Name: targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)
Uploaded: 2019-09-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av Tsinghua University-Gates Foundation (No. OPP1021992), Kinas National Natural Science Foundation (nr 21502103, 21877068 och 041301475), och Kinas nationella centrala forsknings-och utvecklingsprogram (nr 2017YFA0505103).

1. kemisk syntes av hydrazinderivatet av en FC-III-peptid
<ol><li>Konvertera 2-cl-(TRT)-cl harts till 2-cl-(TRT)-NHNH2 harts
	<ol>
<li>Väg 625 mg 2-cl-(TRT)-cl harts (0,25 mmol) till ett 25 mL peptid syntes kärl.</li>
		<li>Tillsätt 5 mL N, N-dimetylformamid (DMF) till kådan från fartygets ovansida, sätt tillbaka locket, skaka försiktigt kärlet i 15 s och Töm det sedan. Upprepa DMF-tvättning ytterligare två gånger.</li>
		<li>Tillsätt 5 mL diklormetan (DCM) till kärlet, sätt t...

<ol>
	<li>Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Physiology (4th ed.). , (2003).</li><li>Halstead, S. B., O&#8217;Rourke, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-enhanced+dengue+virus+infection+in+primate+leukocytes.">Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes.</a> Nature. 265, 739-741 (1977).</li><li>Gammon, G., Sercarz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+some+T+cells+escape+tolerance+induction.">How some T cells escape tolerance induction.</a> Nature. 342, 183-185 (1989).</li><li>Takada, A., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-dependent+enhancement+of+viral+infection:+molecular+mechanisms+and+in+vivo+implications.">Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications.</a> Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).</li><li>Boonnak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Dendritic+Cells+in+Antibody-Dependent+Enhancement+of+Dengue+Virus+Infection.">Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection.</a> Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).</li><li>Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis+-+autoantibody+characteristics+and+their+implications+for+therapy.">Myasthenia gravis - autoantibody characteristics and their implications for therapy.</a> Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).</li><li>Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+gravis:+past,+present,+and+future.">Myasthenia gravis: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).</li><li>Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+a+dengue+vaccine.">Progress towards a dengue vaccine.</a> The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).</li><li>Vikas, K., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+Myasthenia+Gravis.">Treatment of Myasthenia Gravis.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+dual-functional+conjugate+of+antigenic+peptide+and+Fc-III+mimetics+(DCAF)+for+targeted+antibody+blocking.">Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking.</a> Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).</li><li>Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+taylor-aris+dispersion+for+measurement+of+a+solute+diffusion+coefficient+in+thin+capillaries.">Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries.</a> Science. 266, 773-776 (1994).</li><li>Fang, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+chemical+synthesis+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).</li><li>Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+chemical+synthesis+of+proteins+by+ligation+of+peptide+hydrazides.">Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).</li><li>Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+proteins+using+peptide+hydrazides+as+thioester+surrogates.">Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates.</a> Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).</li></ol>

Protokollet beskriver här semisyntesen och detektion av DCAF1 med hjälp av NCL-metoden, som visas i figur 1. Kortfattat, de två fragment av DCAF1 är kemisk syntetiseras och recombinantly uttryckt, respektive; då är den fulla längden DCAF1 molekylen monterad, modifierad och renad. För hydrazin härledda FC-III fragment syntes, med låg kapacitet 2-cl harts är ganska viktigt, eftersom hög kapacitet har en negativ effekt för hydrazin generation och leder till låg avkastning av produ...

Antikroppar spelar viktiga roller i humorala immunsvaret för neutraliseringen av patogena bakterier och virus1. Emellertid, vissa antikroppar uppvisar skadliga effekter på organismer, såsom cross-reaktiva antikroppar i ade-effekten under denV-infektion och over-reaktiva antikroppar i myasthenia gravis, som är en autoimmuna sjukdomar2,3. ADE-effekten medieras av de tvär reaktiva antikropparna som gör att bryggan ansluter denV och FC-receptorn som visar cellerna4,5, medanmyasthenia gravis orsakas av de överdrivna antikropparna som angriper acetylkolinreceptorer mellan cell-cell korsningar i muskelvävnad6,7. Även om delvis effektiva metoder har utvecklats för att behandla dessa sjukdomar8,9, skulle otvivelaktigt direkt eliminering av dessa skadliga antikroppar göra framsteg för insatserna.
Nyligen har DCAF-molekyler, som har Dual-funktionella grupper, utvecklats för riktade antikroppar blockering10. DCAF är en lång peptid som består av 3 delar: 1) en antigen del som kan specifikt känna igen den besläktat antikroppen, 2) en FC-III eller FC-III-4c tagg för starkt bindning till FC regionen av antikroppen att hämma antingen FC-receptorn eller komplement komponent proteiner , 3) en lång α-spiralformade länkare som konjugatar dessa två funktionella grupper10. Den länkare del, designad från Moesin FERM domän, var optimerad av Rosseta programvara för att säkerställa antigen del och FC-III del i en DCAF molekyl kan binda till Fab och FC regioner av IgG samtidigt. Fyra DCAF molekyler har syntetiserats för att rikta 4 olika antikroppar, bland dem DCAF1 användes för att eliminera 4G2 antikropp, som är en cross-reaktiv antikropp under DENV infektion att bidra till ADE effekt; och DACF4 var avsedd för räddning av acetylkolinreceptorer genom att blockera mab35 antikropp i myasthenia gravis10.
I den aktuella studien, tagen DCAF1 som exempel, visade vi protokollen för syntes av DCAF-molekylen och upptäckten av interaktionen mellan en DCAF och dess besläktat antikropp. Den DCAF1 är semi-syntetiseras av NCL-metoden11,12,13,14, som konjugatet hydrazin derivatan av en FC-III peptid och de uttryckta Linker-antigen delar tillsammans. NCL-metoden har betydande fördelar jämfört med helt kemisk syntes och helt rekombinant uttryck för DCAF1 syntes, eftersom båda dessa metoder leder till låg avkastning och höga kostnader. Den nuvarande metoden är inte bara det mest kostnadseffektiva sättet att få full längd DCAF, men också kan upprätthålla konformation av länkaren del liknande som sin ursprungliga form. Eftersom olika DCAF-molekyler har liknande sekvenser med undantag för antigendelarna, kan våra metoder för DCAF1 syntes och interaktions analysen mellan DCAF1 och 4g2-antikroppar appliceras på andra DCAF-molekyler för att målinriktat blockera deras besläktat-antikroppar också.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Chlorotrityl resin</td>
			<td>Tianjin Nankai HECHENG S&#38;T</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>00706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>503236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4G2 antibody</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MA5-24387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-mercaptophenylacetic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>H27658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plates</td>
			<td>NEST</td>
			<td>701001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A955</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgOAc</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30164324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GST antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>AE001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076P2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis bag</td>
			<td>Sbjbio</td>
			<td>SBJ132636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80047360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethyl ether</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10009318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH Sepharose</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30095516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrazine hydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80070418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10011018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>12399-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-Thiogalactoside</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>5502-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A456</td>
			<td>MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>90600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>8100771933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide BEH C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piperidine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80104216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Extraction Kit</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B611253-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAexpress Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>32149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid DNA Ligation Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>D7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>20040718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10020018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium&#160;chloride</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Fmoc-protected amino acids</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilizing pot</td>
			<td>Tomy</td>
			<td>SX-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO Protease</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12588018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stop solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen</td>
			<td>Taihe Biotechnology Compay</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB reagent</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>421101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>91100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>T107252-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 HPLC</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>YUHUA</td>
			<td>SHZ-95B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>IVGN0086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted antibody blocking by a dual-functional conjugate of antigenic peptide and fc-iii mimetics (dcaf)

Eliminering av skadliga antikroppar mot organismer är en värdefull metod för ingripande av antikroppsrelaterade sjukdomar, såsom denguefeber och autoimmuna sjukdomar. Eftersom tusentals antikroppar med olika epitoper cirkulerar i blod, har ingen universell metod, med undantag för Dual-funktionell konjugat av antigen peptid och FC-III mimetika (DCAF), rapporterats att rikta specifika skadliga antikroppar. Utvecklingen av DCAF molekyler ger betydande bidrag till utvecklingen av riktad terapi, som visades för att eliminera antikroppsberoende Enhancement (ADE) effekt i en Dengue virus (DENV) infektion modell och att öka acetylkolin receptor aktivitet i en myasthenia gravis-modell. Här beskriver vi ett protokoll för syntes av en DCAF-molekyl (DCAF1), som selektivt kan blockera 4G2-antikroppar för att dämpa ADE-effekten under Denguevirusinfektion, och illustrera bindningen av DCAF1 till 4G2-antikroppar med en ELISA-analys. I vår metod, DCAF1 syntetiseras av konjugering av en hydrazin derivat av en FC-III peptid och en rekombinant uttryckt lång α-Helix med antigen sekvens genom inhemska kemisk ligering (NCL). Detta protokoll har tillämpats framgångsrikt på DCAF1 samt andra DCAF molekyler för att rikta sina besläktat antikroppar.

Flödesschemat för syntes rutten genom ursprunglig kemisk ligering i den här artikeln visas i figur 1. Figurerna 2-6 visar kromatogrammen (a) och Mass spektra (B) av kemiskt syntetiserade Hydrazinderivat av en FC-III-peptid, rekombinant uttryckt länkare och antigen del, den renade produkten från NCL-reaktionen, den renade produkt från desulfuriseringsreaktion och den renade slutprodukten DCAF1, respektive. Kromatogrammen visar de renar ...

Watch this Scientific Journal Video about Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF at JoVE.com

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

Utveckling av en dual-funktionell konjugat av antigen peptid och FC-III mimetika (DCAF) är nytt för eliminering av skadliga antikroppar. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för syntes av DCAF1 molekyl, som selektivt kan blockera 4G2 antikropp för att eliminera antikroppsberoende förbättring effekt under Dengue virusinfektion.

Riktad antikropp blockering av en dual-funktionell konjugat av antigen peptid och FC-III mimetika (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...

Detta kan tjäna till att hjälpa till att svara på viktiga frågor om hur man syntetisera DCAF molekyler med riktade antikroppar neutralisering. Denna teknik ger det enklaste sättet att syntetisera av DCAF molekyler med hög produktivitet. Världen bestämmer DCAF molekyler har potentiella insatser mot antikroppen i handlar om sjukdomar som Denguefeber och myasthenia gravis.Denna metod kan appliceras på andra DCAF-molekyler med olika epitoper för att rikta in sig på kognatantikropparna. Demonstrera förfarandet kommer att Xue Bai, en senior tekniker från mitt laboratorium. För att konvertera 2-Klorharts till hydrazin härledd 2-Klorharts, från toppen av peptidsynteskärlet, tillsätt fem milliliter DMF till 0,25 millimoles av 2-Klorharts.Sätt på locket igen, skaka försiktigt kärlet i 15 sekunder och dränera den sedan på ett järnstativ. Upprepa DMF-tvättningen ytterligare två gånger. Tillsätt sedan fem milliliter DCM till kärlet, sätt på locket igen, skaka försiktigt kärlet i 15 sekunder och dränera det sedan på ett järnstativ.Upprepa DCM-tvättningen ytterligare två gånger och upprepa sedan DMF-tvättningen ytterligare tre gånger. Därefter lägger du till sex milliliter av 50%volymkoncentration av DMF över DCM för att svälla hartset i 30 minuter och sedan dränera den. Överför nu sex milliliter 5%volymkoncentration av hydrazin och DMF till reaktionskärlet.Placera den på skakmaskinen vid 120 RPM och 30 grader celsius i 30 minuter, och töm sedan av lösningen genom vakuumpump. För att rena hydrazinderivatet av en Fc-III-peptid, använd HPLC-systemet för att rena peptiden med en 30 minuters gradient allusion elution med en flödeshastighet på en milliliter per minut. Efter proteinrening enligt manuskriptet, lägg i ett nytt rör två milliliter på ett milligram per milliliter SUMO taggat protein, en milliliter sumo proteas, en milliliter av 10X SUMO proteas buffert, och sex milliliter dubbeldestillerat vatten för att förbereda reaktionslösningen.Inkubera blandningen i 12 till 16 timmar vid fyra grader celsius. Sedan aliquot blandningen i åtta 1,5 milliliter Eppendorf rör, och centrifug blandningen vid 15, 000 gånger G i 10 minuter vid fyra grader celsius. Använd en pipet att kasta aggregat längst ner, sedan i 10 milliliter rensas supernatanter, tillsätt 0,5 milliliter av 50%nickel NTA pärla slurry i 50 millimolar PBS.Placera röret vid en roterande skakmaskin vid 200 RPM och fyra grader celsius för att försiktigt blanda i 60 minuter. Därefter laddar du ner lisaden och nickel NTA-blandningen i en kolonn med bottenutloppslocket. Ta bort bottenlocket och spara flödet genom i en 15 milliliter centrifugrör.HIS TAG SUMO-proteinet är bindande på kolonnen. Den linker antigen del, som börjar med CIS för inhemska kemiska ligatur reaktion, är i flödet genom. Nu vikt 1,8 milligram hydrazin derivat av en Fc-III peptid i en två milliliter Eppendorf röret och tillsätt 0,8 milliliter av sex molar guanidinium klorid i 0,2 molar mononatriumfosfat lösning vid pH 3.Vortex för att lösa upp pulvret. Efter centrifugering röret på 7, 200 gånger G i en minut vid rumstemperatur överföra supernatanten i ett nytt rör. Lägg till en rörbaj i röret och lägg röret i ett issaltbad på en magnetisk omrörare för att försiktigt agitera lösningen i 15 minuter.Tillsätt sedan 40 mikroliter av 0,5 molar natriumnittrit till lösningen för att oxidera hydrazingruppen. Agitera försiktigt lösningen i ytterligare 15 minuter i issaltbadet. Väg in på 11 milligram hplc renas och frysa torkade länkare antigen del, och 13,6 milligram MPAA i reaktionsröret i isen saltbad.Rör om i fem minuter och justera sedan pH-värdet till 6,8 till 7,0 vid rums tempererat med sex molar natriumhydroxid. Det mest kritiska steget för inhemsk kemisk ligatur är att justera pH-värdet noggrant för att initiera ligeringsreaktionen. Efter 12 timmar i issaltbadet, tillsätt 0,4 milliliter 0,1 molar TCEP neutral lösning på reaktionssystemet, och rör om i 20 minuter för att avsluta reaktionen.Efter centrifugering och HPLC-rening erhåller du konjugaten peak III för avsvavling. Lös upp den i 50 mikroliter av sex molar guanidiniumklorid i 0,2 molar mononatriumfosfatlösning. Tillsätt sedan 50 mikroliter av en molar TCEP, 10 mikroliter tert-Butylthiol, och fem mikroliter av 0,1 molar VAO för fyra lösning.Justera lösningens slutliga pH-värde till 6,9 och håll lösningen på 37 grader celsius på en skakre i cirka fem timmar. Centrifug och rena igen. Lös den beredda peptiden i 200 mikroliter på 32 millimolarsilveracetat, och rör sedan om reaktionsblandningen i rumstemperatur i fyra timmar.För att omvandla silvertinokterna på peptid till fria tioler, tillsätt tre mikroliter av en molar DTT i sex molar guanidiniumklorid, och 0,2 molar mononatriumfosfat vid pH 7. Manövrera masspektrometern i hela skanningsläget och ställ in m/z-området på 300 till 2, 000 och upplösning på 60, 000. Öppna massspektradata och hitta produktens toppar i varje steg för att bekräfta att den kemiska reaktionen utförs framgångsrikt.För att utföra ELISA-analys av interaktionen mellan DCAF1 och 4G2-antikropp, belägga varje brunn av en 96-väl mikrotiterplatta med en picomole av anti-GST-antikropp i 100 mikroliter av beläggningsbuffert. Täta plattan med tätningsband och inkubera den vid 4 grader celsius över natten på en shaker. I morgonblocket varje brunn med 200 mikroliter av 1%BSA och PBS.Försegla plattan och ruva den rum tempererat i en timme på en shaker. Använd sedan PBS med 0,05%Tween 20 för att tvätta varje brunn fyra gånger. I detta protokoll användes den infödda kemiska ligationmetoden för semisynthesisen av DCAF1-molekylen.Massspektrumet visar att den slutliga DCAF1-molekylen har en dekonvolutionell molekylär vägning på 11, 053. Under ELISA-analysen hämmar antikroppsbindningen antikroppsbindning antikroppsbindning antikroppsbindning mot antikroppspeptid i antikroppspeptid antikroppen. Både antigen peptid och DCAF1 blockerade betydligt 4G2 bindning medan fc-III peptite inte påverkade antigen antikropp interaktion.Efter denna utveckling banade denna teknik vägen för en intervention av skadliga antikroppsrelaterade sjukdomar. Lot's av de regioner som används för peptidsyntes och inhemska kemiska ligatur är mycket giftiga. Se till att ta dessa experiment i din kemiska huva.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Övervinna svarsbenägenhet i experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) Resistenta musstammar genom adoptiv överföring och Antigen Challenge

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Mätning influensaneuraminidas Inhibition Antikroppstitrar genom enzymkopplad lektin analys

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analys av Simian Immunodeficiency Virus-specifika CD8<sup&gt; +</sup&gt; T-celler i rhesusmakaker av peptid-MHC-I tetramer färgning

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Flöde Virometry Analysera Antigen Spectra virioner och extracellulär Blåsor

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murina Lymfocyt Märkning av<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-antikroppreceptor Targeting för<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Trafficking med PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

Peptid Scanning-assisterad Identifiering av en monoklonal antikropp-erkända Linear B-cell-epitop

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Mäta influensa neutraliserande antikroppen Svaren till A(H3N2) virus i Humansera av mikroneutraliserings-analyser med MDCK-SIAT1 celler

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

En metod för riktade 16S sekvensering av bröstmjölk prover

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Antigena liposomer för generering av sjukdom-specifika antikroppar

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

Identifiering av mus och Human antikropp repertoarer av nästa generations sekvensering

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...