Name: targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)
Uploaded: 2019-09-17T13:30:00
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Este trabalho foi apoiado em parte pela Universidade Tsinghua-Gates Foundation (não. OPP1021992), a Fundação Nacional da ciência natural de China (no. 21502103, 21877068 e 041301475), e o programa chave nacional da pesquisa e do desenvolvimento de China (no. 2017YFA0505103).

1. síntese química do derivado da hidrazina de um peptídeo FC-III
<ol><li>Convertendo 2-CL-(TRT)-resina CL para 2-CL-(TRT)-NHNH2 resina
	<ol>
<li>Pesar 625 mg de resina 2-CL-(TRT)-CL (0,25 mmol) em uma embarcação de síntese de peptídeos de 25 mL.</li>
		<li>Adicionar 5 mL de N, N-dimetilformamida (DMF) para a resina a partir do topo da embarcação, coloque a tampa de volta, agitar suavemente a embarcação por 15 s e, em seguida, drená-lo. Repita a lavagem DMF por mais duas vezes.</...

<ol>
	<li>Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Physiology (4th ed.). , (2003).</li><li>Halstead, S. B., O&#8217;Rourke, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-enhanced+dengue+virus+infection+in+primate+leukocytes.">Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes.</a> Nature. 265, 739-741 (1977).</li><li>Gammon, G., Sercarz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+some+T+cells+escape+tolerance+induction.">How some T cells escape tolerance induction.</a> Nature. 342, 183-185 (1989).</li><li>Takada, A., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-dependent+enhancement+of+viral+infection:+molecular+mechanisms+and+in+vivo+implications.">Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications.</a> Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).</li><li>Boonnak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Dendritic+Cells+in+Antibody-Dependent+Enhancement+of+Dengue+Virus+Infection.">Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection.</a> Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).</li><li>Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis+-+autoantibody+characteristics+and+their+implications+for+therapy.">Myasthenia gravis - autoantibody characteristics and their implications for therapy.</a> Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).</li><li>Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis:+past,+present,+and+future.">Myasthenia gravis: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).</li><li>Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+a+dengue+vaccine.">Progress towards a dengue vaccine.</a> The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).</li><li>Vikas, K., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+Myasthenia+Gravis.">Treatment of Myasthenia Gravis.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+dual-functional+conjugate+of+antigenic+peptide+and+Fc-III+mimetics+(DCAF)+for+targeted+antibody+blocking.">Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking.</a> Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).</li><li>Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+taylor-aris+dispersion+for+measurement+of+a+solute+diffusion+coefficient+in+thin+capillaries.">Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries.</a> Science. 266, 773-776 (1994).</li><li>Fang, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+chemical+synthesis+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).</li><li>Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+chemical+synthesis+of+proteins+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).</li><li>Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+proteins+using+peptide+hydrazides+as+thioester+surrogates.">Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates.</a> Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).</li></ol>

O protocolo aqui descreve a semisíntese e a detecção de DCAF1 usando a abordagem NCL, que é mostrada na Figura 1. Resumidamente, os dois fragmentos de DCAF1 são químicos sintetizados e recombinantemente expressos, respectivamente; Então, a molécula cheia do comprimento DCAF1 é montada, modificada e purificada. Para a síntese de fragmento de FC-III derivado de hidrazina, usar resina de baixa capacidade de 2 CL é bastante importante, pois a alta capacidade tem um efeito negativo par...

Os anticorpos desempenham papéis importantes na resposta imune humoral para a neutralização de bactérias patogênicas e vírus1. No entanto, alguns anticorpos exibem impactos nocivos para os organismos, tais como anticorpos Cross-Reactive no efeito Ade durante a infecção por DENV e anticorpos over-reativa em miastenia gravis, que é uma doença auto-imune2,3. O efeito Ade é mediado pelos anticorpos Cross-Reactive que fazem a ponte para conectar o receptor de DENV e de FC que apresenta pilhas4,5, quando os gravis da miastenia forem causados pelos anticorpos excessivos que atacam receptores da acetilcolina entre as junções célula-célula no tecido muscular6,7. Embora abordagens parcialmente eficazes tenham sido desenvolvidas para tratar essas doenças8,9, semdúvida, a eliminação direta desses anticorpos prejudiciais faria progressos para as intervenções.
Recentemente, as moléculas de DCAF, que têm grupos Dual-functional, foram desenvolvidas para o anticorpo alvejado que obstrui10. DCAF é um peptide longo que seja compor de 3 porções: 1) uma peça do antígeno que possa específico reconhecer o anticorpo cognato, 2) um tag de FC-III ou de FC-III-4C para fortemente ligar à região de FC do anticorpo para inibir o receptor de FC ou as proteínas do componente do complemento , 3) um longo vinculador α-helicoidal que conjuga esses dois grupos funcionais10. A parte do vinculador, projetada do domínio de Moesin FERM, foi aperfeiçoada pelo software de Rosseta para assegurar a parte do antígeno e a parte de FC-III em uma molécula de DCAF pode ligar às regiões de fab e de FC de IgG simultaneamente. Quatro moléculas de DCAF foram sintetizadas para alvejar 4 anticorpos diferentes, entre eles DCAF1 foi usado para eliminar o anticorpo 4G2, que é um anticorpo Cross-Reactive durante a infecção de DENV para contribuir ao efeito do ADE; e DACF4 foi projetado para o resgate de receptores de acetilcolina, bloqueando mab35 anticorpo em miastenia gravis10.
No presente estudo, DCAF1 como exemplo, foram mostrados os protocolos para a síntese da molécula de DCAF e a detecção da interação entre um DCAF e seu anticorpo cognato. O DCAF1 é semisintetizado pela aproximação de NCL11,12,13,14, que conjuga o derivado de hidrazina de um peptide de FC-III e as partes expressadas do linker-antígeno junto. A abordagem NCL tem vantagens significativas sobre a síntese totalmente química e expressão totalmente recombinante para a síntese de DCAF1, porque ambos os métodos levam a baixo rendimento e alto custo. A abordagem atual não é apenas a maneira mais rentável para obter o DCAF de comprimento total, mas também pode manter a conformação da parte do vinculador semelhante como sua forma nativa. Desde que as moléculas diferentes de DCAF têm seqüências similares à exceção das peças do antígeno, nossos métodos para a síntese DCAF1 e o ensaio da interação entre o anticorpo DCAF1 e 4G2 podem ser aplicados a outras moléculas de DCAF ao bloco alvejado seus anticorpos cognato também.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Chlorotrityl resin</td>
			<td>Tianjin Nankai HECHENG S&#38;T</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>503236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4G2 antibody</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MA5-24387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-mercaptophenylacetic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>H27658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plates</td>
			<td>NEST</td>
			<td>701001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A955</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgOAc</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30164324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GST antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>AE001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076P2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis bag</td>
			<td>Sbjbio</td>
			<td>SBJ132636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80047360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethyl ether</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10009318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH Sepharose</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30095516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrazine hydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80070418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10011018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>12399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-Thiogalactoside</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>5502-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A456</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>90600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>8100771933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide BEH C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piperidine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80104216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Extraction Kit</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B611253-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAexpress Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>32149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>20040718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10020018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;chloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Fmoc-protected amino acids</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilizing pot</td>
			<td>Tomy</td>
			<td>SX-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO Protease</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12588018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stop solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen</td>
			<td>Taihe Biotechnology Compay</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB reagent</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>421101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>91100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>T107252-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 HPLC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>YUHUA</td>
			<td>SHZ-95B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>IVGN0086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)

A eliminação de anticorpos nocivos dos organismos é uma abordagem valiosa para a intervenção de doenças associadas a anticorpos, como a febre hemorrágica da dengue e doenças auto-imunes. Desde que os milhares de anticorpos com epítopos diferentes circulam no sangue, nenhum método universal, à exceção do conjugado duplo-funcional do peptide antigénico e dos mimetics FC-III (DCAF), foi relatado para alvejar anticorpos prejudiciais específicos. O desenvolvimento de moléculas de DCAF contribui significativamente para o avanço da terapia direcionada, que foram demonstrados para eliminar o efeito do realce dependente de anticorpos (ADE) em um modelo de infecção pelo vírus da dengue (DENV) e para impulsionar a acetilcolina atividade do receptor em um modelo do gravis da miastenia. Aqui, nós descrevemos um protocolo para a síntese de uma molécula de DCAF (DCAF1), que possa seletivamente obstruir o anticorpo 4G2 para atenuar o efeito do ADE durante a infecção do vírus de dengue, e ilustrar a ligação de DCAF1 ao anticorpo 4G2 por um ensaio de ELISA. Em nosso método, DCAF1 é sintetizado pela conjugação de um derivado de hidrazina de um peptídeo FC-III e uma α-hélice longa expressa recombinante com seqüência antigênica através de ligadura química nativa (NCL). Este protocolo foi aplicado com sucesso a DCAF1 assim como outras moléculas de DCAF para alvejar seus anticorpos cognato.

O fluxograma para a rota de síntese por ligadura química nativa neste artigo é mostrado na Figura 1. As figuras 2-6 mostram os cromatogramas (a) e os espectros de massa (B) do derivado químico sintetizado da hidrazina de um peptídeo FC-III, do linker expresso recombinante e da parte do antígeno, o produto purificado da reação de NCL, o purificado produto da reação da dessulfuração e do produto final purified DCAF1, respectivament...

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Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

O desenvolvimento de um conjugado dual-functional do peptide antigénico e do mimetics FC-III (DCAF) é novo para a eliminação de anticorpos prejudiciais. Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para a síntese da molécula DCAF1, que pode seletivamente obstruir o anticorpo 4G2 para eliminar o efeito dependente do realce do anticorpo durante a infecção do vírus de dengue.

Bloqueio de anticorpos direcionados por um conjugado duplo-funcional de peptídeo antigênico e mimetismo FC-III (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...

Isso pode servir para ajudar a responder perguntas-chave sobre como sintetizar moléculas de DCAF com a neutralização de anticorpos direcionados. Esta técnica fornece a maneira mais simples de sintetizar as moléculas dcaf com alta produtividade. O mundo decide que as moléculas da DCAF têm as possíveis intervenções ao anticorpo em lidar com doenças como a dengue e a miasthenia gravis.Este método pode ser aplicado a outras moléculas de DCAF com diferentes epítopos para atingir os anticorpos cognatos. Demonstrando o procedimento será Xue Bai, um técnico sênior do meu laboratório. Para converter resina de 2 cloro em resina derivada de hidrazina 2-Cloro, do topo do vaso de síntese de peptídeos, adicione cinco mililitros de DMF aos 0,25 mililitros de resina de 2 cloro.Coloque a tampa de volta, agite suavemente o recipiente por 15 segundos e, em seguida, drene-a em uma barra de ferro. Repita a lavagem do DMF mais duas vezes. Em seguida, adicione cinco mililitros de DCM ao vaso, coloque a tampa de volta, agite suavemente o vaso por 15 segundos e, em seguida, drene-o em uma barra de ferro.Repita a lavagem do DCM mais duas vezes e repita a lavagem do DMF mais três vezes. Em seguida, adicione seis mililitros de concentração de 50% de volume de DMF sobre DCM para inchar a resina por 30 minutos e depois drená-la. Agora transfira seis mililitros de 5% de concentração de volume de hidrazina e DMF para o vaso de reação.Coloque-o no shaker a 120 RPM e 30 graus celsius por 30 minutos e, em seguida, drene a solução por bomba de vácuo. Para purificar o derivado de hidrazina de um peptídeo Fc-III, use o sistema HPLC para purificar o peptídeo por uma elução de alusão de gradiente de 30 minutos a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto. Após a purificação da proteína de acordo com o manuscrito, adicione em um novo tubo dois mililitros de um miligrama por milliliter SUMO proteína marcada, um mililitro de protease SUMO, um mililitro de tampão protease 10X SUMO, e seis mililitros de água dupla destilada para preparar a solução de reação.Incubar a mistura por 12 a 16 horas a quatro graus celsius. Em seguida, aliquot a mistura em oito tubos Eppendorf de 1,5 mililitro, e centrifugar a mistura a 15.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus celsius. Use uma pipeta para descartar os agregados na parte inferior, em seguida, para os 10 mililitros limpos supernantes, adicione 0,5 mililitros do chorume de contas NTA de 50% de níquel em 50 mililitros PBS.Coloque o tubo em um agitador rotativo a 200 RPM e quatro graus celsius para misturar suavemente por 60 minutos. Em seguida, carregue a lisade e a mistura de níquel NTA em uma coluna com a tampa inferior da tomada. Remova a tampa inferior e salve o fluxo através de um tubo de centrífuga de 15 mililitros.A proteína HIS TAG SUMO está se ligando à coluna. A parte do antígeno de ligação, que começa com a CEI para reação de ligadura química nativa, está no fluxo. Agora peso 1,8 miligramas de derivado de hidrazina de um peptídeo Fc-III em um tubo Eppendorf de dois mililitros e adicione 0,8 mililitros de seis cloreto de guanidinium molar em 0,2 solução de fosfato de molar em pH 3.Vórtice para dissolver o pó. Depois de centrifuging o tubo a 7,200 vezes G por um minuto em temperatura ambiente transfira o supernante para um novo tubo. Adicione uma barra de mexida no tubo e coloque o tubo em um banho de sal de gelo em um agitador magnético para agitar suavemente a solução por 15 minutos.Em seguida, adicione 40 microlitres de 0,5 nitrito de sódio molar à solução para oxidar o grupo hidrazina. Agitar suavemente a solução por mais 15 minutos no banho de sal gelado. Pesar em 11 miligramas da parte de antígeno purificado e congelador do HPLC, e 13,6 miligramas de MPAA no tubo de reação no banho de sal gelado.Mexa por cinco minutos e depois ajuste o valor do pH para 6,8 a 7,0 no quarto temperado com seis hidróxido de sódio molar. O passo mais crítico para a ligadura química nativa é ajustar cuidadosamente o valor do pH para iniciar a reação de ligadura. Após 12 horas no banho de sal gelado, adicione 0,4 mililitros de solução neutra de 0,1 molar TCEP ao sistema de reação e mexa por 20 minutos para terminar a reação.Após centrifugação e purificação do HPLC, obtenha o pico conjugado III para dessulfurização. Dissolva-o em 50 microlitadores de seis cloreto de guanidinium molar em 0,2 solução de fosfato de monossódico molar. Em seguida, adicione 50 microliters de um MOLAR TCEP, 10 microliters de tert-Butylthiol, e cinco microliters de 0,1 molar VAO para quatro soluções.Ajuste o pH final da solução para 6.9 e mantenha a solução a 37 graus celsius em um shaker por cerca de cinco horas. Centrifugar e purificar novamente. Dissolva o peptídeo preparado em 200 microliters de 32 mililitros de prata e, em seguida, mexa a mistura de reação à temperatura ambiente por quatro horas.Para converter os tioolados prateados em peptídeos em tiols livres, adicione três microliters de um molar DTT em seis cloreto de guanidinium molar, e 0,2 fosfato de molar monossódico no pH 7. Opere o espectrômetro de massa no modo de varredura completo e ajuste a faixa m/z em 300 a 2.000 e resolução em 60.000. Abra os dados do espectro de massa e encontre os picos do produto em cada etapa para confirmar que a reação química é realizada com sucesso.Para realizar o ensaio ELISA da interação entre anticorpo DCAF1 e 4G2, cubra cada poço de uma placa de microtâmetro de 96 poços com um picomole de anticorpo anti-GST em 100 microliters de tampão de revestimento. Sele a placa com fitas de vedação e incuba-a a 4 graus celsius durante a noite em um shaker. No bloco da manhã cada poço com 200 microliters de 1%BSA e PBS.Sele a placa e incubar a sala temperada por uma hora em um shaker. Em seguida, use PBS com 0,05%Tween 20 para lavar cada poço quatro vezes. Neste protocolo, utilizou-se o método de ligadura química nativa para a semisíntese da molécula DCAF1.O espectro de massa mostra que a molécula dcaf1 final tem uma pesagem molecular desconvolucional de 11.053. Durante o ensaio ELISA, o peptídeo de antígeno Fc-III e DCAF1 inibem competitivamente a ligação de anticorpos 4G2. Tanto o peptídeo de antígeno quanto o DCAF1 bloquearam significativamente a ligação 4G2, enquanto o peptite Fc-III não afetou a interação com anticorpos de antígeno.Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para uma intervenção de doenças prejudiciais associadas a anticorpos. Lotes das regiões utilizadas para síntese de peptídeos e ligadura química nativa são altamente tóxicos. Certifique-se de fazer esses experimentos em sua capa química.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Superando indiferença em Encefalomielite autoimune experimental (EAE) linhagens mais resistentes por transferência adotiva e desafio antigênico

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Imunologia e Infecção

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Medição de Inibição da Neuraminidase Influenza títulos de anticorpos por Enzyme-linked Lectina Ensaio

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Análise de células T CD8 específicas do vírus da imunodeficiência símia<sup&gt; +</sup&gt; Células-T em Rhesus Macaques por Peptide-MHC-I tetrâmero coloração

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Fluxo Virometry para analisar antigênica Spectra de viriões e Extracelular vesículas

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murino Linfócitos Rotulagem por<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antibody Receptor Segmentação para<em&gt; In Vivo</em&gt; Tráfico celular por PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

Identificação de um epítopo de célula B linear Monoclonal Antibody-péptido reconhecido Digitalização-assistida

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Medição da gripe neutralizando Antibody Responses to A(H3N2) vírus em soros humanos por Microneutralization ensaios usando as células MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Um método para o sequenciamento de alvo 16S das amostras de leite humano

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Antigênicos lipossomas para a geração de anticorpos específicos de doença

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

Identificação de Mouse e repertórios de anticorpo humano por sequenciamento de próxima geração

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...