Name: targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)
Uploaded: 2019-09-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF at JoVE.com

Эта работа была частично поддержана Фондом Университета Цинхуа-Гейтс (нет. OPP1021992), Национальный фонд естественных наук Китая (No 21502103, 21877068 и 041301475), а также Национальная программа ключевых исследований и разработок Китая (No 2017YFA0505103).

1. Химический синтез гидразина, производного пептида FC-III
<ol><li>Преобразование 2-Cl-(Trt)-Cl сгоны до 2-Cl-(Trt)-NHNH2 сена
	<ol>
<li>Взвесить 625 мг 2-Cl-(Trt)-Cl смолы (0,25 ммоль) в 25 мл пептид синтеза сосуда.</li>
		<li>Добавьте 5 мл N,N-диметилформамид (DMF) в суслив с верхней части сосуда, положите крышку н...

<ol>
	<li>Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Physiology (4th ed.). , (2003).</li><li>Halstead, S. B., O&#8217;Rourke, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-enhanced+dengue+virus+infection+in+primate+leukocytes.">Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes.</a> Nature. 265, 739-741 (1977).</li><li>Gammon, G., Sercarz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+some+T+cells+escape+tolerance+induction.">How some T cells escape tolerance induction.</a> Nature. 342, 183-185 (1989).</li><li>Takada, A., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-dependent+enhancement+of+viral+infection:+molecular+mechanisms+and+in+vivo+implications.">Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications.</a> Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).</li><li>Boonnak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Dendritic+Cells+in+Antibody-Dependent+Enhancement+of+Dengue+Virus+Infection.">Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection.</a> Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).</li><li>Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis+-+autoantibody+characteristics+and+their+implications+for+therapy.">Myasthenia gravis - autoantibody characteristics and their implications for therapy.</a> Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).</li><li>Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis:+past,+present,+and+future.">Myasthenia gravis: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).</li><li>Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+a+dengue+vaccine.">Progress towards a dengue vaccine.</a> The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).</li><li>Vikas, K., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+Myasthenia+Gravis.">Treatment of Myasthenia Gravis.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+dual-functional+conjugate+of+antigenic+peptide+and+Fc-III+mimetics+(DCAF)+for+targeted+antibody+blocking.">Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking.</a> Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).</li><li>Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+taylor-aris+dispersion+for+measurement+of+a+solute+diffusion+coefficient+in+thin+capillaries.">Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries.</a> Science. 266, 773-776 (1994).</li><li>Fang, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+chemical+synthesis+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).</li><li>Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+chemical+synthesis+of+proteins+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).</li><li>Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+proteins+using+peptide+hydrazides+as+thioester+surrogates.">Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates.</a> Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).</li></ol>

Протокол здесь описывает полусинтез и обнаружение DCAF1 с помощью подхода NCL, который показан на рисунке 1. Короче говоря, два фрагмента DCAF1 являются химическими синтезированными и рекомбинантно выраженными, соответственно; Затем молекула DCAF1 по всей длине собирается, моди...

Антитела играют важную роль в гуморальном иммунном ответе для нейтрализации патогенных бактерий и вирусов1. Тем не менее, некоторые антитела проявляют вредное воздействие на организмы, такие как кросс-реактивные антитела в эффекте ADE во время инфекции DENV и сверхреактивные антитела в миастении gravis, которая является аутоиммунным заболеванием2,3. ADE эффект опосредован кросс-реактивных антител, которые делают мост для подключения DENV и Fc рецепторов представления клеток4,5, в то время как миастения gravis вызвано чрезмерными антителами, которые атакуют рецепторы ацетилхолина между клеточными клетками соединений в мышечной ткани6,7. Хотя частично эффективные подходы были разработаны для лечения этих заболеваний8,9, несомненно, прямое устранение этих вредных антител будет делать прогресс для вмешательства.
Недавно молекулы DCAF, которые имеют двойные функциональные группы, были разработаны для целевых блокирующих антител10. DCAF является длинный пептид, который состоит из 3 частей: 1) антигенная часть, которая может конкретно распознать коньяк антитела, 2) Fc-III или Fc-III-4C тег для сильно связывания с fc региона антитела ингибировать либо FC рецептора или дополнения компонентов белков , 3) длинный суликовый связующий, который спряжяэтику этих двух функциональных групп10. Связующее звено, разработанное из домена Moesin FERM, было оптимизировано программным обеспечением "Россетей" для обеспечения того, чтобы антигенная часть и часть FC-III в молекуле DCAF могли связываться с регионами Fab и FC IgG одновременно. Четыре молекулы DCAF были синтезированы для целевой 4 различных антител, среди них DCAF1 был использован для устранения 4G2 антитела, которое является кросс-реактивного антитела во время инфекции DENV внести свой вклад в эффект ADE; и DACF4 был разработан для спасения рецепторов ацетилхолина, блокируя антитела mab35 в миастении gravis10.
В настоящем исследовании, принятом DCAF1 в качестве примера, мы показали протоколы для синтеза молекулы DCAF и обнаружения взаимодействия между DCAF и его коньяк антитела. DCAF1 полусинтезируется NCL подход11,12,13,14, который спряжядает гидразина производной от пептида Fc-III и выраженный связующий-антиген частей вместе. Подход NCL имеет значительные преимущества перед полностью химическим синтезом и полностью рекомбинантным выражением синтеза DCAF1, поскольку оба этих метода приводят к низкой урожайности и высокой стоимости. Нынешний подход является не только наиболее экономически эффективным способом получить полнометражный DCAF, но и может поддерживать конформацию связующих частей, аналогичных его родной форме. Поскольку различные молекулы DCAF имеют аналогичные последовательности, за исключением антигенных частей, наши методы синтеза DCAF1 и взаимодействия между DCAF1 и 4G2 антитела могут быть применены к другим молекулам DCAF целевой блок их cognate антител, а также.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Chlorotrityl resin</td>
			<td>Tianjin Nankai HECHENG S&#38;T</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>503236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4G2 antibody</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MA5-24387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-mercaptophenylacetic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>H27658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plates</td>
			<td>NEST</td>
			<td>701001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A955</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgOAc</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30164324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GST antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>AE001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076P2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis bag</td>
			<td>Sbjbio</td>
			<td>SBJ132636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80047360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethyl ether</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10009318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH Sepharose</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30095516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrazine hydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80070418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10011018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>12399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-Thiogalactoside</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>5502-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A456</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>90600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>8100771933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide BEH C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piperidine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80104216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Extraction Kit</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B611253-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAexpress Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>32149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>20040718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10020018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;chloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Fmoc-protected amino acids</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilizing pot</td>
			<td>Tomy</td>
			<td>SX-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO Protease</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12588018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stop solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen</td>
			<td>Taihe Biotechnology Compay</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB reagent</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>421101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>91100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>T107252-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 HPLC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>YUHUA</td>
			<td>SHZ-95B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>IVGN0086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)

Устранение вредных антител из организмов является ценным подходом для вмешательства антител связанных заболеваний, таких как геморрагическая лихорадка денге и аутоиммунных заболеваний. Поскольку тысячи антител с различными эпитопами циркулируют в крови, ни один универсальный метод, за исключением двойного функционального конъюгирования антигенного пептида и миметики Fc-III (DCAF), не был направлен на конкретные вредные антитела. Развитие молекул DCAF вносит значительный вклад в прогресс целевой терапии, которые были продемонстрированы для устранения антител зависимых повышение (ADE) эффект в модели инфекции вируса Денге (ДЕНВ) и повысить ацетилхолин активности рецепторов в модели миастении gravis. Здесь мы описываем протокол для синтеза молекулы DCAF (DCAF1), который может избирательно блокировать антитела 4G2, чтобы замять эффект ADE во время инфекции вируса Денге, и проиллюстрировать связывание DCAF1 к 4G2 антитела анализа ELISA. В нашем методе DCAF1 синтезируется путем спряжения гидразина, производного пептида FC-III, и рекомбинантного, выраженного длинной селиксом с антигенной последовательностью через местную химическую перевязку (NCL). Этот протокол был успешно применен к DCAF1, а также другие молекулы DCAF для ориентации их cognate антител.

Диаграмма потока для маршрута синтеза по родной химической перевязки в этой статье показана на рисунке 1. Рисунки 2-6 показывают хроматограммы(A)и масс-спектры (B) химического синтезированного гидразина производного пептида Fc-III, рекомбинантног...

Watch this Scientific Journal Video about Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF at JoVE.com

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

Разработка двойного функционального конъюгированного антигенного пептида и миметики FC-III (DCAF) является новым для устранения вредных антител. Здесь мы описываем подробный протокол для синтеза молекулы DCAF1, который может избирательно блокировать антитела 4G2 для устранения эффекта повышения антител, зависящих от них во время инфицирования вирусом Денге.

Целенаправленная блокировка антител двойным функциональным конъюгированным антигенным пептидом и миметикой FC-III (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...

Это может помочь ответить на ключевые вопросы о том, как синтезировать молекулы DCAF с целевой нейтрализации антител. Этот метод обеспечивает самый простой способ синтеза молекул DCAF с высокой производительностью. Мир решает, что молекулы DCAF имеют потенциальное вмешательство в антитела в таких заболеваниях, как лихорадка Денге и миастения.Этот метод может быть применен к другим молекулам DCAF с различными эпитопами для целевой cognate антител. Демонстрация процедуры будет Сюэ Бай, старший техник из моей лаборатории. Для преобразования 2-хлорной смолы в гидразин, полученную из 2-хлорной смолы, из верхней части сосуда пептидного синтеза добавьте пять миллилитров DMF в 0,25 миллимоле 2-хлорной смолы.Положите крышку обратно, осторожно встряхните сосуд в течение 15 секунд, а затем слейте его на железный стенд. Повторите DMF стирки еще два раза. Затем добавьте в сосуд пять миллилитров DCM, налейте крышку обратно, аккуратно встряхните сосуд в течение 15 секунд, а затем слейте его на железный стенд.Повторите dcM стирки еще два раза, а затем повторить DMF мыть еще три раза. Далее добавьте шесть миллилитров 50%-томной концентрации DMF над DCM, чтобы набухать смолы в течение 30 минут, а затем процедить его. Теперь перенесите шесть миллилитров 5%-томной концентрации гидразина и DMF в реакционной сосуд.Поместите его на шейкер при 120 об/мин и 30 градусов по Цельсию в течение 30 минут, а затем слейте раствор вакуумным насосом. Чтобы очистить производную гидразина от пептида Fc-III, используйте систему HPLC для очистки пептида 30-минутным градиентным аллюзионом элюционом со скоростью потока в миллилитр в минуту. После очистки белка в соответствии с рукописью, добавить в новую трубку два миллилитров по одному миллиграмму на миллилитр SUMO помечены белка, один миллилитр SUMO протеазы, один миллилитр 10X SUMO протеазы буфера, и шесть миллилитров двойной дистиллированной воды для подготовки реакции раствора.Инкубировать смесь в течение 12 до 16 часов при четырех градусах по Цельсию. Затем aliquot смесь в восемь 1,5 миллилитров Eppendorf труб, и центрифуга смеси на 15000 раз G в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию. Используйте пипетки, чтобы отказаться от агрегатов в нижней части, а затем в 10 миллилитр очищены supernatants, добавить 0,5 миллилитров 50%nickel NTA шарик суспензии в 50 миллимолярной PBS.Поместите трубку на роторный шейкер при 200 об/мин и четыре градуса по Цельсию, чтобы аккуратно перемешать в течение 60 минут. Затем загрузите лизад и смесь никеля NTA в столбец с нижней крышкой розетки. Снимите нижнюю крышку и сохранить поток через в 15 миллилитров центрифуги трубки.Белок HIS TAG SUMO является обязательным для колонки. Связь антиген часть, которая начинается с СНГ для родной химической реакции перевязки, находится в потоке до конца. Теперь вес 1,8 миллиграмма гидразина производной fc-III пептида в две миллилитровые трубки Eppendorf и добавить 0,8 миллилитров шести молар гуанидин хлорид в 0,2 молира раствора фосфата натрия при рН 3.Вихрь, чтобы растворить порошок. После центрифугирования трубки в 7, 200 раз G в течение одной минуты при комнатной температуре передачи супернатанта в новую трубку. Добавить перемешать бар в трубке и положить трубку в ванну соляной лед на магнитный мешалка, чтобы нежно агитировать раствор в течение 15 минут.Затем добавьте 40 микролитров 0,5 нитрита натрия моляра в раствор для окисления группы гидразина. Аккуратно агитировать раствор еще 15 минут в ледяной соляной ванне. Взвешивание в 11 миллиграммов HPLC очищены и заморозить сушеные linker антигенной части, и 13,6 миллиграммов MPAA в реакционной трубке в ледяной соляной ванне.Перемешать в течение пяти минут, а затем настроить значение рН до 6,8 до 7,0 в комнате умеренной с шестью молярного гидроксида натрия. Наиболее важным шагом для родной химической перевязки является тщательное корректировка значения рН, чтобы инициировать реакцию перевязки. После 12 часов в ледяной соляной ванне, добавить 0,4 миллилитров 0,1 молярного TCEP нейтральный раствор в системе реакции, и перемешать в течение 20 минут, чтобы прекратить реакцию.После центрифугации и очистки HPLC, получить конъюгировать пик III для десульфуризации. Растворите его в 50 микролитров шести хлорида молярного гуанидиния в растворе 0,2 молярного фосфата натрия. Затем добавьте 50 микролитров одного молярного TCEP, 10 микролитров терт-бутилтиола и пять микролитров 0,1 моларного ВАО на четыре раствора.Отрегулируйте окончательный рН раствора до 6,9 и держите раствор на уровне 37 градусов по Цельсию на шейкере около пяти часов. Центрифуга и очистить снова. Растворите подготовленный пептид в 200 микролитров 32 миллимолярный ацетат серебра, а затем перемешать реакционной смеси при комнатной температуре в течение четырех часов.Чтобы преобразовать серебряные тиолаты на пептиде в свободные тиолы, добавьте три микролитера одного молярного DTT в шесть хлорида молярного гуанидиния и 0,2 молярного фосфата на рН 7. Работайте масс-спектрометр в полном режиме сканирования и установите диапазон м/з на уровне от 300 до 2000, а разрешение на 60 000. Откройте данные о массовых спектрах и найдите пики продукта на каждом шагу, чтобы подтвердить успешную реакцию химической реакции.Для выполнения elISA анализ взаимодействия между DCAF1 и 4G2 антитела, пальто каждый колодец 96-ну микротитр пластины с одним пикомол анти-GST антитела в 100 микролитров покрытия буфера. Печать пластины с уплотнением ленты и инкубировать его при 4 градусах по Цельсию на ночь на шейкере. В утреннем блоке каждая колодец с 200 микролитров 1%BSA и PBS.Печать пластины и инкубировать его комнате умеренной в течение одного часа на шейкере. Затем используйте PBS с 0,05%Tween 20 мыть каждый хорошо четыре раза. В этом протоколе для полусинтеза молекулы DCAF1 был использован родной метод химической перевязки.Массовый спектр показывает, что окончательная молекула DCAF1 имеет деконволюционный молекулярный вес 11 053. Во время анализа ELISA пептид антигена Fc-III и DCAF1 конкурентоспособно подавляют связывание антител 4G2. Оба пептида антигена и DCAF1 значительно заблокировали связывание 4G2, в то время как пептид Fc-III не повлиял на взаимодействие антигенных антител.После этого развития, этот метод проложил путь для вмешательства вредных антител связанных заболеваний. Лот из регионов, используемых для синтеза пептидов и родной химической перевязки являются высокотоксичными. Убедитесь в том, чтобы принять эти эксперименты в вашем химическом капюшоне.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Преодоление невосприимчивости в экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) штаммов мыши по усыновлению и передачи Антигенная вызов

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Измерение гриппа нейраминидазы ингибирования Титры антител методом ферментативного лектина Пробирной

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Анализ обезьяньего вируса иммунодефицита специфических CD8<sup&gt; +</sup&gt; Т-клетки в макак-резусов пептидными-MHC-I тетрамере Окрашивание

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Поток Virometry для анализа антигенные спектры вирионов и внеклеточной везикул

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Мышиные лимфоцит Этикетировочное по<sup&gt; 64</sup&gt; Си-антитело к рецептору Ориентация на<em&gt; В Vivo</em&gt; Cell Торговля ПЭТ / КТ

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

Пептид Сканирование при содействии идентификации моноклональных антител узнаваемым Линейная B-клеточный эпитоп

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Измерения гриппа, нейтрализуя антитело ответы на A(H3N2) вирусов в человеческой сыворотки, Microneutralization Assays клетки с помощью MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Метод для последовательности целевых 16S образцов материнского молока

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Антигенные липосом для поколения болезни специфические антитела

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

Идентификация мыши и репертуаров человека антитела путем Sequencing следующего поколения

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...