Name: purification of human s100a12 and its ion-induced oligomers for immune cell stimulation
Uploaded: 2019-09-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del programma di ricerca medica innovativo intramurale della facoltà di medicina dell'Università Muenster (da KE121201 a C.K.) e della Fondazione tedesca per la ricerca (DFG, Fo354/3-1 a D.F.).

NOT:</</c0> Si prega di fare riferimento alla tabella supplementare 1 per la preparazione di buffer e soluzioni di stock.
1. Espressione proteica in E. coli
<ol><li>
Clonazione
	<ol>
<li>Clona l'uomo s100A12 (ncBI Reference Sequence: NP_005612.1) in un vettore di espressione batterica pET11b. Per esprimere la proteina, trasformare il costrutto in E. coli BL21(DE3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
cultura
	<ol>
<li...

<ol>
	<li>Liston, A., Masters, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostasis-altering+molecular+processes+as+mechanisms+of+inflammasome+activation.">Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).</li><li>Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocyte-derived+S100+proteins+in+autoinflammation:+putative+role+in+pathogenesis+and+usefulness+as+biomarkers.">Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers.</a> Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).</li><li>Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+circular+dichroism+studies+of+iron(ii)+binding+to+human+calprotectin.">Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin.</a> Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).</li><li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein.">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).</li><li>Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nickel+Sequestration+by+the+Host-Defense+Protein+Human+Calprotectin.">Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).</li><li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12.">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex:+implications+for+host-parasite+defence.">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li><li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc:+new+insights+into+S100A12+oligomerisation.">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).</li><li>Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+the+human+(S100A8/S100A9)2+heterotetramer,+calprotectin,+illustrates+how+conformational+changes+of+interacting+alpha-helices+can+determine+specific+association+of+two+EF-hand+proteins.">The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+Ca2++and+Zn2++are+essential+for+S100A12+protein+oligomerization+and+function.">Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function.</a> BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).</li><li>Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ions+binding+to+S100+proteins.+I.+Calcium-+and+zinc-binding+properties+of+bovine+brain+S100+alpha+alpha,+S100a+(alpha+beta),+and+S100b+(beta+beta)+protein:+Zn2++regulates+Ca2++binding+on+S100b+protein.">Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).</li><li>Dell&#8217;Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+and+binding+properties+of+calgranulin+C,+a+novel+S100-like+calcium-binding+protein+from+pig+granulocytes.">Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).</li><li>Vogl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A12+is+expressed+exclusively+by+granulocytes+and+acts+independently+from+MRP8+and+MRP14.">S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).</li><li>Hofmann, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+mediates+a+novel+proinflammatory+axis:+a+central+cell+surface+receptor+for+S100/calgranulin+polypeptides.">RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides.</a> Cell. 97 (7), 889-901 (1999).</li><li>Foell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+S100A12+Can+Activate+Human+Monocytes+via+Toll-like+Receptor+4.">Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).</li><li>Kessel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+zinc+tune+autoinflammatory+Toll-like+receptor+4+signaling+by+S100A12.">Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).</li><li>Armaroli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-Derived+Interleukin-1beta+As+the+Driver+of+S100A12-Induced+Sterile+Inflammatory+Activation+of+Human+Coronary+Artery+Endothelial+Cells:+Implications+for+the+Pathogenesis+of+Kawasaki+Disease.">Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).</li><li>GE Healthcare. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Strategies for Protein Purification. 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O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+endotoxin+removal+from+biological+preparations:+a+review.">Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review.</a> Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).</li><li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+removal+from+protein+solutions.">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li><li>Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+partial+characterization+of+canine+S100A12.">Purification and partial characterization of canine S100A12.</a> Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).</li><li>Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+human+Ca2+-bound+S100A12.">Solution structure of human Ca2+-bound S100A12.</a> Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).</li><li>Endotoxin Removal. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Application Note - Sartorius Stedim Biotech. , (2010).</li><li>Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymyxin-B+Stimulates+Production+of+Complement+Components+and+Cytokines+in+Human+Monocytes.">Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).</li><li>Valentinis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+effects+of+polymyxin+B+on+human+dendritic+cells+maturation+-+The+role+of+I+kappa+B-alpha/NF-kappa+B+and+ERK1/2+pathways+and+adhesion.">Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).</li><li>Teuber, M., Miller, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Binding+of+Polymyxin-B+to+Negatively+Charged+Lipid+Monolayers.">Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).</li></ol>

In questo protocollo, descriviamo l'espressione batterica priva di tag dell'uomo S100A12 e la sua purificazione, nonché la separazione in diversi oligomeri indotti dagli ioni per la stimolazione delle cellule immunitarie. Rispetto alla letteratura pubblicata sulla purificazione della proteina S100A128,23,24, l'uso dell'alto CaCl2 (25 mM) nella cromatografia di interazione idrofobica è a nostra conoscenza unica. Dive...

S100A12 è una proteina legante di calcio che è prevalentemente prodotta da granulociti umani. La proteina è sovraespressa durante l'infiammazione (sistemica) e i suoi livelli di siero, in particolare nelle malattie (auto)infiammatorie come l'artrite idiopatica giovanile sistemica (sJIA), la febbre mediterranea familiare (FMF) o la malattia di Kawasaki (KD) l'attività della malattia e la risposta alla terapia. A seconda dei recettori di riconoscimento dei modelli (PRR), come i recettori a pedaggio (TLR), il sistema immunitario innato può essere attivato da modelli molecolari associati a i patogeni (PPR) come lipopolioaccharides (LPS) o modelli molecolari associati al danno (DAMP; denominato anche "alarmins"). I DAMP sono molecole endogene come proteine cellulari, lipidi o acidi nucleici1. Le funzioni DAMP sono ben descritte per i membri della famiglia di proteine calgranulina, S100A8/A9 e S100A122, che sono anche segnalati per operare come peptides antimicrobico cheonali metallico divalenteleoni 3,4, 5,6. A seconda della forza iologica disponibile S100A12 può, come altri membri della famiglia S100, organizzare in diversi omomultime e fino a poco tempo fa l'impatto di S100A12-oligomerisation sull'interazione PRR, in particolare TLR4, era sconosciuto.
La forma monomerica della proteina (92 aminoacidi, 10,2 kDa) è costituita da due strutture eliche-loop-eliche a mano eF collegate da un linker flessibile. La mano EF -terminale Ccontiene il classico motivo di rilegatura Ca2,mentre la mano EF -terminale Npresenta una struttura a ciclo esteso specifica della proteina S100 ('pseudo-EF-hand') e rivela una ridotta affinità Ca2. Il legame di Ca2 xda parte di S100A12 può indurre un importante cambiamento conformazionale nel capolinea Cdelle proteine, che si traduce in un'esposizione di una macchia idrofobica su ciascun monomero e forma l'interfaccia di dimerizzazione. Così, in condizioni fisiologiche, la più piccola struttura quaternaria formata da S100A12 è un dimero non covalente (circa 21 kDa) in cui i singoli monomeri sono in orientamento antiparallelo. Una volta disposto come dimero, S100A12 viene segnalato al sequestro di n2 e ad altri ioni metallici divalenti, ad esempio Cu2, con alta affinità7. Questi ioni sono coordinati all'interfaccia dimero S100A12 da aminoacidi H15 e D25 di una sottounità e H85, nonché H89 dell'anti-paralleling di altre sottounità8,9,10. Mentre gli studi precedenti propongono che l'S100A12 caricato dan.2o 2 può indurre l'organizzazione della proteina in omo-tetrameri (44 kDa) e per provocare un aumento dell'affinità Ca2,12, recente titolazione metallica Gli studi6 suggeriscono che il legame Di Ca2 diS100A12 per aumentare l'affinità della proteina conn. 2. Una volta che le lancette EF S100A12 sono completamente occupate da Ca2o, si pensa che ca2 o più si leghi tra i dimeri, innescando la formazione di esamere (circa 63 kDa). L'architettura della struttura trimestrale hexamica è chiaramente diversa da quella del tetramero. Si propone che l'interfaccia tetramer è interrotta per dare origine a nuove interfacce dimer-dimer che beneficiano la formazione di esagomeri10. S100A12 è quasi esclusivamente espresso da granulociti umani dove costituisce circa il 5% di tutte le proteine citosoliche13. Nella sua funzione DAMP S100A12 è stato storicamente descritto come agonista del recettore multi-ligando per prodotti finali di glicazione avanzata (RAGE), poi chiamato extracellulare proteina legante RAGE di recente identificata (EN-RAGE)14. Anche se in precedenza abbiamo segnalato biochimica S100A12-legatura sia rage e TLR415, abbiamo recentemente dimostrato monociti umani per rispondere alla stimolazione S100A12 in modo tramite TLR416. Ciò richiede la disposizione di S100A12 nella suastrutturatrimestrale hexameric indotta da Ca2/ n2.
Qui descriviamo una procedura di purificazione per l'uomo ricombinante S100A12 e le sue oligomeri indotte dagli ioni per le stimolazioni delle cellule immunitarie16,17. Questo si basa su una strategia di cromatografia in due fasi, che inizialmente include una colonna di scambio di anioni per isolare e concentrare la proteina e rimuovere le contaminazioni sfuse (ad esempio, endotossine/lipopolysaccharides)18. Le resine di cromatografia dello scambio io-scie separano le proteine sulla base di diverse cariche nette di superficie. Per le proteine acide come S100A12 (punto isoelettrico di 5.81), un sistema di tampone con un pH di 8,5 e una forte resina di scambio di anion porta ad una buona separazione. Le proteine legate sono state eluite con un gradiente tampone ad alto contenuto di sale. Con un aumento degli ioni negativi di forza ionica nel tampone di eluizione competere con le proteine per le cariche sulla superficie della resina. Le proteine si eludono individualmente a seconda della loro carica netta e in conseguenza di ciò, i tamponi descritti qui permettono di isolare e concentrare la proteina S100A12 sovraespressa. A causa di gruppi caricati negativamente nei lipopolioaccharide, queste molecole si legano anche alle resine di scambio di anioni. Tuttavia, la loro maggiore carica netta si traduce in una successiva eluizione nel gradiente ad alto sale applicato. La seconda fase della procedura di purificazione è stata introdotta a i fini della lucidatura. Questo fa uso della capacità di legame del calcio di S100A12 e rimuove le impurità rimanenti su una colonna di interazione idrofobica. Il legame di calcio di S100A12 porta a un cambiamento conformazionale e ad un'esposizione di macchie idrofobiche sulla superficie della proteina. A tale condizione, S100A12 interagisce con la superficie idrofobica della resina. Al momento del chelante di calcio da parte di EDTA, questa interazione è invertita. In presenza di ioni, in particolare calcio e zinco, S100A12 si organizza in oligomeri ommerici. Per studiare le relazioni struttura-funzione dei diversi oligomeri, abbiamo stabilizzato la cromatoria dimericica, tetramerica e hexamcumso S100A12 con un crosslinker chimico e abbiamo separato i complessi su una colonna cromatografica di dimensioni-esclusione. Infine, per analizzare la funzionalità e l'attività biologica della proteina purificata e dei suoi oligomeri indotti dagli ioni, è possibile confrontare il rilascio di citochina del monocito stimolato S100A12 e del monocito stimolato LPS.
Finora sono stati descritti vari metodi per purificare S100A12. Jackson et al.19, per esempio, ha pubblicato un protocollo con purificazione tramite una colonna di scambio di anion e una successiva cromatografia di esclusione di dimensioni. La purificazione in una colonna di esclusione delle dimensioni porta a buoni risultati, ma, ad esempio a causa dei volumi di carico limitati, è meno flessibile in termini di scalabilità. Un approccio diverso, pubblicato da Kiss et al.20, descrive la purificazione delle proteine marcate tramite la colonna di affinità Ni2 come primo passaggio di purificazione, seguito da scissione enzimatica per rimuovere il tag e ulteriori passaggi di purificazione. In contrasto con gli studi foriciti19,20, la proteina prodotta come descritto in questo protocollo è determinata per esperimenti sulle cellule immunitarie. Pertanto, la contaminazione da endotossina residua dalla coltura batterica è una sfida. Anche se finora sono stati descritti diversi approcci per la rimozione dell'endotossina, non esiste un metodo uniforme che funzioni altrettanto bene per una determinata soluzione proteica21,22.
In sintesi, il nostro protocollo combina i vantaggi di un'espressione senza tag in un sistema batterico con un'efficiente rimozione dell'endotossina e un alto rendimento di proteine pure.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pET11b vector</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x Non-essential amino acids</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K 0293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% HCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X897.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8722;20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciumchlorid Dihydrat</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5239.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human Monocyte Enrichment Kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19059</td>
			<td>Magnetic negative cell isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoLISA</td>
			<td>Hyglos</td>
			<td>609033</td>
			<td>Endotoxin detection assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxin-Free Ultra Pure Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TMS-011-A</td>
			<td>Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoTrap red</td>
			<td>Hyglos</td>
			<td>321063</td>
			<td>Endotoxin removal resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (heat-inactivated)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (high quality, endotoxin testet)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hTNF-alpha - OptEia ELISA Set</td>
			<td>BD</td>
			<td>555212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (isopropyl-&#223;-D-thiogalactopyranosid)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN08.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K 0282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Medium</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L6529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll, human</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-60500</td>
			<td>Separation solution (density gradient centrifugation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A 2212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl Sepharose High Performance</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1082-01</td>
			<td>Resin for hydrophobic interaction chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-pmb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Sepharose Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0510-01</td>
			<td>Resin for anion-exchange chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSep buffer</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>20104</td>
			<td>Cell separation buffer (section 5.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F 1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3957.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P031.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SLHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL roundbottom tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Erlenmyer flask</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>LY98.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well suspension plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 L measuring beaker</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CKN3.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL high-speed centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3,01,22,178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (100 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing Closures</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep magnet &#39;The Big Easy`</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector tubes 5 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>115101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox film, 25 &#181;m, 305 mm x 40 m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94,60,77,316</td>
			<td>Film for monocyte culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa)</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop filter unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C Incubator (with shaking)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA purifier UPC 10</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>FPLC System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Frac-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (with rotor A-4-81)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F-34-6-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean Tetra Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPhotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>P330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Brandelin</td>
			<td>UW2070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>infinite M200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Knick</td>
			<td>765</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of human s100a12 and its ion-induced oligomers for immune cell stimulation

In questo protocollo, descriviamo un metodo per purificare la proteina che lega il calcio umano S100A12 e i suoi oligomeri indotti dagli oligomeri di Escherichia coli per la stimolazione delle cellule immunitarie. Questo protocollo si basa su una strategia di cromatografia in due fasi, che comprende la pre-purificazione delle proteine su una colonna di cromatografia di scambio di anioni e un successivo passo di lucidatura su una colonna di interazione idrofobica. Questa strategia produce proteine S100A12 ad alta purezza e resa a costi gestibili. Per i test funzionali sulle cellule immunitarie l'eventuale contaminazione da endotossina residua richiede un attento monitoraggio e ulteriori passaggi di pulizia per ottenere proteine prive di endotossina. La maggior parte delle contaminazioni da endotossina può essere esclusa dalla cromatografia di scambio di anioni. Per esaurire le contaminazioni residue, questo protocollo descrive una fase di rimozione con filtri centrifughi. A seconda della forza io-resistenza disponibile S100A12 può organizzare in diversi omomultimer. Per studiare il rapporto tra struttura e funzione, questo protocollo descrive ulteriormente il trattamento io-io della proteina S100A12 seguito dal crosslinking chimico per stabilizzare gli oligomeri S100A12 e la loro successiva separazione per dimensione-esclusione Cromatografia. Infine, descriviamo un saggio basato sulle cellule che conferma l'attività biologica della proteina purificata e conferma la preparazione senza LPS.

In seguito alla pre-purificazione sulla colonna AIEX (Figura 1A-C) e al successivo HIC dipendente dal calcio (Figura 2A,B), sono state ottenute proteine altamente pure (Figura 2C). Inoltre, le misurazioni dell'endotossina hanno rivelato un successo della rimozione degli LPS. Il contenuto LPS seguito all'AIEX è stato misurato in una diluizione 1:10 superiore al limite di rilevamento degli saggi, val...

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Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

Questo protocollo descrive un metodo di purificazione per la proteina ricombinante di legame del calcio senza tag S100A12 e i suoi oligomeri indotti dagli ioni per i saggi di stimolazione monocite umana.

Purificazione di Human S100A12 e delle sue Oligomeri indotte dallo ione per la stimolazione cellulare immunitaria

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

Questo protocollo descrive una procedura di purificazione completa per la proteina legante il calcio umano, S100A12, e in particolare, per i diversi oligomeri indotti dagli ioni per implicazioni di ricerca a valle. Con questa tecnica, siamo in grado di mantenere l'alta resa di proteine molto pure ed endotossine. Il cross-linking chimico e la separazione sulla colonna cromatografica di esclusione delle dimensioni è un metodo convincente per generare proteine omo-oligomeriche per ulteriori test funzionali.La nostra tecnica ci consente di aspetti meccanicistici di S100A12 come ligando del recettore del riconoscimento dei modelli e informazioni artistiche per sviluppare idealmente nuovi interventi mirati e migliorare i test diagnostici. Oltre a guardare questo video, consigliamo un'attenta lettura del protocollo, poiché descriviamo una procedura complessa in più step. Per iniziare, tagliare un tubo di dialisi in una lunghezza appropriata, circa 30 centimetri, con spazio aggiuntivo per l'aria.Immergere la membrana in acqua deionizzata per 15-30 minuti per rimuovere il glicerolo. Per ridurre la viscosità della soluzione proteica cancellata, diluire la soluzione con 25 millilitri di tampone AIEX A.Attaccare la prima chiusura sul tubo. Caricare il campione nella membrana e fissare la seconda chiusura ad almeno un centimetro dall'estremità superiore del tubo.In una stanza raffreddata a quattro gradi Celsius, posizionare il contenitore con tampone AIEX A su una piastra di agitazione, aggiungere una barra di agitazione e la membrana piena di soluzione proteica. Regolare la velocità per ruotare il campione in modo che non vi siano interferenze con la barra di agitazione rotante. Dializzare per 12-24 ore a quattro gradi Celsius, quindi sostituire il buffer dializzato con tampone libero pre-raffreddato A e continuare per almeno quattro ore aggiuntive.Trasferire la soluzione proteica dializzata dal tubo in un tubo da 50 millilitri attraverso un'unità filtrante da 0,45 micron. Avviare l'FPLC con manutenzione generale. Collegare i buffer di colonna AIEX A e AIEX B alle valvole tampone e alla resina di scambio ionico contenente colonna alle porte delle colonne dell'FPLC.Regolare di conseguenza i parametri cromatografici generali. Avviare il programma AIEX nel software FPLC e scegliere il volume di equilibrazione per il buffer A.Successivamente, caricare il campione sulla colonna ed elutare le proteine con un gradiente lineare dallo 0% al 100% di buffer di sale alto. Raccogliere due frazioni di millilitro durante l'eluizione.Analizzare le frazioni eluizzate dopo aver terminato la corsa. Per questo, caricare 10 microlitri di ogni frazione su una pagina Coomassie macchiata al 15%SDS e identificare le frazioni contenenti S100A12. Mettere in comune questi S100A12 contenenti frazioni per la dialisi in salina tamponata da TRIS.Per continuare la purificazione proteica, dopo la dialisi proteica, aggiungere un cloruro di calcio al campione a una concentrazione finale di 25 millimolare, che faciliterà il legame di S100A12 alla resina nella fase successiva. Quindi, filtrare il campione attraverso un filtro con una dimensione di versamento di 0,45 micron. Equilibrare i buffer HIC e i campioni a quattro gradi Celsius.Collegare quindi i buffer di colonna HIC A e B e la colonna al sistema e regolare i parametri. Avviare il metodo per equilibrare la colonna con uno o due volumi di colonna di buffer HIC A e caricare il campione e il blocco campione non associato di lavaggio con un segnale UV raggiunge nuovamente il livello di base. Quindi iniziare l'eluizione con un chelatore di calcio contenente EDTA tampone.Raccogliere due millilitri di frazioni di picco durante l'eluizione. Dopo aver analizzato 10 microlitri di ogni frazione su una pagina Coomassie macchiata del 15%SDS, identificare frazioni S100A12 pure. Mettere in comune queste frazioni e dializzare contro HBS.In primo luogo, caricare 15 millilitri di campione su un'unità filtrante centrifuga da 50 kilodalton. Centrifuga a 3200 volte g a 10 gradi Celsius per circa 10 minuti. Trasferire il flusso filtrato in un recipiente fresco, sul ghiaccio.Ora, utilizzare un millilitro di HBS per risciacquare la membrana filtrante e per diluire la soluzione concentrata nella punta del filtro. Centrifugare di nuovo per recuperare quanta più proteina possibile nel flusso. Per filtrare la soluzione, ripetere il carico del campione e la centrifugazione tutte le volte che è necessario.Successivamente, per concentrare l'S100A12 contenente il flusso, caricarlo in un filtro centrifugo a tre kilodalton e centrifugare a 3200 volte g, 10 gradi Celsius per circa 30 minuti. Ora il volume è ridotto a 1/5 fino a 1/10 del volume di carico iniziale. Trasferire la soluzione concentrata in un nuovo tubo.Ripetere il passaggio di concentrazione tutte le volte che è necessario. Dopo il cross-linking chimico, secondo il manoscritto, eseguire la cromatografia ad esclusione delle dimensioni. Equilibrare la colonna in HBS, caricare il campione e raccogliere frazioni di picco da uno a due millilitri durante la corsa.Dopo aver analizzato queste frazioni su una pagina SDS dal 4 al 20%, le frazioni di pool con le bande principali del complesso proteico desiderato. Quindi concentrare le soluzioni come fatto in precedenza. Per isolare i monociti dai cappotti buffy umani per centrifugazione gradiente di densità, equilibrare prima la soluzione di separazione a temperatura ambiente.Trasferire 20 millilitri in tubi di centrifuga da 15 millilitri, due tubi per strato buffy. Diluire il sangue dal mantello di buffy umana con HBSS a un volume totale di 60 millilitri e strato 30 millilitri di questa miscela con attenzione sopra il mezzo di separazione. Centrifuga a 550 volte g per 35 minuti a temperatura ambiente.Spegnere il freno della centrifuga. Dopo la centrifugazione, le cellule del sangue periferiche mononucleari si trovano direttamente sopra il mezzo di separazione. Con una pipetta, trasferire queste cellule in un tubo di centrifuga fresco da 50 millilitri.Riempire il tubo con HBSS a 50 millilitri e centrifugare a 170 volte g per 10 minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in un piccolo volume di HBSS pipettando. Quindi, riempire il tubo fino a 50 millilitri e centrifugare a 290 volte g per 10 minuti.Aspira di nuovo il supernatante. Rimospendare le cellule in 50 millilitri di HBSS e centrifugare a 170 volte g per 10 minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in un piccolo volume di un millilitro di tampone di separazione, contare le cellule e aggiungere tampone a una concentrazione di cinque volte 10 alle sette cellule per millilitro.Per l'isolamento dei monociti dalle cellule del sangue periferiche mononucleari, utilizzare un kit di isolamento cellulare negativo magnetico e seguire il protocollo del produttore. Utilizzare un contatore di celle automatizzato per contare i monociti e il resuspend in mezzo monocito a una concentrazione di due volte 10 alle sei cellule per millilitro. Per coltura dei monociti, stendere un piatto di coltura cellulare con un film permeabile al gas idrofobico adatto alle celle di sospensione.Posizionare le piastre sotto la luce UV per circa 30 minuti per la sterilizzazione. Trasferire da 15 a 25 millilitri della sospensione cellulare a queste piastre di coltura e lasciarli riposare durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo la pre-purificazione sulla colonna AIEX e la successiva HIC dipendente dal calcio, è stata ottenuta una proteina altamente pura.Come ulteriore controllo, i monociti umani sono stati stimolati con l'LPS e hanno prodotto proteine di tipo selvatico. L'esposizione proteica a diversi ioni si traduce in una disposizione di diversi oligomeri S100A12. L'aumento delle concentrazioni di zinco induce la disposizione di S100A12 in tetrameri ed esameri al momento della separazione sulla pagina SDS macchiata da quattro a 20%Coomassie.Quando un eccesso di ioni è stato applicato prima del collegamento incrociato, ha indotto uno spostamento pronunciato dell'equilibrio oligomero. S100A12 è stato incrociato in presenza di calcio 25 millimolare o 25 millimolare di calcio e uno zinco millimolare. Dopo il collegamento incrociato nel tampone HBS con cloruro di calcio millimolare e un cloruro di zinco millimolare, esamero e tetramero sono stati separati.Tetramero e dimero sono stati separati in tampone HBS con cloruro di calcio millimolare da 25 millimolare. Un esempio di oligomeri raggruppati e concentrati dopo la separazione su una pagina SDS sfumato da quattro a 15% mostra dimero, tetramero ed esamero. La stimolazione monocitare con esamerico S100A12 ha provocato un rilascio alfa TNF pronunciato.Dopo la rimozione dell'endotossina, è importante non reintrodurre la contaminazione nei campioni durante la successiva generazione e purificazione degli oligomeri. L'analisi a valle di qualsiasi processo relativo all'oligomerizzazione S100A12 è concepibile. Allo stesso modo, possono essere analizzati gli amminoacidi e le condizioni ioniche che influenzano il processo di oligomerizzazione stesso.Attualmente stiamo usando oligomeri S100A12 separati secondo il protocollo descritto per sviluppare ligandi peptidici specifici e anticorpi per bloccare la segnalazione della proteina attraverso TLF4 e per sviluppare e migliorare i test diagnostici.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Purificazione della popolazione di cellule specifiche per fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

La valutazione quantitativa delle cellule immunitarie nel tessuto danneggiato del midollo spinale mediante citometria di flusso: un nuovo uso per un metodo di purificazione cellulare

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Analisi Citometria a flusso di cellule immunitarie all&#39;interno aorte Murine

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Isolamento di cellule cardiache funzionali immunitario

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Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

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