Name: purification of human s100a12 and its ion-induced oligomers for immune cell stimulation
Uploaded: 2019-09-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation at JoVE.com

Diese Studie wurde durch Stipendien des intramuralen innovativen medizinischen Forschungsprogramms der Medizinischen Fakultät der Universität Münster (KE121201 bis C.K.) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Fo354/3-1 bis D.F.)unterstützt.

HINWEIS: Zur Vorbereitung von Puffern und Lagerlösungen finden Sie in der Zusatztabelle 1.
1. Proteinexpression in E. coli
<ol><li>
Klonen
	<ol>
<li>Klonen Sie tagfreie menschliche S100A12 (NCBI-Referenzsequenz: NP_005612.1) in bakteriellen Expressionsvektor pET11b. Um das Protein auszudrücken, wandeln Sie das Konstrukt in E. coli BL21(DE3) um.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
kultur
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine St...

<ol>
	<li>Liston, A., Masters, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostasis-altering+molecular+processes+as+mechanisms+of+inflammasome+activation.">Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).</li><li>Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocyte-derived+S100+proteins+in+autoinflammation:+putative+role+in+pathogenesis+and+usefulness+as+biomarkers.">Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers.</a> Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).</li><li>Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+circular+dichroism+studies+of+iron(ii)+binding+to+human+calprotectin.">Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin.</a> Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).</li><li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein.">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).</li><li>Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nickel+Sequestration+by+the+Host-Defense+Protein+Human+Calprotectin.">Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).</li><li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12.">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex:+implications+for+host-parasite+defence.">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li><li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc:+new+insights+into+S100A12+oligomerisation.">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).</li><li>Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+the+human+(S100A8/S100A9)2+heterotetramer,+calprotectin,+illustrates+how+conformational+changes+of+interacting+alpha-helices+can+determine+specific+association+of+two+EF-hand+proteins.">The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+Ca2++and+Zn2++are+essential+for+S100A12+protein+oligomerization+and+function.">Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function.</a> BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).</li><li>Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ions+binding+to+S100+proteins.+I.+Calcium-+and+zinc-binding+properties+of+bovine+brain+S100+alpha+alpha,+S100a+(alpha+beta),+and+S100b+(beta+beta)+protein:+Zn2++regulates+Ca2++binding+on+S100b+protein.">Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).</li><li>Dell&#8217;Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+and+binding+properties+of+calgranulin+C,+a+novel+S100-like+calcium-binding+protein+from+pig+granulocytes.">Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).</li><li>Vogl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A12+is+expressed+exclusively+by+granulocytes+and+acts+independently+from+MRP8+and+MRP14.">S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).</li><li>Hofmann, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+mediates+a+novel+proinflammatory+axis:+a+central+cell+surface+receptor+for+S100/calgranulin+polypeptides.">RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides.</a> Cell. 97 (7), 889-901 (1999).</li><li>Foell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+S100A12+Can+Activate+Human+Monocytes+via+Toll-like+Receptor+4.">Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).</li><li>Kessel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+zinc+tune+autoinflammatory+Toll-like+receptor+4+signaling+by+S100A12.">Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).</li><li>Armaroli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-Derived+Interleukin-1beta+As+the+Driver+of+S100A12-Induced+Sterile+Inflammatory+Activation+of+Human+Coronary+Artery+Endothelial+Cells:+Implications+for+the+Pathogenesis+of+Kawasaki+Disease.">Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).</li><li>GE Healthcare. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Strategies for Protein Purification. 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O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+endotoxin+removal+from+biological+preparations:+a+review.">Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review.</a> Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).</li><li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+removal+from+protein+solutions.">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li><li>Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+partial+characterization+of+canine+S100A12.">Purification and partial characterization of canine S100A12.</a> Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).</li><li>Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+human+Ca2+-bound+S100A12.">Solution structure of human Ca2+-bound S100A12.</a> Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).</li><li>Endotoxin Removal. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Application Note - Sartorius Stedim Biotech. , (2010).</li><li>Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymyxin-B+Stimulates+Production+of+Complement+Components+and+Cytokines+in+Human+Monocytes.">Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).</li><li>Valentinis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+effects+of+polymyxin+B+on+human+dendritic+cells+maturation+-+The+role+of+I+kappa+B-alpha/NF-kappa+B+and+ERK1/2+pathways+and+adhesion.">Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).</li><li>Teuber, M., Miller, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Binding+of+Polymyxin-B+to+Negatively+Charged+Lipid+Monolayers.">Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).</li></ol>

In diesem Protokoll beschreiben wir die tagfreie bakterielle Expression des menschlichen S100A12 und seine Reinigung sowie die Trennung in verschiedene Ionen-induzierte Oligomere zur Immunzellstimulation. Im Vergleich zur veröffentlichten Literatur zur S100A12-Proteinreinigung8,23,24ist die Verwendung von hohem CaCl2 (25 mM) in der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie unseres Wissens einzigartig. Mehrere Protok...

S100A12 ist ein Kalzium-bindendes Protein, das überwiegend von menschlichen Granulozyten produziert wird. Das Protein wird während (systemischer) Entzündungen überexprimiert und sein Serumspiegel, insbesondere bei (auto)entzündlichen Erkrankungen wie systemischer juveniler idiopathischer Arthritis (sJIA), familiärem Mittelmeerfieber (FMF) oder Kawasaki-Krankheit (KD) Krankheitsaktivität und Reaktion auf die Therapie. Abhängig von Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) wie gebührenähnlichen Rezeptoren (TLRs) kann das angeborene Immunsystem durch pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPs) wie Lipopolysaccharide (LPS) oder Schäden an assoziierten molekularen Mustern (DAMPs; auch als "Alarmins" bezeichnet). DAMPs sind endogene Moleküle wie zelluläre Proteine, Lipide oder Nukleinsäuren1. DAMP-Funktionen sind für die Mitglieder der Calgranulin-Proteinfamilie, S100A8/A9 und S100A122, die auch als divalente metallionchelisierende antimikrobielle Peptide 3,4, 5,6. Je nach verfügbarer Ionenstärke kann S100A12, wie andere Mitglieder der S100-Familie, in verschiedene Homomultimere einwirken und bis vor kurzem waren die Auswirkungen der S100A12-Oligomerisierung auf die PRR-Interaktion, insbesondere TLR4, unbekannt.
Die monomere Form des Proteins (92 Aminosäuren, 10,2 kDa) besteht aus zwei EF-Hand-Helix-Loop-Helix-Strukturen, die durch einen flexiblen Linker verbunden sind. Die C-Klemme EF-Hand enthält das klassische Ca2+-Bindungsmotiv, während die N-TerminalEF-Hand eine S100-proteinspezifische erweiterte Schleifenstruktur ('pseudo-EF-hand') aufweist und eine reduzierte Ca2+-Affinitätaufweist. Ca2+-Bindung durch S100A12 kann eine wesentliche konforme Veränderung des C-Terminusder Proteine induzieren, was zu einer Exposition eines hydrophoben Pflasters auf jedem Monomer führt und die Dimerisierungsschnittstelle bildet. So ist die kleinste quaternäre Struktur, die durch S100A12 gebildet wird, unter physiologischen Bedingungen ein nicht-kovalenter Dimer (ca. 21 kDa), in dem einzelne Monomere antiparallel ausgerichtet sind. Als Dimer angeordnet, wird S100A12 als Sequestrierung Zn2+ sowie andere divalente Metallionen, z.B. Cu2+ mit hoher Affinität7gemeldet. Diese Ionen werden an der Dimerschnittstelle S100A12 durch die Aminosäuren H15 und D25 einer Untereinheit und H85 sowie H89 der parallel enzierenden anderen Untereinheit8,9,10koordiniert. Während frühere Studien nahelegten, dass Zn2+-geladene S100A12 die Organisation des Proteins in Homo-Tetramere (44 kDa) induzieren und zu einer erhöhten Ca2+-Affinität11,12führen kann, Studien6 schlagen Ca2+-bindung durch S100A12 vor, um die Affinität des Proteins zu Zn2+zu erhöhen. Sobald die S100A12 EF-Zeiger von Ca2+voll belegt sind, wird angenommen, dass zusätzliche Ca2+ zwischen Dimeren binden und die Hexamerbildung auslösen (ca. 63 kDa). Die Architektur der hexamerischen Viertelstruktur unterscheidet sich deutlich von der des Tetramers. Es wird vorgeschlagen, dass die Tetramer-Schnittstelle unterbrochen wird, um neue Dimer-Dimer-Schnittstellen hervorzurufen, die der Hexamer-Bildung10zugute kommen. S100A12 wird fast ausschließlich von menschlichen Granulozyten ausgedrückt, wo es etwa 5% des gesamten zytosolischen Proteins13ausmacht. In seiner DAMP-Funktion wurde S100A12 historisch als Agonist des Multiligandenrezeptors für fortgeschrittene Glykationsendprodukte (RAGE) beschrieben, das damals als extrazelluläres neu identifiziertes RAGE-bindendes Protein (EN-RAGE)14bezeichnet wurde. Obwohl wir früher über biochemische S100A12-Bindung sowohl an RAGE als auch an TLR415berichtet haben, haben wir kürzlich gezeigt, dass menschliche Monozyten auf S100A12-Stimulation in einer TLR4-abhängigen Weise reagieren16. Dies erfordert die Anordnung von S100A12 in seine Ca2+/Zn2+-induzierte hexamerische Viertelstruktur16.
Hier beschreiben wir ein Reinigungsverfahren für rekombinantes menschliches S100A12 und seine ioneninduzierten Oligomere für Immunzellstimulationen16,17. Diese basiert auf einer zweistufigen Chromatographie-Strategie, die zunächst eine Anionenaustauschsäule umfasst, um das Protein zu isolieren und zu konzentrieren und Massenkontaminationen (z.B. Endotoxine/Lipopolysaccharide) zu entfernen18. Ionenaustauscher-Chromatographieharze trennen Proteine auf der Grundlage unterschiedlicher Netzoberflächenladungen. Bei sauren Proteinen wie S100A12 (isoelektrischer Punkt von 5,81) führt ein Puffersystem mit einem pH-Wert von 8,5 und einem starken Anionenaustauschharz zu einer guten Trennung. Gebundene Proteine wurden mit einem hohen Salzpuffergradienten eluiert. Mit einer Erhöhung der Ionenstärke konkurrieren negative Ionen im Elutionspuffer mit Proteinen um Ladungen auf der Oberfläche des Harzes. Proteine, die je nach Nettoladung einzeln elutieren, und dadurch ermöglichen die hier beschriebenen Puffer, das überexprimierte S100A12-Protein zu isolieren und zu konzentrieren. Aufgrund negativ geladener Gruppen in Lipopolysacchariden binden diese Moleküle auch an Anionenaustauschharze. Ihre höhere Nettoladung führt jedoch zu einer späteren Elution im aufgebrachten Hochsalzgradienten. Der zweite Schritt des Reinigungsverfahrens wurde zu Polierzwecken eingeführt. Dies nutzt die Calciumbindungsfähigkeit von S100A12 und entfernt restliche Verunreinigungen an einer hydrophoben Wechselwirkungssäule. Die Calciumbindung von S100A12 führt zu einer Konformationsänderung und einer Exposition hydrophober Flecken auf der Oberfläche des Proteins. Unter diesem Zustand interagiert S100A12 mit der hydrophoben Oberfläche des Harzes. Bei der Calcium-Chelatierung durch EDTA wird diese Wechselwirkung umgekehrt. In Gegenwart von Ionen, insbesondere Kalzium und Zink, ordnet S100A12 zu homomeren Oligomeren. Um Struktur-Funktions-Beziehungen der verschiedenen Oligomere zu untersuchen, stabilisierten wir dimer, tetramerische und hexamerische Rekombinante S100A12 mit einem chemischen Verklinker und trennten die Komplexe auf einer Farbtonographiesäule mit Größenausschluss. Um die Funktionalität und biologische Aktivität des gereinigten Proteins und seiner ioneninduzierten Oligomere zu analysieren, kann schließlich die Zytokinfreisetzung von S100A12 und LPS stimulierter Monozyten verglichen werden.
Verschiedene Methoden zur Reinigung von S100A12 wurden bisher beschrieben. Jackson et al.19veröffentlichten beispielsweise ein Protokoll mit Reinigung über eine Anionenaustauschsäule und eine anschließende Größenausschlusschromatographie. Das Feinpolieren an einer Größenausschlusssäule führt zu guten Ergebnissen, ist aber aufgrund der z. B. begrenzten Ladevolumina weniger flexibel in der Skalierbarkeit. Ein anderer Ansatz, veröffentlicht von Kiss et al.20, beschreibt die Reinigung des markierten Proteins über Ni2+ Affinitätsspalte als ersten Reinigungsschritt, gefolgt von enzymatischer Spaltung, um das Tag zu entfernen und weitere Reinigungsschritte. Im Gegensatz zu den vorherzitierten Studien19,20wird das in diesem Protokoll beschriebene produzierte Protein für Experimente an Immunzellen bestimmt. Daher ist eine Rest-Endotoxin-Kontamination aus der Bakterienkultur eine Herausforderung. Obwohl bisher unterschiedliche Ansätze zur Endotoxinentfernung beschrieben wurden, gibt es keine einheitliche Methode, die für eine gegebene Proteinlösung gleich gut funktioniert21,22.
Zusammenfassend kombiniert unser Protokoll die Vorteile einer tagfreien Expression in einem bakteriellen System mit einer effizienten Endotoxinentfernung und einer hohen Ausbeute an reinem Protein.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pET11b vector</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x Non-essential amino acids</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K 0293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% HCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X897.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8722;20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciumchlorid Dihydrat</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5239.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human Monocyte Enrichment Kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19059</td>
			<td>Magnetic negative cell isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoLISA</td>
			<td>Hyglos</td>
			<td>609033</td>
			<td>Endotoxin detection assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxin-Free Ultra Pure Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TMS-011-A</td>
			<td>Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoTrap red</td>
			<td>Hyglos</td>
			<td>321063</td>
			<td>Endotoxin removal resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (heat-inactivated)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (high quality, endotoxin testet)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hTNF-alpha - OptEia ELISA Set</td>
			<td>BD</td>
			<td>555212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (isopropyl-&#223;-D-thiogalactopyranosid)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN08.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K 0282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Medium</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L6529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll, human</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-60500</td>
			<td>Separation solution (density gradient centrifugation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A 2212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl Sepharose High Performance</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1082-01</td>
			<td>Resin for hydrophobic interaction chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-pmb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Sepharose Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0510-01</td>
			<td>Resin for anion-exchange chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSep buffer</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>20104</td>
			<td>Cell separation buffer (section 5.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F 1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3957.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P031.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SLHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL roundbottom tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Erlenmyer flask</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>LY98.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well suspension plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 L measuring beaker</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CKN3.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL high-speed centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3,01,22,178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (100 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing Closures</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep magnet &#39;The Big Easy`</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector tubes 5 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>115101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox film, 25 &#181;m, 305 mm x 40 m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94,60,77,316</td>
			<td>Film for monocyte culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa)</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop filter unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C Incubator (with shaking)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA purifier UPC 10</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>FPLC System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Frac-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (with rotor A-4-81)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F-34-6-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean Tetra Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPhotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>P330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Brandelin</td>
			<td>UW2070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>infinite M200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Knick</td>
			<td>765</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of human s100a12 and its ion-induced oligomers for immune cell stimulation

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Reinigung des humanen Calcium-bindenden Proteins S100A12 und seiner ioneninduzierten Oligomere aus der Escherichia coli-Kultur für Immunzellstimulationen. Dieses Protokoll basiert auf einer zweistufigen Chromatographiestrategie, die die Proteinvorreinigung auf einer Anionenaustauschchromatographiesäule und einen anschließenden Polierschritt auf einer hydrophoben Wechselwirkungssäule umfasst. Diese Strategie produziert S100A12 Protein von hoher Reinheit und Ausbeute zu überschaubaren Kosten. Für funktionelle Tests an Immunzellen erfordert eine eventuelle Rest-Endotoxin-Kontamination eine sorgfältige Überwachung und weitere Reinigungsschritte, um endotoxinfreies Protein zu erhalten. Die mehralsige Endotoxinkontamination kann durch Anionenaustauschchromatographie ausgeschlossen werden. Um Restkontaminationen zu beseitigen, beschreibt dieses Protokoll einen Entfernungsschritt mit Zentrifugalfiltern. Je nach verfügbarer Ionenstärke kann S100A12 in verschiedene Homomultimere anordnen. Um das Verhältnis zwischen Struktur und Funktion zu untersuchen, beschreibt dieses Protokoll die Ionenbehandlung von S100A12-Protein enden, gefolgt von chemischer Vernetzung zur Stabilisierung von S100A12-Oligomeren und deren anschließender Trennung durch Größenausschluss. Chromatographie. Schließlich beschreiben wir einen zellbasierten Assay, der die biologische Aktivität des gereinigten Proteins bestätigt und die LPS-freie Zubereitung bestätigt.

Nach vorerierierweiser AIEX-Säule (Abbildung 1A-C) und anschließender kalziumabhängiger HIC (Abbildung 2A,B) wurde hochreines Protein gewonnen (Abbildung 2C). Darüber hinaus ergaben Messungen von Endotoxin eine erfolgreiche LPS-Entfernung. Der LPS-Gehalt nach AIEX wurde in einer Verdünnung von 1:10 über dem Assay-Nachweisgrenzwert, d. h. über 500 EU/ml, gemessen. Nach der ersten Filtration du...

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Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

Dieses Protokoll beschreibt eine Reinigungsmethode für rekombinantes tagfreies Calciumbindungsprotein S100A12 und seine ioneninduzierten Oligomere für humane Monozytenstimulationstests.

Reinigung des menschlichen S100A12 und seiner Ionen-induzierten Oligomere zur Immunzellstimulation

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

Dieses Protokoll beschreibt ein vollständiges Reinigungsverfahren für das humane Kalziumbindungsprotein S100A12 und insbesondere für seine verschiedenen Ionen-induzierten Oligomere für nachgelagerte Forschungsimplikationen. Mit dieser Technik sind wir in der Lage, eine hohe Ausbeute an sehr reinem und Endotoxin-freiem Protein zu erhalten. Chemische Vernetzung und Trennung auf der Spalte Größenausschlusschromatographie ist eine überzeugende Methode, um homo-oligomere Proteine für weitere funktionelle Assays zu erzeugen.Unsere Technik ermöglicht es uns, mechanistische Aspekte von S100A12 als Mustererkennungsrezeptor-Ligand und Kunstinformationen zu entwickeln, um idealerweise neue gezielte Interventionen zu entwickeln und diagnostische Assays zu verbessern. Zusätzlich zum Ansehen dieses Videos empfehlen wir ein sorgfältiges Lesen des Protokolls, da wir ein komplexes, mehrstufiges Verfahren beschreiben. Zunächst schneiden Sie einen Dialyseschlauch in eine entsprechende Länge, etwa 30 Zentimeter, mit zusätzlichem Luftraum.Die Membran 15 bis 30 Minuten in entionisiertem Wasser einweichen, um Glycerin zu entfernen. Um die Viskosität der gelichteten Proteinlösung zu reduzieren, verdünnen Sie die Lösung mit 25 Milliliter aIEX-Puffer A.Attach den ersten Verschluss auf den Schlauch. Laden Sie die Probe in die Membran und befestigen Sie den zweiten Verschluss mindestens einen Zentimeter vom oberen Ende des Schlauches.In einem gekühlten Raum bei vier Grad Celsius den Behälter mit AIEX-Puffer A auf eine Rührplatte legen, einen Rührstab hinzufügen und die Membran mit Proteinlösung gefüllt. Stellen Sie die Geschwindigkeit ein, um die Probe so zu drehen, dass es keine Interferenzen mit der rotierenden Rührstange gibt. Dialyze für 12 bis 24 Stunden bei vier Grad Celsius dann ersetzen Sie den Dialysepuffer mit freien vorgekühlten Puffer A und fahren Sie für mindestens vier zusätzliche Stunden fort.Übertragen Sie die dialysierte Proteinlösung aus dem Schlauch in ein 50 Milliliter-Rohr durch eine 0,45-Mikron-Filtereinheit. Starten Sie den FPLC mit allgemeiner Wartung. Verbinden Sie die Säulenpuffer AIEX A und AIEX B mit Pufferventilen und anionenaustauscherregenden Harzen, die eine Säule enthalten, an die Säulenanschlüsse des FPLC.Passen Sie die allgemeinen chromatographischen Parameter entsprechend an. Starten Sie das AIEX-Programm in der FPLC-Software und wählen Sie das Gleichgewichtsvolumen für Puffer A. Anschließend laden Sie die Probe auf die Säule und legen Sie die Proteine mit einem linearen Gradienten von 0% bis 100% hohem Salzpuffer ab. Sammeln Sie zwei Milliliter-Fraktionen während der Elution.Analysieren Sie die eluierten Brüche nach Abschluss des Laufs. Laden Sie dazu 10 Mikroliter jeder Fraktion auf eine Coomassie-gefärbte 15%SDS-Seite und identifizieren Sie Brüche, die S100A12 enthalten. Diese S100A12 enthalten den Fraktionen für die Dialyse in TRIS-gepufferter Salin.Um die Proteinreinigung nach der Proteindialyse fortzusetzen, fügen Sie der Probe ein Calciumchlorid zu einer Endkonzentration von 25 Millimolar hinzu, was die Bindung von S100A12 an das Harz im nächsten Schritt erleichtert. Filtern Sie dann die Probe durch einen Filter mit einer Gießgröße von 0,45 Mikrometern. Ausgleichs-HIC-Puffer und Proben bis zu vier Grad Celsius.Verbinden Sie als Nächstes die Spaltenpuffer HIC A und B und die Spalte mit dem System, und passen Sie die Parameter an. Starten Sie die Methode, um die Spalte mit einem bis zwei Spaltenvolumes des Puffers HIC A auszugleichen, und laden Sie die Probe, und der nicht gebundene Probenblock mit einem UV-Signal erreicht erneut den Basiswert. Dann beginnen Sie die Elution mit einem Kalziumchelat, der Puffer EDTA enthält.Sammeln Sie zwei Milliliter Spitzenfraktionen während der Elution. Nach der Analyse von 10 Mikrolitern jeder Fraktion auf einer Coomassie-gefärbten 15%SDS-Seite identifizieren sie reine S100A12-Fraktionen. Bündeln Sie diese Brüche und dialyze gegen HBS.Zuerst 15 Milliliter Probe auf eine 50 Kilodalton Zentrifugalfiltereinheit laden. Zentrifuge bei 3200 mal g bei 10 Grad Celsius für ca. 10 Minuten. Übertragen Sie den filtrierten Durchfluss in ein frisches Gefäß, auf Eis.Verwenden Sie nun einen Milliliter HBS, um die Filtermembran zu spülen und die konzentrierte Lösung in der Filterspitze zu verdünnen. Zentrifuge wieder, um so viel Protein wie möglich im Durchfluss zurückzugewinnen. Um die Lösung zu filtern, wiederholen Sie die Probenbelastung und Zentrifugation so oft wie nötig.Um den durchfließenden S100A12 zu konzentrieren, laden Sie ihn ca. 30 Minuten lang in einen drei Kilodalton-Zentrifugalfilter und eine Zentrifuge bei 3200 mal g, 10 Grad Celsius. Nun wird das Volumen auf 1/5 bis 1/10 des ursprünglichen Ladevolumens reduziert. Übertragen Sie die konzentrierte Lösung auf eine neue Röhre.Wiederholen Sie den Konzentrationsschritt so oft wie nötig. Nach der chemischen Vernetzung führen Sie nach dem Manuskript eine Größenausschlusschromatographie durch. Equilibrate die Spalte in HBS, laden Sie die Probe, und sammeln Sie Spitzenfraktionen von ein bis zwei Milliliter während des Laufs.Nach der Analyse dieser Brüche auf einer SDS-Seite mit vier bis 20 % Gradienten, Pool-Fraktionen mit Hauptbändern des gewünschten Proteinkomplexes. Konzentrieren Sie dann die Lösungen wie bisher. Um Monozyten von menschlichen Buffy-Schichten durch Dichtegradientenzentrifugation zu isolieren, gleicht zuerst die Trennlösung auf Raumtemperatur aus.20 Milliliter in 15 Milliliter Zentrifugenrohre, zwei Tuben pro Buffy-Mantel. Das Blut aus dem menschlichen Buffy-Mantel mit HBSS auf ein Gesamtvolumen von 60 Millilitern verdünnen und 30 Milliliter dieser Mischung sorgfältig auf das Trennmedium schichten. Zentrifuge bei 550 mal g für 35 Minuten bei Raumtemperatur.Schalten Sie die Bremse der Zentrifuge aus. Nach der Zentrifugation befinden sich die mononukleären peripheren Blutkörperchen direkt auf dem Trennmedium. Mit einer Pipette diese Zellen in ein frisches 50 Milliliter Zentrifugenrohr übertragen.Füllen Sie das Rohr mit HBSS auf 50 Milliliter und Zentrifuge bei 170 mal g für 10 Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in einem kleinen Volumen von HBSS durch Pipettieren wieder auf. Dann füllen Sie das Rohr bis zu 50 Milliliter und Zentrifuge bei 290 mal g für 10 Minuten.Aspirieren Sie den Überstand wieder. Die Zellen in 50 MilliliterN HBSS und Zentrifuge bei 170 mal g für 10 Minuten wieder aussetzen. Den Überstand ansaugen und das Zellpellet in einem kleinen Volumen von einem Milliliter Trennpuffer wieder aufsetzen, die Zellen zählen und einer Konzentration von fünf mal 10 zu den sieben Zellen pro Milliliter Puffer hinzufügen.Verwenden Sie für die Monozytenisolation von mononukleären peripheren Blutzellen ein magnetisches Negativzellisolationskit und folgen Sie dem Herstellerprotokoll. Verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler, um die Monozyten zu zählen und in Monozytenmedium auf eine Konzentration von zwei mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter wieder aufzuhängen. Um Monozyten zu kultiieren, legen Sie eine Zellkulturschale mit einem hydrophoben Gas-permeablen Film für Suspensionszellen.Stellen Sie die Platten für die Sterilisation ca. 30 Minuten unter UV-Licht. 15 bis 25 Milliliter der Zellsuspension auf diese Kulturplatten übertragen und über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid ruhen lassen. Nach der Vorreinigung der AIEX-Säule und der anschließenden kalziumabhängigen HIC wurde hochreines Protein gewonnen.Als zusätzliche Kontrolle wurden menschliche Monozyten mit LPS stimuliert und produzierten Wildprotein. Die Proteinexposition gegenüber verschiedenen Ionen führt zur Anordnung verschiedener S100A12-Oligomere. Steigende Zinkkonzentrationen induzieren die Anordnung von S100A12 in Tetramere und Hexamer bei Trennung auf vier bis 20%Coomassie gebeizt SDS-Seite.Wenn ein Überschuss an Ionen vor der Vernetzung angewendet wurde, induzierte es eine ausgeprägte Verschiebung des Oligomergleichgewichts. S100A12 wurde in Gegenwart von 25 Millimolar Calcium oder 25 Millimolar Calcium und einem Millimolar Zink vernetzt. Nach Der Vernetzung im HBS-Puffer mit 25 Millimolaren Calciumchlorid und einem Millimolaren Zinkchlorid wurden Hexamer und Tetramer getrennt.Tetramer und Dimer wurden im HBS-Puffer mit 25 Millimolar Calciumchlorid getrennt. Ein Beispiel für gepoolte und konzentrierte Oligomere nach der Trennung auf einer Coomassie-gefärbten SDS-Seite mit 15% Gradient zeigt Dimer, Tetramer und Hexamer. Die Monozytenstimulation mit hexamerischem S100A12 führte zu einer ausgeprägten TNF-Alpha-Freisetzung.Nach der Entfernung von Endotoxin ist es wichtig, bei der anschließenden Erzeugung und Reinigung der Oligomere keine Kontamination in die Proben einzuleiten. Eine nachgelagerte Analyse eines Prozesses, der sich auf die S100A12-Oligomerisierung bezieht, ist denkbar. Ebenso können Aminosäuren und Ionenbedingungen analysiert werden, die den Oligomerisierungsprozess selbst beeinflussen.Wir verwenden derzeit S100A12-Oligomere, die gemäß dem beschriebenen Protokoll getrennt sind, um spezifische Peptidligaden und Antikörper zu entwickeln, um die Signalisierung des Proteins durch TLF4 zu blockieren und diagnostische Assays zu entwickeln und zu verbessern.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Reinigung von spezifischen Zellpopulation durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Quantitative Beurteilung der Immunzellen in das verletzte Rückenmark Tissue mittels Durchflusszytometrie: eine neue Verwendung für eine Zelle Reinigungsverfahren

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolierung von Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

Generierung von Lymphknoten-Fett-Pad Chimären für die Studie der Lymphknoten Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Detektion von fluoreszierenden Nanopartikel Wechselwirkungen mit primären Immun-Zell-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Ein Semi-automatisierten Ansatz zur Vorbereitung Antikörper-Cocktails für immunphänotypische Analyse von menschlichem peripherem Blut

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolation und Analyse über Durchflusszytometrie von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn der Maus

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...