Name: purification of human s100a12 and its ion-induced oligomers for immune cell stimulation
Uploaded: 2019-09-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation at JoVE.com

Cette étude a été soutenue par des subventions du programme de recherche médicale innovante intra-muros de la faculté de médecine de l'Université De Muenster (KE121201 à C.K.) et de la Fondation allemande de recherche (DFG, Fo354/3-1 à D.F.).

REMARQUE: Veuillez consulter le tableau supplémentaire 1 pour la préparation des tampons et des solutions de stock.
1. Expression protéique dans E. coli
<ol><li>
clonage
	<ol>
<li>Clone sans étiquette humaine S100A12 (NCBI Reference Sequence: NP-005612.1) dans l'expression bactérienne vecteur pET11b. Pour exprimer la protéine, transformez la construction en E. coli BL21(DE3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
culture</s...

<ol>
	<li>Liston, A., Masters, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostasis-altering+molecular+processes+as+mechanisms+of+inflammasome+activation.">Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).</li><li>Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocyte-derived+S100+proteins+in+autoinflammation:+putative+role+in+pathogenesis+and+usefulness+as+biomarkers.">Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers.</a> Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).</li><li>Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+circular+dichroism+studies+of+iron(ii)+binding+to+human+calprotectin.">Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin.</a> Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).</li><li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein.">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).</li><li>Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nickel+Sequestration+by+the+Host-Defense+Protein+Human+Calprotectin.">Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).</li><li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12.">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex:+implications+for+host-parasite+defence.">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li><li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc:+new+insights+into+S100A12+oligomerisation.">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).</li><li>Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+the+human+(S100A8/S100A9)2+heterotetramer,+calprotectin,+illustrates+how+conformational+changes+of+interacting+alpha-helices+can+determine+specific+association+of+two+EF-hand+proteins.">The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+Ca2++and+Zn2++are+essential+for+S100A12+protein+oligomerization+and+function.">Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function.</a> BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).</li><li>Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ions+binding+to+S100+proteins.+I.+Calcium-+and+zinc-binding+properties+of+bovine+brain+S100+alpha+alpha,+S100a+(alpha+beta),+and+S100b+(beta+beta)+protein:+Zn2++regulates+Ca2++binding+on+S100b+protein.">Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).</li><li>Dell&#8217;Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+and+binding+properties+of+calgranulin+C,+a+novel+S100-like+calcium-binding+protein+from+pig+granulocytes.">Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).</li><li>Vogl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A12+is+expressed+exclusively+by+granulocytes+and+acts+independently+from+MRP8+and+MRP14.">S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).</li><li>Hofmann, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+mediates+a+novel+proinflammatory+axis:+a+central+cell+surface+receptor+for+S100/calgranulin+polypeptides.">RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides.</a> Cell. 97 (7), 889-901 (1999).</li><li>Foell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+S100A12+Can+Activate+Human+Monocytes+via+Toll-like+Receptor+4.">Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).</li><li>Kessel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+zinc+tune+autoinflammatory+Toll-like+receptor+4+signaling+by+S100A12.">Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).</li><li>Armaroli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-Derived+Interleukin-1beta+As+the+Driver+of+S100A12-Induced+Sterile+Inflammatory+Activation+of+Human+Coronary+Artery+Endothelial+Cells:+Implications+for+the+Pathogenesis+of+Kawasaki+Disease.">Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).</li><li>GE Healthcare. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Strategies for Protein Purification. 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O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+endotoxin+removal+from+biological+preparations:+a+review.">Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review.</a> Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).</li><li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+removal+from+protein+solutions.">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li><li>Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+partial+characterization+of+canine+S100A12.">Purification and partial characterization of canine S100A12.</a> Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).</li><li>Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+human+Ca2+-bound+S100A12.">Solution structure of human Ca2+-bound S100A12.</a> Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).</li><li>Endotoxin Removal. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Application Note - Sartorius Stedim Biotech. , (2010).</li><li>Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymyxin-B+Stimulates+Production+of+Complement+Components+and+Cytokines+in+Human+Monocytes.">Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).</li><li>Valentinis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+effects+of+polymyxin+B+on+human+dendritic+cells+maturation+-+The+role+of+I+kappa+B-alpha/NF-kappa+B+and+ERK1/2+pathways+and+adhesion.">Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).</li><li>Teuber, M., Miller, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Binding+of+Polymyxin-B+to+Negatively+Charged+Lipid+Monolayers.">Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).</li></ol>

Dans ce protocole, nous décrivons l'expression bactérienne tag-free de S100A12 humain et sa purification aussi bien que la séparation dans différents oligomères ion-induits pour la stimulation de cellules immunitaires. Comparé à la littérature éditée sur la purification de protéine de S100A128,23,24, l'utilisation du CaCl2 élevé (25 mM) dans la chromatographie hydrophobe-interaction est à notre connaissa...

S100A12 est une protéine de liaison de calcium qui est principalement produite par les granulocytes humains. La protéine est surexprimée pendant l'inflammation (systémique) et ses niveaux de sérum, particulièrement dans les maladies (auto)inflammatoires telles que l'arthrite idiopathique juvénile systémique (sJIA), la fièvre méditerranéenne familiale (FMF) ou la maladie de Kawasaki (KD) peut informer au sujet de l'activité de la maladie et la réponse à la thérapie. Selon les récepteurs de reconnaissance des modèles (PRR) tels que les récepteurs à péage (TLR), le système immunitaire inné peut être activé par des modèles moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMP) comme les lipopolysaccharides (LPS) ou des modèles moléculaires associés à des dommages (DAMP; également appelé «alarmins»). Les DAMP sont des molécules endogènes telles que les protéines cellulaires, les lipides ou les acides nucléiques1. DAMP-fonctions sont bien décrits pour les membres de la famille des protéines calgranuline, S100A8/A9 et S100A122, qui sont également signalés pour fonctionner comme métal divalent ion-chelating peptides antimicrobiens3,4, 5,6. Selon la force d'ion disponible S100A12 peut, comme d'autres membres de la famille S100, organiser dans différents homomultimers et jusqu'à récemment l'impact de S100A12-oligomerisation sur PRR-interaction, en particulier TLR4, était inconnu.
La forme monomérique de la protéine (92 acides aminés, 10,2 kDa) se compose de deux structures d'hélice-boucle-boucle EF reliées par un lien flexible. Le C-terminalEF-hand contient le motif classique Ca2 -contraignant tandis que le N-terminalEF-hand présente une structure de boucle étendue spécifique aux protéines S100 ('pseudo-EF-hand') et révèle une affinité Ca2'. La liaison Ca2MDpar S100A12 peut entraîner un changement conformationnel majeur dans le terminus Cdes protéines, qui entraîne l'exposition d'un patch hydrophobe sur chaque monomère et forme l'interface de dimerisation. Ainsi, dans des conditions physiologiques, la plus petite structure quaternaire formée par S100A12 est un dimère non covalent (environ 21 kDa) dans lequel les monomères individuels sont en orientation antiparallèle. Lorsqu'il est disposé comme dimère, S100A12 est signalé à séquestreZ2 ainsi que d'autres ions métalliques divalents, par exemple, Cu2 avec une forte affinité7. Ces ions sont coordonnés à l'interface dimère S100A12 par les acides aminés H15 et D25 d'une sous-unité et H85 ainsi que H89 de l'autre sous-unité anti-parallèle8,9,10. Tandis que des études antérieures suggèrent que Zn2 -chargéS100A12 peut induire l'organisation de la protéine en homo-tetramers (44 kDa) et pour avoir comme conséquence l'augmentation De Ca2- affinité11,12, titration métallique récente les études6 suggèrent Ca2-contraignant par S100A12 pour augmenter l'affinité de la protéine à Zn2. Une fois que les mains EF S100A12 sont entièrement occupées par Ca2,on pense que le Ca2 supplémentaire se lie entre les dimères, déclenchant la formation d'hexamer (environ 63 kDa). L'architecture de la structure hexameric quarternary est clairement différente de celle du tétramer. Il est proposé que l'interface tétramer est perturbée pour donner lieu à de nouvelles interfaces dimer-dimer qui bénéficie formation hexamer10. S100A12 est presque exclusivement exprimé par les granulocytes humains où il constitue environ 5% de toute la protéine cytosolique13. Dans sa fonction DAMP S100A12 a été historiquement décrit comme agoniste du récepteur multi-ligand pour les produits finaux avancés de glycation (RAGE), alors appelé protéine extracellulaire nouvellement identifiée rage-contraignante (EN-RAGE)14. Bien que nous ayons précédemment rapporté biochimique S100A12-contraignant à la fois RAGE et TLR415, nous avons récemment démontré monocytes humains pour répondre à la stimulation S100A12 d'une manière TLR4-dépendante16. Cela nécessite l'arrangement de S100A12 dans sa ca2/Zn2 -induitstructure hexameric quarternary16.
Ici nous décrivons une procédure de purification pour l'homme recombinant S100A12 et ses oligomères ion-induits pour des stimulations de cellules immunitaires16,17. Ceci est basé sur une stratégie de chromatographie en deux étapes, qui comprend initialement une colonne d'échange d'anions pour isoler et concentrer la protéine et éliminer les contaminations en vrac (par exemple, les endotoxines/lipopolysaccharides)18. Les résines de chromatographie ion-échange séparent les protéines sur la base de différentes charges de surface nettes. Pour les protéines acides comme S100A12 (point isoélectrique de 5,81), un système tampon avec un pH de 8,5 et une forte résine d'échange d'anion conduit à une bonne séparation. Les protéines liées ont été élucées avec un gradient tampon à haute teneur en sel. Avec une augmentation de la force ionique des ions négatifs dans le tampon d'élution concurrencent les protéines pour les charges sur la surface de la résine. Les protéines s'éliment individuellement en fonction de leur charge nette et, par conséquent, les tampons décrits ci-dessus permettent d'isoler et de concentrer la protéine S100A12 surexprimée. En raison de groupes chargés négativement dans les lipopolysaccharides, ces molécules se lient également aux résines d'échange d'anion. Cependant, leur charge nette plus élevée entraîne une élution ultérieure dans le gradient de haute teneur en sel appliqué. La deuxième étape de la procédure de purification a été introduite à des fins de polissage. Cela permet d'utiliser la capacité de liaison de calcium de S100A12 et élimine les impuretés restantes sur une colonne hydrophobe-interaction. La liaison calcique de S100A12 entraîne un changement conformationnel et une exposition de plaques hydrophobes à la surface de la protéine. À cette condition, S100A12 interagit avec la surface hydrophobe de la résine. Sur le calcium-chelating par EDTA, cette interaction est inversée. En présence d'ions, en particulier de calcium et de zinc, S100A12 s'arrange en oligomères homoméricagris. Pour étudier les relations structure-fonction des différents oligomères, nous avons stabilisé le sadicycle, le tétramérique et le recombinant hexamérique S100A12 avec un crosslinker chimique et avons séparé les complexes sur une colonne de chromatographie d'exclusion de taille. Enfin, pour analyser la fonctionnalité et l'activité biologique de la protéine purifiée et de ses oligomères induits par les ions, la libération de cytokine du monocyte stimulé S100A12 et du LPS peut être comparée.
Diverses méthodes de purification du S100A12 ont été décrites jusqu'à présent. Jackson et coll.19, par exemple, ont publié un protocole avec purification par l'intermédiaire d'une colonne d'échange d'anion et d'une chromatographie d'exclusion de taille ultérieure. Le polissage de la purification sur une colonne d'exclusion de taille donne de bons résultats, mais, en raison par exemple des volumes de chargement limités, il est moins flexible en matière d'évolutivité. Une approche différente, publiée par Kiss et coll.20, décrit la purification des protéines étiquetées par la colonne d'affinité Ni2 comme la première étape de purification, suivie d'un clivage enzymatique pour enlever l'étiquette et d'autres étapes de purification. Contrairement aux études précitées19,20, la protéine produite telle que décrite dans ce protocole est déterminée pour des expériences sur les cellules immunitaires. Par conséquent, la contamination résiduelle d'endotoxine de la culture bactérienne est un défi. Bien que différentes approches pour l'élimination de l'endotoxine ont été décrites jusqu'à présent, il n'existe aucune méthode uniforme qui fonctionne aussi bien pour une solution de protéines donnée21,22.
En résumé, notre protocole combine les avantages d'une expression sans étiquette dans un système bactérien avec l'élimination efficace de l'endotoxine et un rendement élevé de protéines pures.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pET11b vector</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x Non-essential amino acids</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K 0293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% HCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X897.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8722;20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciumchlorid Dihydrat</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5239.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human Monocyte Enrichment Kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19059</td>
			<td>Magnetic negative cell isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoLISA</td>
			<td>Hyglos</td>
			<td>609033</td>
			<td>Endotoxin detection assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxin-Free Ultra Pure Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TMS-011-A</td>
			<td>Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoTrap red</td>
			<td>Hyglos</td>
			<td>321063</td>
			<td>Endotoxin removal resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (heat-inactivated)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (high quality, endotoxin testet)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hTNF-alpha - OptEia ELISA Set</td>
			<td>BD</td>
			<td>555212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (isopropyl-&#223;-D-thiogalactopyranosid)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN08.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K 0282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Medium</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L6529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll, human</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-60500</td>
			<td>Separation solution (density gradient centrifugation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A 2212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl Sepharose High Performance</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1082-01</td>
			<td>Resin for hydrophobic interaction chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-pmb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Sepharose Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0510-01</td>
			<td>Resin for anion-exchange chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSep buffer</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>20104</td>
			<td>Cell separation buffer (section 5.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F 1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3957.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P031.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SLHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL roundbottom tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Erlenmyer flask</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>LY98.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well suspension plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 L measuring beaker</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CKN3.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL high-speed centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3,01,22,178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (100 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing Closures</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep magnet &#39;The Big Easy`</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector tubes 5 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>115101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox film, 25 &#181;m, 305 mm x 40 m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94,60,77,316</td>
			<td>Film for monocyte culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa)</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop filter unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C Incubator (with shaking)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA purifier UPC 10</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>FPLC System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Frac-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (with rotor A-4-81)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F-34-6-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean Tetra Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPhotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>P330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Brandelin</td>
			<td>UW2070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>infinite M200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Knick</td>
			<td>765</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of human s100a12 and its ion-induced oligomers for immune cell stimulation

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour purifier la protéine sététicire-contraignante humaine S100A12 et ses oligomères ion-induits de la culture d'Escherichia coli pour des stimulations de cellules immunitaires. Ce protocole est basé sur une stratégie de chromatographie en deux étapes, qui comprend la pré-purification des protéines sur une colonne de chromatographie d'échange d'anion et une étape de polissage ultérieure sur une colonne hydrophobe-interaction. Cette stratégie produit des protéines S100A12 d'une grande pureté et d'un rendement à des coûts gérables. Pour les essais fonctionnels sur les cellules immunitaires éventuelle contamination endotoxine résiduelle nécessite une surveillance attentive et d'autres étapes de nettoyage pour obtenir des protéines sans endotoxine. La majorité des contaminations à l'endotoxine peuvent être exclues par la chromatographie d'échange d'anions. Pour épuiser les contaminations résiduelles, ce protocole décrit une étape d'élimination avec des filtres centrifuges. Selon la résistance aux ions disponible S100A12 peut organiser en différents homomultimers. Pour étudier la relation entre la structure et la fonction, ce protocole décrit davantage le traitement ionique de la protéine S100A12 suivi d'un raccordement chimique pour stabiliser les oligomères S100A12 et leur séparation subséquente par exclusion de taille Chromatographie. Enfin, nous décrivons un essai cellulaire qui confirme l'activité biologique de la protéine purifiée et confirme la préparation Sans LPS.

Après la prépurification sur la colonne AIEX (figure 1A-C) et le HIC dépendant du calcium(figure 2A,B),des protéines hautement pures ont été obtenues (Figure 2C). En outre, les mesures de l'endotoxine ont indiqué l'enlèvement réussi de LPS. Le contenu LPS suivant AIEX a été mesuré dans une dilution 1:10 au-dessus de la limite de détection d'analyse, c'est-à-dire au-dessus de 500 EU/mL....

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Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

Ce protocole décrit une méthode de purification pour la protéine recombinante sans étiquette de liaison de calcium S100A12 et ses oligomères ion-induits pour des essais humains de stimulation de monocyte.

Purification de l'homme S100A12 et de ses oligomères induits par les ions pour la stimulation cellulaire immunitaire

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

Ce protocole décrit une procédure complète de purification de la protéine liant le calcium humain, S100A12, et en particulier, car ce sont différents oligomers induits par les ion pour les implications de recherche en aval. Avec cette technique, nous sommes en mesure de maintenir un rendement élevé de protéines très pures et sans endotoxine. La liaison croisée chimique et la séparation sur la colonne chromatographie d’exclusion de taille est une méthode convaincante pour produire des protéines homo-oligomériques pour d’autres analyses fonctionnelles.Notre technique nous permet de mécaniser les aspects de S100A12 en tant que ligand récepteur de reconnaissance de modèle et des informations d’art pour idéalement développer de nouvelles interventions ciblées et améliorer les tests diagnostiques. En plus de regarder cette vidéo, nous recommandons une lecture attentive du protocole, car nous décrivons une procédure complexe en plusieurs étapes. Pour commencer, couper un tube de dialyse dans une longueur appropriée, environ 30 centimètres, avec un espace supplémentaire pour l’air.Faire tremper la membrane dans de l’eau déionisée pendant 15 à 30 minutes pour enlever le glycérol. Pour réduire la viscosité de la solution protéique défrichée, diluer la solution avec 25 millilitres de tampon AIEX A.Attachez la première fermeture sur le tube. Chargez l’échantillon dans la membrane et fixez la deuxième fermeture à au moins un centimètre de l’extrémité supérieure du tube.Dans une pièce refroidie à quatre degrés Celsius, placer le récipient avec le tampon A de l’AIEX sur une plaque à remuer, ajouter une barre de remue-pièce et la membrane remplie de solution protéique. Réglez la vitesse pour faire pivoter l’échantillon de sorte qu’il n’y ait aucune interférence avec la barre de remue-remuer rotative. Dialyzez pendant 12 à 24 heures à quatre degrés Celsius, puis remplacez le tampon dialysé par le tampon A pré-refroidi gratuit et continuez pendant au moins quatre heures supplémentaires.Transférez la solution protéique dialysée du tube dans un tube de 50 millilitres à travers une unité de filtre de 0,45 micron. Démarrez le FPLC avec maintenance générale. Connectez les tampons de colonne AIEX A et AIEX B aux vannes tampons et à la résine d’échange d’anion contenant de la colonne aux ports de colonne du FPLC.Ajustez les paramètres chromatographiques généraux en conséquence. Démarrez le programme AIEX dans le logiciel FPLC et choisissez le volume d’équilibrage pour le tampon A.Par la suite, chargez l’échantillon sur la colonne et élisez les protéines avec un gradient linéaire de 0% à 100% tampon de sel élevé. Recueillir deux fractions millilitres pendant l’élitution.Analyser les fractions élucidées après avoir terminé la course. Pour cela, chargez 10 microlitres de chaque fraction sur une page Coomassie tachée de 15% SDS et identifiez les fractions contenant S100A12. Mettre en commun ces S100A12 contenant des fractions pour la dialyse en solution saline tamponnée tris.Pour poursuivre la purification des protéines, après la dialyse protéique, ajouter un chlorure de calcium à l’échantillon à une concentration finale de 25 millimolaires, ce qui facilitera la liaison de S100A12 à la résine dans la prochaine étape. Filtrez ensuite l’échantillon à travers un filtre d’une taille de coulée de 0,45 microns. Equilibrer les tampons et les échantillons hic à quatre degrés Celsius.Ensuite, connectez les tampons de colonne HIC A et B et la colonne au système et ajustez les paramètres. Commencez la méthode pour équilibrer la colonne avec un à deux volumes de colonne de HIC A tampon et chargez l’échantillon et le bloc d’échantillon non lié de lavage avec un signal UV atteint à nouveau le niveau de ligne de base. Puis commencer l’élitution avec un chélateur de calcium contenant tampon EDTA.Recueillir deux millilitres de fractions de pointe pendant l’élitution. Après avoir analysé 10 microlitres de chaque fraction sur une page Coomassie tachée de 15%SDS identifier les fractions pures S100A12. Mutualiser ces fractions et dialyser contre HBS.Tout d’abord, chargez 15 millilitres d’échantillon sur une unité de filtre centrifuge de 50 kilodaltons. Centrifugeuse à 3200 fois g à 10 degrés Celsius pendant environ 10 minutes. Transférer le débit filtré dans un récipient frais, sur la glace.Maintenant, utilisez un millilitre de HBS pour rincer la membrane du filtre et pour la dilution de la solution concentrée dans la pointe du filtre. Centrifugeuse à nouveau pour récupérer autant de protéines que possible dans le flow-through. Pour filtrer la solution, répétez la charge et la centrifugation de l’échantillon aussi souvent que nécessaire.Ensuite, pour concentrer le S100A12 contenant l’écoulement, chargez-le dans un filtre centrifuge de trois kilodaltons et centrifugeuse à 3200 fois g, 10 degrés Celsius pendant environ 30 minutes. Maintenant, le volume est réduit à 1/5 jusqu’à 1/10 du volume de chargement initial. Transférer la solution concentrée dans un nouveau tube.Répétez l’étape de concentration aussi souvent que nécessaire. Après la liaison chimique croisée, selon le manuscrit, effectuer la chromatographie d’exclusion de taille. Equilibrer la colonne dans HBS, charger l’échantillon, et recueillir des fractions de pointe d’un à deux millilitres pendant la course.Après avoir analysé ces fractions sur une page SDS de quatre à 20 %, mutualiser les fractions avec les principales bandes du complexe protéique désiré. Ensuite, concentrez les solutions comme cela a été fait précédemment. Pour isoler les monocytes des couches buffy humaines par centrifugation de gradient de densité, équilibrer d’abord la solution de séparation à la température ambiante.Transférer 20 millilitres dans des tubes centrifugeuses de 15 millilitres, deux tubes par pelage bouffi. Diluer le sang de la couche buffy humaine avec HBSS à un volume total de 60 millilitres et superposer 30 millilitres de ce mélange soigneusement sur le dessus du milieu de séparation. Centrifugeuse à 550 fois g pendant 35 minutes à température ambiante.Éteignez le frein de la centrifugeuse. Après centrifugation, les cellules sanguines périphériques mononucléaires sont situées directement au-dessus du milieu de séparation. À l’intérieur d’une pipette, transférer ces cellules dans un tube de centrifugeuse frais de 50 millilitres.Remplissez le tube de HBSS à 50 millilitres et centrifugeuse à 170 fois g pendant 10 minutes. Aspirer le supernatant et réutiliser la pastille cellulaire dans un petit volume de HBSS par pipetting. Ensuite, remplissez le tube jusqu’à 50 millilitres et centrifugeuse à 290 fois g pendant 10 minutes.Aspirez à nouveau le surnatant. Resuspendez les cellules en 50 millilitres de HBSS et centrifugeuse à 170 fois g pendant 10 minutes. Aspirez le supernatant et résuspendez la pastille cellulaire dans un petit volume d’un millilitre de tampon de séparation, comptez les cellules et ajoutez un tampon à une concentration de cinq fois 10 aux sept cellules par millilitre.Pour l’isolement des monocytes des cellules sanguines périphériques mononucléaires, utilisez un kit d’isolement cellulaire négatif magnétique et suivez le protocole du fabricant. Utilisez un compteur cellulaire automatisé pour compter les monocytes et résuspendez dans le milieu des monocytes à une concentration de deux fois 10 à six cellules par millilitre. Pour la culture des monocytes, placez un plat de culture cellulaire avec un film perméable au gaz hydrophobe adapté aux cellules de suspension.Placer les plaques sous la lumière UV pendant environ 30 minutes pour la stérilisation. Transférer 15 à 25 millilitres de suspension cellulaire dans ces plaques de culture et les laisser reposer toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après la pré-purification sur la colonne AIEX et le HIC dépendant du calcium, des protéines très pures ont été obtenues.En tant que contrôle supplémentaire, les monocytes humains ont été stimulés par le LPS et ont produit des protéines de type sauvage. L’exposition de protéine à différents ions a comme résultat l’arrangement de différents oligomers de S100A12. L’augmentation des concentrations de zinc induire l’arrangement de S100A12 dans les tétramers et les hexamers lors de la séparation sur quatre à 20%Coomassie taché SDS page.Quand un excès d’ions a été appliqué avant le croisement, il a induit un décalage prononcé de l’équilibre d’oligomer. S100A12 a été relié en présence de calcium de 25 millimlaires ou de calcium de 25 millimlaires et d’un zinc millimolaire. Après un croisement dans le tampon HBS avec du chlorure de calcium de 25 millimlaires et un chlorure de zinc millimolaire, l’hexamer et le tétramer ont été séparés.Le tétramer et le dimère ont été séparés dans le tampon HBS avec du chlorure de calcium de 25 millimlaires. Un exemple d’oligomers mis en commun et concentrés après séparation sur une page SDS tachée de coomassie de quatre à 15% montre le dimère, le tétramer et l’hexamer. La stimulation de monocyte avec le S100A12 hexaméricain a eu comme conséquence la libération alpha prononcée de TNF.Après l’élimination de l’endotoxine, il est important de ne pas réintroduire la contamination dans les échantillons lors de la génération suivante et de la purification des oligomers. L’analyse en aval de tout processus lié à l’oligomérisation S100A12 est concevable. De même, les acides aminés et les conditions ioniques qui affectent le processus d’oligomérisation lui-même peuvent être analysés.Nous utilisons actuellement des oligomers S100A12 séparés selon le protocole décrit pour développer des ligands et des anticorps spécifiques au peptide pour bloquer la signalisation de la protéine par tlf4 et pour développer et améliorer les tests diagnostiques.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Purification de population cellulaire spécifique par le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Recherche

Immunologie et infection

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Évaluation quantitative des cellules immunitaires dans le tissu blessés médullaires par cytométrie en flux: une nouvelle utilisation pour un procédé de purification cellulaire

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Débit analyse par cytométrie de cellules immunitaires dans aortes murin

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolement des cellules immunitaires fonctionnelles cardiaques

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Homme In Vitro</emRépression> comme outil de dépistage pour la reconnaissance d&#39;un Etat précoce de déséquilibre immunitaire

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