Name: targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)
Uploaded: 2019-09-17T13:30:00
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Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Tsinghua University-Gates (no. OPP1021992), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n. 21502103, 21877068 y 041301475), y el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (n. 2017YFA0505103).

1. Síntesis química del derivado de la hidrazina de un péptido Fc-III
<ol><li>Conversión de resina 2-Cl-(Trt)-Cl a 2-Cl-(Trt)-NHNH2 resina
	<ol>
<li>Pesar 625 mg de resina 2-Cl-(Trt)-Cl (0,25 mmol) en un recipiente de síntesis de péptidos de 25 ml.</li>
		<li>Añadir 5 ml de N,N-dimetilformamida (DMF) a la resina de la parte superior del recipiente, volver a colocar la tapa, agitar suavemente el recipiente durante 15 s y luego drenarlo. Repita el lavado DMF dos veces más.</li>
		<li>A...

<ol>
	<li>Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Physiology (4th ed.). , (2003).</li><li>Halstead, S. B., O&#8217;Rourke, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-enhanced+dengue+virus+infection+in+primate+leukocytes.">Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes.</a> Nature. 265, 739-741 (1977).</li><li>Gammon, G., Sercarz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+some+T+cells+escape+tolerance+induction.">How some T cells escape tolerance induction.</a> Nature. 342, 183-185 (1989).</li><li>Takada, A., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-dependent+enhancement+of+viral+infection:+molecular+mechanisms+and+in+vivo+implications.">Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications.</a> Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).</li><li>Boonnak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Dendritic+Cells+in+Antibody-Dependent+Enhancement+of+Dengue+Virus+Infection.">Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection.</a> Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).</li><li>Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis+-+autoantibody+characteristics+and+their+implications+for+therapy.">Myasthenia gravis - autoantibody characteristics and their implications for therapy.</a> Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).</li><li>Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis:+past,+present,+and+future.">Myasthenia gravis: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).</li><li>Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+a+dengue+vaccine.">Progress towards a dengue vaccine.</a> The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).</li><li>Vikas, K., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+Myasthenia+Gravis.">Treatment of Myasthenia Gravis.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+dual-functional+conjugate+of+antigenic+peptide+and+Fc-III+mimetics+(DCAF)+for+targeted+antibody+blocking.">Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking.</a> Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).</li><li>Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+taylor-aris+dispersion+for+measurement+of+a+solute+diffusion+coefficient+in+thin+capillaries.">Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries.</a> Science. 266, 773-776 (1994).</li><li>Fang, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+chemical+synthesis+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).</li><li>Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+chemical+synthesis+of+proteins+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).</li><li>Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+proteins+using+peptide+hydrazides+as+thioester+surrogates.">Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates.</a> Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).</li></ol>

El protocolo aquí describe la semisíntesis y la detección de DCAF1 mediante el enfoque NCL, que se muestra en la Figura 1. En resumen, los dos fragmentos de DCAF1 son sintetizados químicamente y expresados de forma recombinante, respectivamente; entonces, la molécula DCAF1 de longitud completa se ensambla, modifica y purifica. Para la síntesis de fragmentos de Fc-III derivada de la hidrazina, el uso de resina de baja capacidad 2-Cl es bastante importante, porque la alta capacidad tiene...

Los anticuerpos desempeñan un papel importante en la respuesta inmune humoral para la neutralización de bacterias y virus patógenos1. Sin embargo, algunos anticuerpos presentan impactos nocivos para los organismos, como los anticuerpos reactivos cruzados en el efecto ADE durante la infección por DENV y los anticuerpos sobrerreactivos en la miastenia grave, que es una enfermedad autoinmune2,3. El efecto ADE está mediado por los anticuerpos reactivos cruzados que hacen que el puente para conectar las células de presentación del receptor DENV y Fc4,5, mientras que la miastenia grave es causada por los anticuerpos excesivos que atacan los receptores de acetilcolina entre las uniones celulares en el tejido muscular6,7. Aunque se han desarrollado enfoques parcialmente eficaces para tratar estas enfermedades8,9, sin duda, la eliminación directa de estos anticuerpos nocivos haría progresos para las intervenciones.
Recientemente, las moléculas DCAF, que tienen grupos dual-funcionales, se han desarrollado para el bloqueo de anticuerposdirigidos 10. DCAF es un péptido largo que se compone de 3 partes: 1) una parte de antígeno que puede reconocer específicamente el anticuerpo cognado, 2) una etiqueta Fc-III o Fc-III-4C para unirse fuertemente a la región Fc del anticuerpo para inhibir el receptor Fc o complementar las proteínas componentes , 3) un vinculador largo-helical que conjuga estos dos grupos funcionales10. La parte del vinculador, diseñada a partir del dominio Moesin FERM, fue optimizada por el software Rosseta para asegurar que la parte del antígeno y la parte Fc-III en una molécula DCAF puedan unirse a las regiones Fab y Fc de IgG simultáneamente. Cuatro moléculas DCAF se han sintetizado para apuntar a 4 anticuerpos diferentes, entre ellos DCAF1 se utilizó para eliminar el anticuerpo 4G2, que es un anticuerpo reactivo cruzado durante la infección DENV para contribuir al efecto ADE; y DACF4 fue diseñado para el rescate de receptores de acetilcolina mediante el bloqueo de anticuerpos mab35 en miastenia grave10.
En el presente estudio, tomado DCAF1 como ejemplo, mostramos los protocolos para la síntesis de molécula DCAF y la detección de la interacción entre un DCAF y su anticuerpo cognado. El DCAF1 está semisintetizado por NCL approach11,12,13,14, que conjuga el derivado de la hidrazina de un péptido Fc-III y las partes expresadas del antígeno vinculador. El enfoque NCL tiene ventajas significativas sobre la síntesis totalmente química y la expresión totalmente recombinante para la síntesis DCAF1, porque ambos métodos conducen a un bajo rendimiento y un alto costo. El enfoque actual no sólo es la forma más rentable de obtener el DCAF de longitud completa, sino que también puede mantener la conformación de la parte del vinculador similar a su forma nativa. Dado que las diferentes moléculas dCAF tienen secuencias similares a excepción de las partes del antígeno, nuestros métodos para la síntesis dCAF1 y el ensayo de interacción entre el anticuerpo DCAF1 y 4G2 se pueden aplicar a otras moléculas DCAF a bloques dirigidos también sus anticuerpos cognados.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Chlorotrityl resin</td>
			<td>Tianjin Nankai HECHENG S&#38;T</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>503236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4G2 antibody</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MA5-24387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-mercaptophenylacetic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>H27658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plates</td>
			<td>NEST</td>
			<td>701001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A955</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgOAc</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30164324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GST antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>AE001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076P2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis bag</td>
			<td>Sbjbio</td>
			<td>SBJ132636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80047360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethyl ether</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10009318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH Sepharose</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30095516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrazine hydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80070418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10011018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>12399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-Thiogalactoside</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>5502-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A456</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>90600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>8100771933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide BEH C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piperidine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80104216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Extraction Kit</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B611253-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAexpress Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>32149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>20040718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10020018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;chloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Fmoc-protected amino acids</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilizing pot</td>
			<td>Tomy</td>
			<td>SX-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO Protease</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12588018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stop solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen</td>
			<td>Taihe Biotechnology Compay</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB reagent</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>421101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>91100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>T107252-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 HPLC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>YUHUA</td>
			<td>SHZ-95B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>IVGN0086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)

La eliminación de anticuerpos nocivos de los organismos es un enfoque valioso para la intervención de enfermedades asociadas a anticuerpos, como la fiebre hemorrágica del dengue y las enfermedades autoinmunes. Dado que miles de anticuerpos con diferentes epítopos están circulando en la sangre, no se informó ningún método universal, excepto el conjugado dual-funcional de péptido antigénico y miméticos Fc-III (DCAF), dirigidos a anticuerpos dañinos específicos. El desarrollo de moléculas DCAF hace una contribución significativa al progreso de la terapia dirigida, que se demostró para eliminar el efecto de mejora dependiente de anticuerpos (ADE) en un modelo de infección por el virus del dengue (DENV) y para aumentar la acetilcolina actividad del receptor en un modelo de miastenia grave. Aquí, describimos un protocolo para la síntesis de una molécula DCAF (DCAF1), que puede bloquear selectivamente el anticuerpo 4G2 para atenuar el efecto ADE durante la infección por el virus del dengue, e ilustrar la unión del anticuerpo DCAF1 a 4G2 mediante un ensayo ELISA. En nuestro método, DCAF1 se sintetiza por la conjugación de un derivado de la hidrazina de un péptido Fc-III y un recombinante expresado largo-hélice con secuencia antigénica a través de la ligación química nativa (NCL). Este protocolo se ha aplicado con éxito a DCAF1, así como a otras moléculas DCAF para apuntar a sus anticuerpos cognados.

El diagrama de flujo para la ruta de síntesis por ligadura química nativa en este artículo se muestra en la Figura 1. Las figuras 2-6 muestran los cromatogramas (A) y los espectros de masa(B) de derivados químicos de hidrazina sintetizados de un péptido Fc-III, el vinculador y la parte de antígeno expresados recombinantes, el producto purificado de la reacción NCL, el producto de la reacción de desulfuración y el producto final puri...

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Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

El desarrollo de un conjugado dual-funcional de péptido antigénico y miméticos Fc-III (DCAF) es novedoso para la eliminación de anticuerpos dañinos. Aquí, describimos un protocolo detallado para la síntesis de la molécula DCAF1, que puede bloquear selectivamente el anticuerpo 4G2 para eliminar el efecto de mejora dependiente de anticuerpos durante la infección por el virus del dengue.

Bloqueo de anticuerpos dirigido por un conjugado dual-funcional de péptido antigénico y méticos Fc-III (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...

Esto podría servir para ayudar a responder preguntas clave sobre cómo sintetizar moléculas DCAF con la neutralización de anticuerpos dirigida. Esta técnica proporciona la forma más sencilla de sintetizar las moléculas DCAF con alta productividad. El mundo decide que las moléculas DCAF tienen las posibles intervenciones al anticuerpo en los problemas de enfermedades como la fiebre del dengue y la miastenia grave.Este método se puede aplicar a otras moléculas DCAF con diferentes epítopos para atacar los anticuerpos cognados. Demostrando el procedimiento estará Xue Bai, un técnico superior de mi laboratorio. Para convertir resina de 2 cloros en resina de 2 cloro derivada de hidrazina, desde la parte superior del recipiente de síntesis de péptidos, agregue cinco mililitros de DMF a los 0,25 milimoles de resina de 2 cloro.Vuelva a colocar la tapa, agite suavemente el recipiente durante 15 segundos y, a continuación, escóndalo en un soporte de hierro. Repita el lavado DMF dos veces más. A continuación, agregue cinco mililitros de DCM al recipiente, vuelva a colocar la tapa, agite suavemente el recipiente durante 15 segundos y, a continuación, escurralo en un soporte de hierro.Repita el lavado DCM dos veces más y, a continuación, repita el lavado DMF tres veces más. A continuación, agregue seis mililitros de concentración de volumen del 50% de DMF sobre DCM para hinchar la resina durante 30 minutos y luego drenarla. Ahora transfiera seis mililitros de concentración de volumen del 5% de hidrazina y DMF al recipiente de reacción.Colóquelo en la coctelera a 120 RPM y 30 grados centígrados durante 30 minutos, y luego drene la solución con bomba de vacío. Para purificar el derivado de la hidrazina de un péptido Fc-III, utilice el sistema HPLC para purificar el péptido mediante una elución de alusión de gradiente de 30 minutos a un caudal de un mililitro por minuto. Después de la purificación de proteínas según el manuscrito, añadir en un nuevo tubo dos mililitros de un miligramo por mililitro SUMO etiquetada proteína, un mililitro de PROteasa SUMO, un mililitro de 10X SUMO tampón proteasa, y seis mililitros de agua destilada doble para preparar la solución de reacción.Incubar la mezcla durante 12 a 16 horas a cuatro grados centígrados. A continuación, aliquot la mezcla en ocho tubos de 1,5 mililitros Eppendorf, y centrifugar la mezcla a 15.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Utilice una pipeta para desechar los agregados en la parte inferior, luego en los sobrenadantes despejados de 10 mililitros, agregue 0,5 mililitros de la lodo de cordón NTA de 50%níquel en 50 PBS mililolares.Coloque el tubo en una coctelera giratoria a 200 RPM y cuatro grados centígrados para mezclar suavemente durante 60 minutos. A continuación, cargue la lisada y la mezcla de NTA de níquel en una columna con la tapa de salida inferior. Retire la tapa inferior y guarde el flujo a través de un tubo centrífugo de 15 mililitros.La proteína HIS TAG SUMO es unión en la columna. La parte del antígeno del vinculador, que comienza con el CIS para la reacción de ligadura química nativa, está en el flujo a través. Ahora pondera 1,8 miligramos de derivado de hidrazina de un péptido Fc-III en un tubo de Eppendorf de dos mililitros y añade 0,8 mililitros de seis cloruro de guanidinio molar en 0,2 solución de fosfato monosódico molar a pH 3.Vórtice para disolver el polvo. Después de centrifugar el tubo a 7, 200 veces G durante un minuto a temperatura ambiente, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Agregue una barra de agitación en el tubo y coloque el tubo en un baño de sal helada en un agitador magnético para agitar suavemente la solución durante 15 minutos.A continuación, agregue 40 microlitros de 0,5 molar de nitrito sódico a la solución para oxidar el grupo de hidrazina. Agitar suavemente la solución durante otros 15 minutos en el baño de sal helada. Pesar a 11 miligramos de la parte del antígeno del eslador seco purificado y liofilado, y 13,6 miligramos de MPAA en el tubo de reacción en el baño de sal de hielo.Revuelva durante cinco minutos y luego ajuste el valor de pH a 6.8 a 7.0 en la habitación templado con seis molares de hidróxido de sodio. El paso más crítico para la ligadura química nativa es ajustar el valor de pH cuidadosamente para iniciar la reacción de ligadura. Después de 12 horas en el baño de sal helada, agregue 0,4 mililitros de 0,1 solución neutra molar TCEP al sistema de reacción, y revuelva durante 20 minutos para terminar la reacción.Después de la centrifugación y la purificación de HPLC, obtener el pico conjugado III para la desulfuración. Disolver en 50 microlitros de seis cloruros de guanidinio molar en solución de fosfato monosódico molar 0,2. A continuación, agregue 50 microlitros de un TCEP molar, 10 microlitros de tert-Butylthiol y cinco microlitros de 0,1 molar VAO para cuatro soluciones.Ajuste el pH final de la solución a 6.9 y mantenga la solución a 37 grados centígrados en una coctelera durante unas cinco horas. Centrifugar y purificar de nuevo. Disolver el péptido preparado en 200 microlitros de 32 acetatos de plata milimétrica, y luego agitar la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante cuatro horas.Para convertir los tiolados de plata en péptidos en tioles libres, agregue tres microlitros de una TDT molar en seis cloruro de guanidinio molar, y 0,2 fosfato monosódico molar a pH 7. Utilice el espectrómetro de masas en el modo de escaneo completo y ajuste el rango m/z en 300 a 2.000 y la resolución a 60.000. Abra los datos de espectros de masa y encuentre los picos del producto en cada paso para confirmar que la reacción química se ha realizado con éxito.Para realizar el ensayo ELISA de la interacción entre el anticuerpo DCAF1 y 4G2, cubra cada pozo de una placa de microtíter de 96 pozos con un picomole de anticuerpo anti-GST en 100 microlitros de tampón de recubrimiento. Selle la placa con cintas de sellado y cíntela a 4 grados centígrados durante la noche en una coctelera. Por la mañana bloquee cada pozo con 200 microlitros de 1%BSA y PBS.Selle la placa e incuba la habitación templada durante una hora en una coctelera. A continuación, utilice PBS con 0.05%Tween 20 para lavar cada pozo cuatro veces. En este protocolo se utilizó el método de ligadura química nativa para la semisíntesis de la molécula DCAF1.El espectro de masas muestra que la molécula DCAF1 final tiene un peso molecular desconvolucional de 11,053. Durante el ensayo ELISA, el péptido antígeno Fc-III y DCAF1 inhiben competitivamente la unión de anticuerpos 4G2. Tanto el péptido antígeno como el DCAF1 bloquearon significativamente la unión 4G2, mientras que la peptita Fc-III no afectó a la interacción de anticuerpos antígenos.Después de este desarrollo, esta técnica allanó el camino para una intervención de enfermedades asociadas a anticuerpos dañinos. Lote de las regiones utilizadas para la síntesis de péptidos y ligadura química nativa son altamente tóxicos. Asegúrese de llevar estos experimentos en su capucha química.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Superar la falta de respuesta en encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) cepas de ratones resistentes a través de transferencia adoptiva y la estimulación antigénica

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Investigación

Inmunología e Infección

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

La medición de la influenza neuraminidasa inhibición títulos de anticuerpos mediante un ensayo de lectina ligado a enzimas

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Análisis de Inmunodeficiencia CD8 Simian Virus-específica<sup&gt; +</sup&gt; Células T en macacos rhesus por el péptido-MHC-I de tetrámeros La tinción

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Flujo Virometry para analizar antigénica Spectra de viriones y extracelular Vesículas

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murina de linfocitos Etiquetado por<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Anticuerpo objetivo de receptores de<em&gt; En Vivo</em&gt; Tráfico de células mediante PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

La identificación de un epítopo lineal de células B reconocido por anticuerpos monoclonales péptido Escaneo-asistida

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Medición de Influenza neutralizando las respuestas del anticuerpo al virus a (H3N2) en suero humano por microneutralización ensayos utilizando células de MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Un método de secuenciación de 16S específica de las muestras de leche humana

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Liposomas antigénicos para la generación de anticuerpos específicos de la enfermedad

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

Identificación de ratón y anticuerpos humanos repertorios por secuenciación de próxima generación

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...