraction Kit</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B611253-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAexpress Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>32149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>20040718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10020018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;chloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Fmoc-protected amino acids</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilizing pot</td>
			<td>Tomy</td>
			<td>SX-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO Protease</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12588018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stop solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen</td>
			<td>Taihe Biotechnology Compay</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB reagent</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>421101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>91100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>T107252-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 HPLC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>YUHUA</td>
			<td>SHZ-95B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>IVGN0086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)

Eliminering av skadelige antistoffer fra organismer er en verdifull tilnærming for intervensjon av antistoff-tilknyttede sykdommer, slik som Dengue hemoragisk feber og autoimmune sykdommer. Siden tusenvis av antistoffer med ulike epitopes sirkulerer i blod, ingen universell metode, med unntak av dual-funksjonell bøy av antigen peptid og FC-III mimetics (DCAF), ble rapportert å målrette spesifikke skadelige antistoffer. Utviklingen av DCAF-molekyler gir betydelig bidrag til fremdriften for målrettet behandling, som ble demonstrert for å eliminere den Dengue antistoff-effekten (ADE-avhengig forbedring) i en infeksjon modell av viruset (DENV) og for å øke acetylkolin reseptor aktivitet i en myasthenia gravis modell. Her beskriver vi en protokoll for syntesen av et DCAF-molekyl (DCAF1), som kan selektivt blokkere 4G2-antistoff til dempe ADE-effekt under Dengue virus infeksjon, og illustrere bindingen av DCAF1 til 4G2 antistoff ved en ELISA-analyse. I vår metode, DCAF1 er syntetisert av Bøyning av en hydrazin derivat av en FC-III peptid og et rekombinant uttrykt lang α-Helix med antigen sekvens gjennom native kjemiske ligation (NCL). Denne protokollen har blitt brukt på DCAF1 så vel som andre DCAF molekyler for målretting deres beslektet antistoffer.

Flytskjemaet for syntese ruten av innfødte kjemiske ligation i denne artikkelen er vist i figur 1. Tall 2-6 viser Kromatogrammene (A) og Mass Spectra (B) av kjemiske syntetisert HYDRAZIN derivat av en FC-III peptid, rekombinant uttrykt linker og ANTIGEN del, renset produktet fra NCL reaksjon, renset produktet fra desulfurization reaksjon og renset endelige produktet DCAF1, henholdsvis. Den kromatogrammene viser renser av alle produktene er ...

Watch this Scientific Journal Video about Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF at JoVE.com

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

Utvikling av en dual-funksjonell bøy av antigen peptid og FC-III mimetics (DCAF) er romanen for eliminering av skadelige antistoffer. Her beskriver vi en detaljert protokoll for syntesen av DCAF1 molekyl, som kan selektivt blokkere 4G2 antistoff for å eliminere antistoff avhengig ekstrautstyr effekt under Dengue virus infeksjon.

Målrettet antistoff blokkering av en dual-funksjonell bøy av antigen peptid og FC-III Mimetics (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...

Dette kan bidra til å besvare viktige spørsmål om hvordan man syntetiserer DCAF-molekyler med målrettet antistoffnøytralisering. Denne teknikken gir den enkleste måten å syntetisere dcaf molekylene med høy produktivitet. Verden bestemmer DCAF molekyler har potensielle intervensjoner til antistoffet i avtaler med sykdommer som Dengue feber og myasthenia gravis.Denne metoden kan brukes på andre DCAF molekyler med forskjellige epitoper for å målrette cognate antistoffer. Å demonstrere prosedyren vil være Xue Bai, en senior tekniker fra laboratoriet mitt. For å konvertere 2-klorharpiks til hydrazin avledet 2-klorharpiks, fra toppen av peptidsyntesekaret, legg til fem milliliter DMF til 0,25 millimol med 2-klorharpiks.Sett hetten på igjen, rist forsiktig fartøyet i 15 sekunder, og tøm den deretter på et jernstativ. Gjenta DMF-vaskingen to ganger til. Tilsett deretter fem milliliter DCM til fartøyet, sett hetten på igjen, rist forsiktig fartøyet i 15 sekunder, og tøm det deretter på et jernstativ.Gjenta DCM-vaskingen to ganger til, og gjenta deretter DMF-vasken tre ganger til. Deretter legger du til seks milliliter med 50 % volumkonsentrasjon av DMF over DCM for å hovne opp harpiksen i 30 minutter og deretter tømme den. Nå overføre seks milliliter med 5% volumkonsentrasjon av hydrazin og DMF til reaksjonskaret.Plasser den på shakeren ved 120 o/min og 30 grader celsius i 30 minutter, og tøm deretter løsningen med vakuumpumpe. For å rense hydrazinderivatet av et Fc-III peptid, bruk HPLC-systemet til å rense peptidet med en 30 minutters gradient allusion-elution med en strømningshastighet på én milliliter per minutt. Etter proteinrensing i henhold til manuskriptet, legg til et nytt rør to milliliter på ett milligram per milliliter SUMO merket protein, en milliliter SUMO protease, en milliliter 10X SUMO proteasebuffer og seks milliliter dobbelt destillert vann for å forberede reaksjonsløsningen.Inkuber blandingen i 12 til 16 timer ved fire grader celsius. Deretter aliquot blandingen i åtte 1,5 milliliter Eppendorf rør, og sentrifuge blandingen på 15,000 ganger G i 10 minutter ved fire grader celsius. Bruk en pipet til å kaste aggregatene nederst, deretter inn i 10 milliliter ryddet supernatanter, tilsett 0,5 milliliter av 50% nikkel NTA perle slurry i 50 millimolar PBS.Plasser røret på en roterende shaker ved 200 RPM og fire grader celsius for å blande forsiktig i 60 minutter. Deretter laster du lisaden og nikkel NTA-blandingen i en kolonne med den nederste utløpshetten. Fjern bunnhetten og lagre strømmen gjennom i et 15 milliliter sentrifugerør.HIS TAG SUMO-proteinet er bindende på kolonnen. Linker antigendelen, som starter med CIS for innfødt kjemisk ligation reaksjon, er i strømmen gjennom. Nå vekt 1,8 milligram hydrazin derivat av en Fc-III peptid i en to milliliter Eppendorf rør og legge 0,8 milliliter av seks molar guanidinium klorid i 0,2 molar monosodium fosfat løsning ved pH 3.Vortex å oppløse pulveret. Etter sentrifugering av røret ved 7, 200 ganger G i ett minutt ved romtemperatur, overfør supernatanten til et nytt rør. Tilsett en rørestang i røret og legg røret i et issaltbad på en magnetisk røreør for å forsiktige agitere løsningen i 15 minutter.Tilsett deretter 40 mikroliter med 0,5 molarnatriumnitritt til løsningen for å oksidere hydrazingruppen. Rør forsiktig inn oppløsningen i ytterligere 15 minutter i issaltbadet. Vei inn på 11 milligram hplc renset og fryse tørket linker antigen del, og 13,6 milligram MPAA inn i reaksjonsrøret i issaltbadet.Rør i fem minutter og juster deretter pH-verdien til 6,8 til 7,0 i rommet temperert med seks molar natriumhydroksid. Det mest kritiske trinnet for innfødt kjemisk ligation er å justere pH-verdien nøye for å initiere ligationreaksjonen. Etter 12 timer i issaltbadet, tilsett 0,4 milliliter 0,1 molar TCEP nøytral løsning på reaksjonssystemet, og rør i 20 minutter for å avslutte reaksjonen.Etter sentrifugering og HPLC-rensing, få konjugattoppen III for desulfurisering. Oppløs det i 50 mikroliter av seks molar guanidiniumklorid i 0,2 molar monosodium fosfatoppløsning. Tilsett deretter 50 mikroliter av en molar TCEP, 10 mikroliter tert-Butylthiol og fem mikroliter på 0,1 molar VAO for fire oppløsning.Juster den endelige pH-en på løsningen til 6,9 og hold oppløsningen på 37 grader celsius på en shaker i omtrent fem timer. Sentrifuge og rense igjen. Oppløs det tilberedte peptidet i 200 mikroliter på 32 millimolar sølvacetat, og rør deretter reaksjonsblandingen ved romtemperatur i fire timer.For å konvertere sølvtolatene på peptid til frie tioler, tilsett tre mikroliter av en molar DTT i seks molar guanidiniumklorid og 0,2 molarmononatriumfosfat ved pH 7. Bruk massespektrometeret i full skannemodus og sett m/z-området til 300 til 2, 000 og oppløsning ved 60 000. Åpne massespektradataene og finn toppene på produktet i hvert trinn for å bekrefte at den kjemiske reaksjonen er vellykket utført.For å utføre ELISA-analyse av samspillet mellom DCAF1 og 4G2 antistoff, belegge hver brønn av en 96-brønns mikrotiterplate med en picomole anti-GST antistoff i 100 mikroliter beleggbuffer. Forsegle platen med tetningsbånd og inkuber den ved 4 grader celsius over natten på en shaker. I morgenblokken hver brønn med 200 mikroliter på 1% BSA og PBS.Forsegle platen og inkubere det rommet temperert i en time på en shaker. Bruk deretter PBS med 0,05% Tween 20 for å vaske hver brønn fire ganger. I denne protokollen ble den opprinnelige kjemiske ligationmetoden brukt til halvsyntesen til DCAF1-molekylet.Massespekteret viser at det endelige DCAF1-molekylet har en dekonovolutional molekylær veiing på 11 053. Under ELISA-analysen hemmer antigenpeptid fc-III og DCAF1 4G2 antistoffbinding. Både antigenpeptid og DCAF1 blokkerte 4G2-bindingen betydelig, mens Fc-III peptite ikke påvirket antistoffinteraksjonen mot antigenet.Etter denne utviklingen banet denne teknikken vei for en intervensjon av skadelige antistoffrelaterte sykdommer. Lot er av regionene som brukes til peptidsyntese og innfødt kjemisk ligation er svært giftig. Sørg for å ta disse eksperimentene i din kjemiske hette.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overvinne manglende respons i Eksperimentelle Autoimmune encefalomyelitt (EAE) Resistente musestammer av adoptivforeldre Transfer og antigen Challenge

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Måling av Influensa neuraminidase Inhibering antistofftitere ved enzym-bundet lektin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analyse av Simian Immunodeficiency Virus-spesifikke CD8<sup&gt; +</sup&gt; T-celler i rhesusape av Peptide-MHC-I Tetramer Farging

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Flow Virometry å analysere Antigen Spectra av Virioner og ekstracellulære vesikler

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymfocytter Merking av<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-antistoff Reseptor for målretting<em&gt; In Vivo</em&gt; Celletrafikken av PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

Peptid Skanning-assistert Identifisering av et monoklonalt antistoff-gjenkjent Linear B-celle-epitop

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Måle influensa nøytralisere antistoff Svar å A(H3N2) virus i menneskelig Sera av Microneutralization søk ved hjelp av MDCK-SIAT1 celler

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

En metode for målrettet 16S sekvensering av morsmelk prøver

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Antigen liposomer for generering av sykdom-spesifikke antistoffer

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

Identifikasjon av mus og menneskelige antistoff repertoar av neste generasjons sekvensering

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...