Name: purification of human s100a12 and its ion-induced oligomers for immune cell stimulation
Uploaded: 2019-09-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra det murene innovative Medical Research program fra Muenster University Medical Faculty (KE121201 to C.K.) og den tyske Research Foundation (DFG, Fo354/3-1 til D.F.).

Bemærk: Se supplerende tabel 1 for klargøring af buffere og stamopløsninger.
1. protein ekspression i E. coli
<ol><li>
Kloning
	<ol>
<li>Klon tag-fri Human S100A12 (NCBI reference sekvens: NP_ 005612.1) i bakteriel udtryk vektor pET11b. For at udtrykke proteinet, omdanne konstruktionen til E. coli BL21 (DE3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kultur
	<ol>
<li>Forbered en start kultur ved at inokulere en enkelt kol...

<ol>
	<li>Liston, A., Masters, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostasis-altering+molecular+processes+as+mechanisms+of+inflammasome+activation.">Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).</li><li>Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocyte-derived+S100+proteins+in+autoinflammation:+putative+role+in+pathogenesis+and+usefulness+as+biomarkers.">Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers.</a> Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).</li><li>Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+circular+dichroism+studies+of+iron(ii)+binding+to+human+calprotectin.">Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin.</a> Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).</li><li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein.">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).</li><li>Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nickel+Sequestration+by+the+Host-Defense+Protein+Human+Calprotectin.">Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).</li><li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12.">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex:+implications+for+host-parasite+defence.">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li><li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc:+new+insights+into+S100A12+oligomerisation.">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).</li><li>Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+the+human+(S100A8/S100A9)2+heterotetramer,+calprotectin,+illustrates+how+conformational+changes+of+interacting+alpha-helices+can+determine+specific+association+of+two+EF-hand+proteins.">The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+Ca2++and+Zn2++are+essential+for+S100A12+protein+oligomerization+and+function.">Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function.</a> BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).</li><li>Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ions+binding+to+S100+proteins.+I.+Calcium-+and+zinc-binding+properties+of+bovine+brain+S100+alpha+alpha,+S100a+(alpha+beta),+and+S100b+(beta+beta)+protein:+Zn2++regulates+Ca2++binding+on+S100b+protein.">Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).</li><li>Dell&#8217;Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+and+binding+properties+of+calgranulin+C,+a+novel+S100-like+calcium-binding+protein+from+pig+granulocytes.">Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).</li><li>Vogl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A12+is+expressed+exclusively+by+granulocytes+and+acts+independently+from+MRP8+and+MRP14.">S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).</li><li>Hofmann, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+mediates+a+novel+proinflammatory+axis:+a+central+cell+surface+receptor+for+S100/calgranulin+polypeptides.">RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides.</a> Cell. 97 (7), 889-901 (1999).</li><li>Foell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+S100A12+Can+Activate+Human+Monocytes+via+Toll-like+Receptor+4.">Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).</li><li>Kessel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+zinc+tune+autoinflammatory+Toll-like+receptor+4+signaling+by+S100A12.">Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).</li><li>Armaroli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-Derived+Interleukin-1beta+As+the+Driver+of+S100A12-Induced+Sterile+Inflammatory+Activation+of+Human+Coronary+Artery+Endothelial+Cells:+Implications+for+the+Pathogenesis+of+Kawasaki+Disease.">Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).</li><li>GE Healthcare. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Strategies for Protein Purification. Handbook. , (2010).</li><li>Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+Purification,+and+Antimicrobial+Activity+of+S100A12.">Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).</li><li>Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+S100+Protein-Protein+Complexes.">Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).</li><li>Magalhaes, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+endotoxin+removal+from+biological+preparations:+a+review.">Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review.</a> Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).</li><li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+removal+from+protein+solutions.">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li><li>Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+partial+characterization+of+canine+S100A12.">Purification and partial characterization of canine S100A12.</a> Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).</li><li>Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+human+Ca2+-bound+S100A12.">Solution structure of human Ca2+-bound S100A12.</a> Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).</li><li>Endotoxin Removal. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Application Note - Sartorius Stedim Biotech. , (2010).</li><li>Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymyxin-B+Stimulates+Production+of+Complement+Components+and+Cytokines+in+Human+Monocytes.">Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).</li><li>Valentinis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+effects+of+polymyxin+B+on+human+dendritic+cells+maturation+-+The+role+of+I+kappa+B-alpha/NF-kappa+B+and+ERK1/2+pathways+and+adhesion.">Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).</li><li>Teuber, M., Miller, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Binding+of+Polymyxin-B+to+Negatively+Charged+Lipid+Monolayers.">Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).</li></ol>

I denne protokol beskriver vi tag-fri bakterielle udtryk for human S100A12 og dets rensning samt adskillelse i forskellige ion-induceret oligomerer til immuncelle stimulation. Sammenlignet med offentliggjort litteratur om S100A12 protein rensning8,23,24, brugen af høj CaCl2 (25 mm) i hydrofobe-interaktion kromatografi er at vores viden unik. Flere protokoller, der anvender koncentrationer fra 1 til 5 mM producerer re...

S100A12 er et calcium bindende protein, som overvejende produceres af humane granulocytter. Proteinet over udtrykkes under (systemisk) inflammation og dets serumniveauer, især i (Auto) inflammatoriske sygdomme som systemisk juvenil idiopatisk arthritis (sJIA), familiær middelhavsfeber (FMF) eller Kawasakis sygdom (KD) kan informere om sygdomsaktivitet og respons på behandlingen. Afhængigt af mønstergenkendelse receptorer (PRRs) såsom bompenge-lignende receptorer (TLRs), det medfødte immunsystem kan aktiveres ved patogen-associerede molekylære mønstre (pamper) som lipopolysaccharider (LPS) eller skade tilknyttede molekylære mønstre (DAMPs; også betegnet "alarmins"). DAMPs er endogene molekyler såsom cellulære proteiner, lipider eller nukleinsyrer1. Fugtige funktioner er godt beskrevet for medlemmerne af calgranulin protein familien, S100A8/A9 og S100A122, som også rapporteres at fungere som divalent metal ion-chelerende antimikrobielle peptider3,4, 5,6. Afhængigt af den tilgængelige ion-styrke S100A12 kan, ligesom andre medlemmer af S100 familien, arrangere i forskellige homomultimere, og indtil for nylig var virkningen af S100A12-oligomerisering på PRR-interaktion, især TLR4, ukendt.
Proteinets monomeriske form (92 aminosyrer, 10,2 kDa) består af to EF-Hand Helix-loop-Helix-strukturer forbundet med en fleksibel linker. C-TERMINALENS EF-hånd indeholder det klassiske ca2 +bindende motiv, mens N-terminalens EF-hånd udviser en S100 protein specifik udvidet sløjfe struktur ("pseudo-EF-hånd") og afslører reduceret ca2 +-affinitet. Ca2 +-binding af S100A12 kan inducere en større konformationsmæssige ændring i proteinerne C-Terminus, hvilket resulterer i eksponering af et hydrofobe plaster på hver monomer og danner denne-grænsefladen. Under fysiologiske forhold er den mindste kvaternære struktur dannet af S100A12 således en ikke-kovalent dimer (ca. 21 kDa), hvor individuelle monomerer er i antiparallel orientering. Når det er arrangeret som dimer, S100A12 er rapporteret til eller beslaglæggelse Zn2 + samt andre divalent metalioner, f. eks cu2 + med høj affinitet7. Disse ioner koordineres ved S100A12 dimer grænseflade af aminosyrer H15 og D25 af en underenhed og H85 samt H89 af anti-paralleling anden underenhed8,9,10. Mens tidligere undersøgelser foreslår, at Zn2 +-loaded S100A12 kan inducere proteinets organisation til homo-tetramers (44 kDa) og til at resultere i øget ca2 +-affinitet11,12, seneste metal titrering undersøgelser6 foreslår ca2 +-binding af S100A12 for at øge proteinets affinitet til Zn2 +. Når S100A12 EF-hænderne er fuldt besat af ca2 +, er yderligere ca2 + menes at binde mellem dimers, udløser hexamer formation (ca. 63 kDa). Arkitekturen i den hexameriske kvarternære struktur er klart forskellig fra den af tetramer. Det foreslås, at transthyretin-grænsefladen afbrydes for at give anledning til nye dimer-dimer-grænseflader, der gavner hexamer formation10. S100A12 er næsten udelukkende udtrykkes af humane granulocytter, hvor det udgør omkring 5% af alle cytosolisk protein13. I sin fugtige funktion S100A12 blev historisk beskrevet som agonist af multi-ligand-receptoren for avancerede glykering slutprodukter (Rage), derefter betegnet ekstracellulære nyligt identificerede Rage-binding protein (en-Rage)14. Omend vi tidligere rapporterede biokemiske S100A12-binding til både RAGE og TLR415, vi for nylig viste humane monocytter til at reagere på S100A12 stimulation i en TLR4-afhængig måde16. Dette kræver arrangement af S100A12 i sin ca2 +/Zn2 +-induceret hexameric Kvartære struktur16.
Her beskriver vi en rensnings procedure for rekombinant Human S100A12 og dens ion-inducerede oligomerer til immuncelle stimuleringer16,17. Dette er baseret på en to-trins kromatografi strategi, som i første omgang omfatter en anion-udvekslings kolonne for at isolere og koncentrere proteinet og fjerne masse forureninger (f. eks. endotoksiner/lipopolysaccharider)18. Ionbytningskromatografi harpiks udskille proteiner på grundlag af forskellige netto overflade ladninger. For sure proteiner som S100A12 (isoelektrisk punkt af 5,81), et buffersystem med en pH på 8,5 og en stærk anionbytter harpiks fører til en god adskillelse. Bundne proteiner blev elueret med et højsalt buffer forløb. Med en forøgelse af ionstyrke negative ioner i elueringsbufferen konkurrerer med proteiner for afgifter på overfladen af harpiks. Proteiner individuelt elueres afhængigt af deres netto ladning og i følge heraf, de buffere beskrevet heri gør det muligt at isolere og koncentrere det over udtrykte S100A12 protein. På grund af negativt ladede grupper i lipopolysaccharider binder disse molekyler sig også til anionbytter harpiks. Men deres højere netto ladning resulterer i senere eluering i den anvendte High-salt gradient. Det andet trin i rensningsproceduren er indført med henblik på polering. Dette gør brug af calcium binding evne S100A12 og fjerner resterende urenheder på en hydrofobe-interaktion kolonne. Calcium binding af S100A12 fører til en konformationel ændring og en eksponering af hydrofobe pletter på overfladen af proteinet. På denne betingelse, S100A12 interagerer med den hydrofobiske overflade af harpiks. Ved calcium-Chelat ved EDTA, denne interaktion er vendt. I nærværelse af ioner, især calcium og zink, S100A12 arrangerer til homomeriske oligomerer. For at studere struktur-funktion relationer af de forskellige oligomerer, stabiliserede vi dimeric, tetrameric og hexameric rekombinant S100A12 med en kemisk kryds linker og adskilte komplekser på en størrelses-udelukkelse kromatografikolonne. Endelig, at analysere funktionalitet og biologisk aktivitet af det rensede protein og dets ion-induceret oligomerer, cytokin frigivelse af S100A12 og LPS stimuleret monocyt kan sammenlignes.
Der er hidtil blevet beskrevet forskellige metoder til rensning af S100A12. F. eks. har Jackson et al.19udgivet en protokol med rensning via en anionbytnings kolonne og en efterfølgende kromatografi med størrelses udelukkelse. Rensning polering på en størrelse-udelukkelse kolonne fører til gode resultater, men-på grund af for eksempel begrænset lastning mængder-er mindre fleksibel i skalerbarhed. En anden tilgang, udgivet af Kiss et al.20, beskriver rensning af mærket protein via ni2 + affinitets kolonne som det første rensningstrin, efterfulgt af enzymatisk spaltning for at fjerne tagget og yderligere rensningstrin. I modsætning til de forlagte undersøgelser19,20, er det producerede protein som beskrevet i denne protokol bestemt til forsøg på immunceller. Derfor er rest endotoksin forurening fra bakteriel kultur en udfordring. Selv om der hidtil er blevet beskrevet forskellige tilgange til fjernelse af endotoksin, findes ingen ensartet metode, der fungerer lige godt for en given proteinopløsning21,22.
Sammenfattende kombinerer vores protokol fordelene ved et mærkat frit udtryk i et bakterie system med effektiv endotoksin fjernelse og højt udbytte af rent protein.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pET11b vector</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x Non-essential amino acids</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K 0293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% HCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X897.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8722;20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciumchlorid Dihydrat</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5239.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human Monocyte Enrichment Kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19059</td>
			<td>Magnetic negative cell isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoLISA</td>
			<td>Hyglos</td>
			<td>609033</td>
			<td>Endotoxin detection assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxin-Free Ultra Pure Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TMS-011-A</td>
			<td>Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoTrap red</td>
			<td>Hyglos</td>
			<td>321063</td>
			<td>Endotoxin removal resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (heat-inactivated)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (high quality, endotoxin testet)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hTNF-alpha - OptEia ELISA Set</td>
			<td>BD</td>
			<td>555212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (isopropyl-&#223;-D-thiogalactopyranosid)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN08.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K 0282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Medium</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L6529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll, human</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-60500</td>
			<td>Separation solution (density gradient centrifugation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A 2212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl Sepharose High Performance</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1082-01</td>
			<td>Resin for hydrophobic interaction chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-pmb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Sepharose Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0510-01</td>
			<td>Resin for anion-exchange chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSep buffer</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>20104</td>
			<td>Cell separation buffer (section 5.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F 1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3957.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P031.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SLHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL roundbottom tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Erlenmyer flask</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>LY98.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well suspension plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 L measuring beaker</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CKN3.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL high-speed centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3,01,22,178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (100 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing Closures</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep magnet &#39;The Big Easy`</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector tubes 5 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>115101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox film, 25 &#181;m, 305 mm x 40 m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94,60,77,316</td>
			<td>Film for monocyte culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa)</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop filter unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C Incubator (with shaking)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA purifier UPC 10</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>FPLC System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Frac-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (with rotor A-4-81)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F-34-6-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean Tetra Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPhotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>P330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Brandelin</td>
			<td>UW2070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>infinite M200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Knick</td>
			<td>765</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of human s100a12 and its ion-induced oligomers for immune cell stimulation

I denne protokol beskriver vi en metode til at rense humant calcium bindende protein S100A12 og dets ion-inducerede oligomerer fra Escherichia coli -kulturen for immuncelle stimuleringer. Denne protokol er baseret på en to-trins kromatografi strategi, som består af protein forrensning på en anion-udvekslings kromatografikolonne og et efterfølgende polerings trin på en hydrofobe-interaktions kolonne. Denne strategi producerer S100A12 protein af høj renhed og udbytte til overkommelige omkostninger. For funktionelle assays på immunceller en eventuel rest endotoksin forurening kræver omhyggelig overvågning og yderligere rengøring trin for at opnå endotoksin-fri protein. De fleste af endotoksin forureninger kan udelukkes ved anionbytnings kromatografi. For at nedbryder resterende forureninger, denne protokol beskriver en fjernelse trin med centrifugal filtre. Afhængigt af den tilgængelige ion-styrke S100A12 kan arrangere i forskellige homomultimere. For at undersøge forholdet mellem struktur og funktion beskriver denne protokol yderligere Ion-behandling af S100A12 protein efterfulgt af kemisk tværbinding for at stabilisere S100A12 oligomerer og deres efterfølgende adskillelse efter størrelses udelukkelse Kromatografi. Endelig beskriver vi en celle baseret analyse, der bekræfter den biologiske aktivitet af det rensede protein og bekræfter LPS-fri forberedelse.

Efter forrensning på AIEX-søjlen (figur 1a-C) og efterfølgende calcium afhængige HIC (figur 2a, B) blev der opnået meget rent protein (figur 2c). Desuden, målinger af endotoksin afsløret vellykket LPS fjernelse. LPS-indholdet efter AIEX blev målt i en 1:10-fortynding over test detektionsgrænsen, dvs., over 500 EU/mL. Efter den første filtrering gennem en 50 kDa-filterenhed blev LPS-indhold...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation at JoVE.com

Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

Denne protokol beskriver en rensningsmetode for rekombinant tagfrit calcium bindende protein S100A12 og dets ioninducerede oligomerer for humane monocyt-stimulerings analyser.

Rensning af humane S100A12 og dets Ioninducerede oligomerer til Immuncelle stimulation

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

Denne protokol beskriver en komplet rensning procedure for det menneskelige calcium bindende protein, S100A12, og især, for det er forskellige ion-induceret oligomerer for downstream forskning konsekvenser. Med denne teknik er vi i stand til at opretholde et højt udbytte af meget rent og endoksinfrit protein. Kemisk krydsbinding og adskillelse på størrelsesekelukkel af kromatografi er en overbevisende metode til at generere homo-oligomeriske proteiner til yderligere funktionelle analyser.Vores teknik giver os mulighed for at mekanistiske aspekter af S100A12 som mønstergenkendelse receptor ligand og kunst information til ideelt at udvikle nye målrettede interventioner og forbedre diagnostiske analyser. Ud over at se denne video anbefaler vi en omhyggelig læsning af protokollen, da vi beskriver en kompleks, multi-trins procedure. Til at begynde, skære en dialyse slange i en passende længde, omkring 30 centimeter, med ekstra plads til luft.Læg membranen i blød i deioniseret vand i 15 til 30 minutter for at fjerne glycerol. For at reducere viskositeten af den clearede proteinopløsning fortyndes opløsningen med 25 milliliter AIEX-buffer A.Fastgør den første lukning på slangen. Prøven indlæses i membranen, og fastgør den anden lukning mindst en centimeter fra den øverste ende af slangen.I et afkølet rum ved fire grader Celsius, placere beholderen med AIEX buffer A på en røre plade, tilsæt en røre bar, og membranen fyldt med proteinopløsning. Juster hastigheden for at rotere prøven, så der ikke er interferens med den roterende rørebjælke. Dialyze i 12 til 24 timer ved fire grader Celsius derefter erstatte dialyzed buffer med gratis pre-afkølet buffer A og fortsætte i mindst fire ekstra timer.Den dialyserede proteinopløsning overføres fra slangen til et 50 milliliterrør gennem en 0,45 mikronfilterenhed. Start FPLC med generel vedligeholdelse. Forbind kolonnebuffere AIEX A og AIEX B til bufferventiler og anionbytter harpiks, der indeholder kolonne til kolonneportene i FPLC.Juster de generelle kromatografiske parametre i overensstemmelse hermed. Start AIEX-programmet i FPLC-softwaren, og vælg jævnsybningsvolumen for buffer A.Efterfølgende indlæses prøven på kolonnen, og få proteinerne med en lineær gradient fra 0% til 100% høj saltbuffer. Opsaml to milliliterfraktioner under elution.Analysér de eluterede brøker efter afslutningen af løbet. Til dette, belastning 10 mikroliter af hver fraktion på en Coomassie farves 15% SDS side og identificere fraktioner, der indeholder S100A12. Pool disse S100A12 indeholdende fraktioner til dialyse i TRIS-bufferet saltvand.For at fortsætte proteinrensningen tilsættes der efter proteindialyse en calciumchlorid til prøven til en endelig koncentration på 25 millimolar, hvilket vil lette bindingen af S100A12 til harpiksen i næste trin. Derefter filtreres prøven gennem et filter med en hældstørrelse på 0,45 mikron. Ligevægt HIC buffere og prøver til fire grader Celsius.Derefter skal du forbinde kolonnebuffere HIC A og B og kolonnen til systemet og justere parametrene. Start metoden for at ligevægte kolonnen med en til to kolonnemængder af buffer-HHIC A, og indlæs prøven, og vaskebloken med et UV-signal når baselineniveauet igen. Start derefter elution med en calciumchelator, der indeholder buffer EDTA.Opsaml to milliliter topfraktioner under elution. Efter at have analyseret 10 mikroliter af hver fraktion på en Coomassie plettet 15% SDS side identificere rene S100A12 fraktioner. Pool disse fraktioner og dialyze mod HBS.Læg først 15 milliliter prøve på en 50 kilodalton centrifugalfilterenhed. Centrifuge ved 3200 gange g ved 10 grader Celsius i ca. 10 minutter. Overfør den filtrated flow-through i en frisk beholder, på is.Brug nu en milliliter HBS til at skylle filtermembranen og til fortynding af den koncentrerede opløsning i filterspidsen. Centrifuge igen for at genvinde så meget protein som muligt i flow-through. For at filtrere opløsningen gentages prøvebelastningen og centrifugering så ofte som nødvendigt.Dernæst, at koncentrere S100A12 indeholder flow-through, indlæse den i en tre kilodalton centrifugalfilter og centrifuge ved 3200 gange g, 10 grader Celsius i ca 30 minutter. Nu er lydstyrken reduceret til 1/5 op til 1/10 af den oprindelige lastevolumen. Den koncentrerede opløsning overføres til et nyt rør.Gentag koncentrationstrinnet så ofte som nødvendigt. Efter kemisk krydsbinding, ifølge manuskriptet, udføre størrelse udelukkelse kromatografi. Ligevægt kolonnen i HBS, belastning prøven, og opsaml peak fraktioner af en til to milliliter under kørslen.Efter at have analyseret disse brøker på en 4 til 20% gradient SDS side, pool fraktioner med store bånd af det ønskede protein kompleks. Derefter koncentrere løsningerne som gjort tidligere. For at isolere monocytter fra menneskelige buffy coats ved tæthed gradient centrifugering, første ligevægt separationsopløsningen til stuetemperatur.Overfør 20 milliliter i 15 milliliter centrifuge rør, to rør pr buffy pels. Blod fra den menneskelige buffy pels med HBSS til et samlet volumen på 60 milliliter og lag 30 milliliter af denne blanding omhyggeligt på toppen af separationsmediet. Centrifuge ved 550 gange g i 35 minutter ved stuetemperatur.Sluk for centrifugens bremse. Efter centrifugering er de mononukleare perifere blodlegemer placeret direkte oven på separationsmediet. Med en pipette overføres disse celler til et friskt, 50 milliliter centrifugerør.Rørglasset fyldes med HBSS til 50 milliliter og centrifugeres ved 170 gange g i 10 minutter. Inspirer supernatanten og opspjænkning af cellepellet i et lille volumen af HBSS ved pipettering. Derefter fyldes røret op til 50 milliliter og centrifugeres ved 290 gange g i 10 minutter.Aspirere supernatanten igen. Cellerne opstemts i 50 milliliter HBSS og centrifugeres ved 170 gange g i 10 minutter. Inspirer supernatanten og resuspend cellpellet i et lille volumen på en milliliter separationsbuffer, tæl cellerne, og tilsæt buffer til en koncentration på fem gange 10 til de syv celler pr. milliliter.For monocytisolering fra mononukleare perifere blodlegemer skal du bruge et magnetisk negativt celleisolationssæt og følge producentens protokol. Brug en automatiseret celletæller til at tælle monocyterne og resuspenderet i monocytmedium til en koncentration på to gange 10 til de seks celler pr. milliliter. At kultur monocytter, lægge en celle kultur fad med en hydrofobe gas permeable film egnet til suspension celler.Anbevis pladerne under UV-lys i ca. 30 minutter til sterilisering. Overfør 15 til 25 milliliter af cellesuspensionen til disse kulturplader, og lad dem hvile natten over ved 37 grader Celsius og 5 % kuldioxid. Efter forrensning på AIEX-kolonnen og efterfølgende calciumafhængige HIC blev der opnået meget rent protein.Som en yderligere kontrol blev menneskelige monocytter stimuleret med LPS og produceret protein af vild typen. Protein eksponering for forskellige ioner resulterer i arrangement af forskellige S100A12 oligomerer. Stigende zinkkoncentrationer fremkalder placering af S100A12 i tetramers og hexamers ved adskillelse på fire til 20% Coomassie plettet SDS side.Når et overskud af ioner blev anvendt før krydsbinding, det induceret en udtalt skift af oligomer ligevægt. S100A12 var kryds forbundet med enten 25 millimolar calcium eller 25 millimolar calcium og en millimolar zink. Efter krydsbinding i HBS-buffer med 25 millimolar calciumchlorid og 1 millimolar zinkchlorid blev hexamer og tetramer adskilt.Tetramer og dimer blev adskilt i HBS buffer med 25 millimolar calciumchlorid. Et eksempel på poolede og koncentrerede oligomerer efter adskillelse på en Coomassie farves fire til 15% gradient SDS side viser dimer, tetramer, og hexamer. Monocyt stimulation med hexameric S100A12 resulterede i udtalt TNF alpha frigivelse.Efter fjernelse af endoksin er det vigtigt ikke at genindføre kontaminering i prøverne under efterfølgende generering og rensning af oligomererne. Downstream analyse af enhver proces, der vedrører S100A12 oligomerization er tænkeligt. Tilsvarende, aminosyrer og ion betingelser, der påvirker oligomerisering selve processen kan analyseres.Vi bruger i øjeblikket S100A12 oligomerer adskilt i henhold til den beskrevne protokol til at udvikle specifikke peptidligands og antistoffer for at blokere proteinets signalering gennem TLF4 og til at udvikle og forbedre diagnostiske analyser.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolering af Funktionel Cardiac immunceller

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging af Mouse Thymus med 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

Generering af lymfeknuder-fedt Pad kimærer for Studiet af lymfeknuder stromacelle Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Påvisning af fluorescerende Nanopartikel Interaktioner med Primary Immune cellesubpopulationer ved flowcytometri

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

En Semi-automatiske tilgang til Forberedelse Antibody Cocktails for immunfænotypisk Analyse af Human Perifer Blod

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolering og flowcytometrisk analyse af immunceller fra iskæmisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...