Name: purification of human s100a12 and its ion-induced oligomers for immune cell stimulation
Uploaded: 2019-09-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation at JoVE.com

この研究は、ミュンスター大学医学部(KE121201からC.K.)とドイツ研究財団(DFG、Fo354/3-1からD.F.)の内壁内革新的な医学研究プログラムからの助成金によって支援されました。

注:バッファーおよびストックソリューションの準備については、補足表1を参照してください。
1.大腸菌におけるタンパク質発現
<ol><li>
クローニング
	<ol>
<li>クローンタグフリーヒトS100A12(NCBI基準配列:NP_005612.1)を細菌発現ベクターpET11bに分けます。タンパク質を発現させるには、大腸菌BL21(DE3)に分解物を変換する。</li...

<ol>
	<li>Liston, A., Masters, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostasis-altering+molecular+processes+as+mechanisms+of+inflammasome+activation.">Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).</li><li>Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocyte-derived+S100+proteins+in+autoinflammation:+putative+role+in+pathogenesis+and+usefulness+as+biomarkers.">Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers.</a> Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).</li><li>Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+circular+dichroism+studies+of+iron(ii)+binding+to+human+calprotectin.">Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin.</a> Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).</li><li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein.">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).</li><li>Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nickel+Sequestration+by+the+Host-Defense+Protein+Human+Calprotectin.">Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).</li><li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12.">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex:+implications+for+host-parasite+defence.">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li><li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc:+new+insights+into+S100A12+oligomerisation.">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).</li><li>Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+the+human+(S100A8/S100A9)2+heterotetramer,+calprotectin,+illustrates+how+conformational+changes+of+interacting+alpha-helices+can+determine+specific+association+of+two+EF-hand+proteins.">The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+Ca2++and+Zn2++are+essential+for+S100A12+protein+oligomerization+and+function.">Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function.</a> BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).</li><li>Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ions+binding+to+S100+proteins.+I.+Calcium-+and+zinc-binding+properties+of+bovine+brain+S100+alpha+alpha,+S100a+(alpha+beta),+and+S100b+(beta+beta)+protein:+Zn2++regulates+Ca2++binding+on+S100b+protein.">Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).</li><li>Dell&#8217;Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+and+binding+properties+of+calgranulin+C,+a+novel+S100-like+calcium-binding+protein+from+pig+granulocytes.">Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).</li><li>Vogl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A12+is+expressed+exclusively+by+granulocytes+and+acts+independently+from+MRP8+and+MRP14.">S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).</li><li>Hofmann, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+mediates+a+novel+proinflammatory+axis:+a+central+cell+surface+receptor+for+S100/calgranulin+polypeptides.">RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides.</a> Cell. 97 (7), 889-901 (1999).</li><li>Foell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+S100A12+Can+Activate+Human+Monocytes+via+Toll-like+Receptor+4.">Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).</li><li>Kessel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+zinc+tune+autoinflammatory+Toll-like+receptor+4+signaling+by+S100A12.">Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).</li><li>Armaroli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-Derived+Interleukin-1beta+As+the+Driver+of+S100A12-Induced+Sterile+Inflammatory+Activation+of+Human+Coronary+Artery+Endothelial+Cells:+Implications+for+the+Pathogenesis+of+Kawasaki+Disease.">Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).</li><li>GE Healthcare. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Strategies for Protein Purification. Handbook. , (2010).</li><li>Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+Purification,+and+Antimicrobial+Activity+of+S100A12.">Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).</li><li>Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+S100+Protein-Protein+Complexes.">Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).</li><li>Magalhaes, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+endotoxin+removal+from+biological+preparations:+a+review.">Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review.</a> Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).</li><li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+removal+from+protein+solutions.">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li><li>Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+partial+characterization+of+canine+S100A12.">Purification and partial characterization of canine S100A12.</a> Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).</li><li>Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+human+Ca2+-bound+S100A12.">Solution structure of human Ca2+-bound S100A12.</a> Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).</li><li>Endotoxin Removal. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Application Note - Sartorius Stedim Biotech. , (2010).</li><li>Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymyxin-B+Stimulates+Production+of+Complement+Components+and+Cytokines+in+Human+Monocytes.">Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).</li><li>Valentinis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+effects+of+polymyxin+B+on+human+dendritic+cells+maturation+-+The+role+of+I+kappa+B-alpha/NF-kappa+B+and+ERK1/2+pathways+and+adhesion.">Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).</li><li>Teuber, M., Miller, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Binding+of+Polymyxin-B+to+Negatively+Charged+Lipid+Monolayers.">Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).</li></ol>

このプロトコルでは、ヒトS100A12のタグフリー細菌発現およびその精製、ならびに免疫細胞刺激のための異なるイオン誘発オリゴマーへの分離について説明する。S100A12タンパク質精製8、23、24に関する文献と比較して、疎水性相互作用クロマトグラフィーにおける高CaCl2(25mM)の使用は我々の知識に特有である。1から...

S100A12は、主にヒト顆粒球によって産生されるカルシウム結合タンパク質である。タンパク質は(全身性)炎症およびその血清レベルの間に過剰発現され、特に全身性若年性特発性関節炎(sJIA)、家族性地中海熱(FMF)または川崎病(KD)などの(自動)炎症性疾患において、疾患活動と治療への反応。トール様受容体(TCR)などのパターン認識受容体(PRR)に応じて、自然免疫系は、リポ多糖類(LPS)のような病原体関連分子パターン(AmpP)または損傷関連分子パターン(AmpP;「アラームイン」とも呼ばれます)。DamPは、細胞タンパク質、脂質または核酸1などの内因性分子である。DAMP機能は、カルグラヌリンタンパク質ファミリーのメンバー、S100A8/A9およびS100A122のメンバーについてよく記載されており、これはまた、解数金属イオンキレート系抗菌ペプチド3、4、として動作することが報告されています。5,6.利用可能なイオン強度S100A12は、S100ファミリーの他のメンバーと同様に、異なるホモマルチマーに配置し、最近までPrR相互作用、特にTLR4に対するS100A12オリゴマーライゼーションの影響は不明であった。
タンパク質の単量体形態(92アミノ酸、10.2 kDa)は、柔軟なリンカーによって接続された2つのEFハンドらせんループ-らせん構造から構成されています。C末端EFハンドは古典的なCa2+-結合モチーフを含み、N-末端EF-handはS100タンパク質特異的拡張ループ構造(「擬似EF-hand」)を示し、Ca2+-親和性の低下を明らかにする。S100A12によるCa2+結合は、タンパク質のC-終端の大きな立体構造変化を誘発し、各モノマー上の疎水性パッチの曝露を引き起こし、ダイメナライゼーション界面を形成する。したがって、生理学的条件下では、S100A12によって形成される最小の四分円構造は、個々のモノマーが反平行方向にある非共有ダイマー(約21 kDa)である。ダイマーとして配置された場合、S100A12は、Zn2+ならびに他の二価金属イオン、例えば、高い親和性7を持つCu2+を隔離すると報告される。これらのイオンは、1つのサブユニットおよびH85のアミノ酸H15およびD25、ならびに反並列他のサブユニット8、9、10のH89によってS100A12ダイマー界面で調整される。以前の研究では、Zn2+-loaded S100A12がタンパク質の組織をホモテトラマー(44 kDa)に誘導し、Ca2+-親和性11、12、最近の金属滴定を増加させる可能性があることを提案しています。研究6は、Zn 2+に対するタンパク質の親和性を高めるためにS100A12によるCa2+-結合を示唆している。S100A12 EF-handsがCa2+によって完全に占有されると、追加のCa2+はダイマー間で結合すると考えられ、ヘキサ形成(約63 kDa)をトリガする。ヘメザリック四半期構造のアーキテクチャは、テトラマーの構造とは明らかに異なります。テトラマーインターフェイスは、ヘキサー形成10に利益をもたらす新しいダイマーダイマーインターフェイスを生み出すために破壊することが提案されています。S100A12は、全ての細胞質タンパク質13の約5%を構成するヒト顆粒球によってほぼ排他的に発現される。そのDAMP機能S100A12では、歴史的に高度な糖化最終産物(RAGE)に対するマルチリガンド受容体のアゴニストとして記述され、次いで細胞外同定されたRAGE結合タンパク質(EN-RAGE)14と呼ばれる。我々は以前にRAGEとTLR415の両方に生化学的S100A12結合を報告したが、我々は最近、TLR4依存的な方法16でS100A12刺激に応答するヒト単球を実証した。これには、Ca2+/Zn2+-誘発されたヘメザリック四半期構造 16 に S100A12 を配置する必要があります。
ここでは、組換えヒトS100A12およびその免疫細胞刺激のためのイオン誘発オリゴマーの精製手順を説明する 16,17.これは、最初にタンパク質を単離して濃縮し、バルク汚染(例えば、エンドトキシン/リポ多糖類)18を除去するアニオン交換カラムを含む2段階のクロマトグラフィー戦略に基づいています。イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、異なる正味表面電荷に基づいてタンパク質を分離します。S100A12(等電点5.81)のような酸性タンパク質の場合、pHが8.5と強いアニオン交換樹脂を持つ緩衝系が良好な分離につながります。結合タンパク質を高塩バッファー勾配でタンパク質でタンパク質化した。溶出バッファー内のイオン強度マイナスイオンの増加に伴い、樹脂表面の荷当量に対するタンパク質と競合する。タンパク質は、その正味電荷に応じて個別に溶出し、その結果、ここに記載される緩衝液は、過剰発現したS100A12タンパク質を単離および濃縮することを可能にする。リポ多糖類の負の荷電基のために、これらの分子はまた、アニオン交換樹脂に結合します。しかし、その正味電荷は、適用された高塩勾配で後で溶出します。精製手順の第2段階は、研磨のために導入されている。これはS100A12のカルシウム結合能を利用し、疎水性相互作用カラム上の残りの不純物を除去する。S100A12のカルシウム結合は、タンパク質の表面に立体構造変化および疎水性パッチの曝露につながる。その条件下で、S100A12は樹脂の疎水性表面と相互作用する。EDTAによるカルシウムキレートでは、この相互作用が逆転する。イオン、特にカルシウムおよび亜鉛の存在下で、S100A12はホモメリックオリゴマーに配置する。異なるオリゴマーの構造機能関係を研究するために、化学架リンカーでダイメリック、四面体およびヘメダリック組換えS100A12を安定化させ、サイズ排除クロマトグラフィーカラム上の複合体を分離した。最後に、精製タンパク質とそのイオン誘発オリゴマーの機能性および生物学的活性を分析するために、S100A12およびLPS刺激単球のサイトカイン放出を比較することができる。
S100A12を精製するための種々の方法は、これまでに説明されている。Jackson et al.19は、例えば、アニオン交換カラムおよびその後のサイズ排除クロマトグラフィーを介して精製したプロトコルを公開した。サイズ除外列の精製研磨は良好な結果につながりますが、例えば荷重量が限られているため、スケーラビリティの柔軟性が低くなります。Kiss et al.20によって公開された別のアプローチは、最初の精製ステップとしてNi2+アフィニティカラムを介してタグ付けされたタンパク質の精製を記述し、続いてタグを除去し、さらに精製ステップを酵素切断する。前述の研究19、20とは対照的に、このプロトコルに記載されているように産生されたタンパク質は、免疫細胞上の実験のために決定される。従って、細菌培養物からの残存エンドトキシン汚染が課題である。エンドトキシン除去のための異なるアプローチはこれまで説明されているが、任意の与えられたタンパク質溶液21、22に対して同等に機能する均一な方法はない。
要約すると、我々のプロトコルは、効率的なエンドトキシン除去と純粋なタンパク質の高収率と細菌系におけるタグフリー発現の利点を兼ね備えています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pET11b vector</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x Non-essential amino acids</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K 0293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% HCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X897.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8722;20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciumchlorid Dihydrat</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5239.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human Monocyte Enrichment Kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19059</td>
			<td>Magnetic negative cell isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoLISA</td>
			<td>Hyglos</td>
			<td>609033</td>
			<td>Endotoxin detection assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxin-Free Ultra Pure Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TMS-011-A</td>
			<td>Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoTrap red</td>
			<td>Hyglos</td>
			<td>321063</td>
			<td>Endotoxin removal resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (heat-inactivated)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (high quality, endotoxin testet)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hTNF-alpha - OptEia ELISA Set</td>
			<td>BD</td>
			<td>555212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (isopropyl-&#223;-D-thiogalactopyranosid)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN08.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K 0282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Medium</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L6529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll, human</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-60500</td>
			<td>Separation solution (density gradient centrifugation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A 2212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl Sepharose High Performance</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1082-01</td>
			<td>Resin for hydrophobic interaction chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-pmb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Sepharose Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0510-01</td>
			<td>Resin for anion-exchange chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSep buffer</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>20104</td>
			<td>Cell separation buffer (section 5.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F 1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3957.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P031.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SLHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL roundbottom tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Erlenmyer flask</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>LY98.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well suspension plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 L measuring beaker</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CKN3.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL high-speed centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3,01,22,178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (100 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing Closures</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep magnet &#39;The Big Easy`</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector tubes 5 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>115101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox film, 25 &#181;m, 305 mm x 40 m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94,60,77,316</td>
			<td>Film for monocyte culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa)</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop filter unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C Incubator (with shaking)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA purifier UPC 10</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>FPLC System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Frac-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (with rotor A-4-81)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F-34-6-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean Tetra Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPhotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>P330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Brandelin</td>
			<td>UW2070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>infinite M200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Knick</td>
			<td>765</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of human s100a12 and its ion-induced oligomers for immune cell stimulation

本プロトコルでは、ヒトカルシウム結合タンパク質S100A12及びそのイオン誘発オリゴマーを免疫細胞刺激のための大腸菌培養から精製する方法について述べた。このプロトコルは、アニオン交換クロマトグラフィーカラム上のタンパク質事前精製および疎水性相互作用カラム上のその後の研磨工程を含む2段階のクロマトグラフィー戦略に基づいています。この戦略は、高純度のS100A12タンパク質を生成し、管理可能なコストで収量します。免疫細胞の機能的アッセイの場合、最終的に残りのエンドトキシン汚染は、エンドトキシンフリータンパク質を得るために慎重な監視とさらなる洗浄ステップを必要とします。エンドトキシン汚染の大部分は、アニオン交換クロマトグラフィーによって除外することができます。残留汚染を枯渇させるために、このプロトコルは遠心フィルターによる除去ステップを記述する。利用可能なイオン強度S100A12に応じて、異なるホモマルチマーに配置することができます。構造と機能の関係を調べるために、このプロトコルはさらにS100A12タンパク質のイオン処理について説明し、続いて化学架橋でS100A12オリゴマーを安定化させ、その後のサイズ排除による分離を行う。クロマトグラフィー。最後に、精製タンパク質の生物活性を確認し、LPSフリー製剤を確認する細胞ベースのアッセイについて説明します。

AIEXカラム(図1A-C)およびその後のカルシウム依存性HIC(図2A,B)の事前精製に続いて、高純度タンパク質が得られた(図2C)。さらに、エンドトキシンの測定は、LPS除去に成功したことを明らかにした。AIEXに続くLPS含有量は、アッセイ検出限界を超える1:10希釈、すなわち500EU/mLを超えて測定した。50 kDaフィル...

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Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

このプロトコルは、組換えタグフリーカルシウム結合タンパク質S100A12およびヒト単球刺激アッセイのためのイオン誘導オリゴマーの精製方法を説明する。

免疫細胞刺激のためのヒトS100A12とそのイオン誘発オリゴマーの精製

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

このプロトコルは、ヒトカルシウム結合タンパク質S100A12の完全な精製手順を説明し、特に、下流の研究への影響に対する異なるイオン誘発オリゴマーです。この技術により、非常に純粋で、内毒素を含まないタンパク質の高い収率を維持することができます。サイズ排除クロマトグラフィーカラム上の化学的架橋および分離は、さらなる機能アッセイ用ホモオリゴマータンパク質を生成する説得力のある方法である。この技術により、S100A12のパターン認識受容体リガンドやアート情報としての機械化的側面が可能になり、新たな標的介入を理想的に開発し、診断アッセイを改善することができます。このビデオを見る以外に、複雑な複数ステップの手順を説明しているので、プロトコルを注意深く読むことをお勧めします。まず、透析管を適切な長さ約30センチメートルにカットし、空気のためのスペースを追加します。膜を脱イオン水に15~30分間浸し、グリセロールを除去します。クリアしたタンパク質溶液の粘度を下げるには、25ミリリットルのAIEXバッファーAで溶液を希釈し、最初のクロージャーをチューブに取り付けます。サンプルを膜に積み込み、チューブの上端から少なくとも1センチメートルの第2の閉鎖を取り付けます。冷却された部屋に摂氏4度で、AIEXバッファーAの容器を攪拌板の上に置き、攪拌棒を加え、タンパク質溶液で満たされた膜を加えます。回転するひきかき混じり棒に干渉がないように、サンプルを回転させる速度を調整します。4°Cで12〜24時間透析し、透析バッファーをフリーの事前冷却バッファAに置き換え、少なくとも4時間続けます。チューブから0.45ミクロンのフィルターユニットを介して50ミリリットルチューブに透析タンパク質溶液を移します。一般的なメンテナンスで FPLC を起動します。列バッファー AIEX A および AIEX B をバッファーバルブに接続し、列を含むアニオン交換樹脂を FPLC のカラム ポートに接続します。それに応じて、一般的なクロマトグラフィーパラメータを調整します。FPLC ソフトウェアで AIEX プログラムを起動し、バッファー A の平衡容積を選択します。溶出中に2ミリリットル分を集める。実行を終了した後、溶出した分数を分析します。このために、15%SDSのページを染色したクーマシーの各画分の10マイクロリットルをロードし、S100A12を含む画分を識別します。透析用の分数を含むこれらのS100A12をTRISバッファ状の生理液にプールします。タンパク質精製を継続するには、タンパク質透析後、サンプルに塩化カルシウムを25ミリモルの最終濃度に添加し、次のステップでS100A12の樹脂への結合を容易にする。次に、0.45ミクロンの注ぎ量のフィルターを通してサンプルをフィルターします。HICバッファーとサンプルを摂氏4度に平衡化します。次に、列バッファー HIC A と B と列をシステムに接続し、パラメーターを調整します。バッファー HIC A の 1 ~ 2 列のボリュームで列を平衡化するメソッドを開始し、サンプルをロードし、UV 信号を使用して非バインドサンプル ブロックを UV 信号で洗浄がベースライン レベルに達します。次に、バッファーEDTAを含むカルシウムキレートで溶出を開始する。溶出中に2ミリリットルのピーク画分を収集します。15%SDSのページに染色されたクーマシーの各画分の10マイクロリットルを分析した後、純粋なS100A12画分を識別します。これらの分数をプールし、HBSに対して透析します。まず、15ミリリットルのサンプルを50キロダルトン遠心フィルターユニットに積み込みます。摂氏10度で約10分間3200倍の遠心分離機。濾過されたフロースルーを氷の上の新鮮な容器に移します。さて、フィルター膜をすすぐと、フィルター先端に濃縮された溶液の希釈のためにHBSの1ミリリットルを使用してください。再び遠心分離機は、フロースルーでできるだけ多くのタンパク質を回収する。溶液をフィルタリングするには、サンプルの負荷と遠心分離を必要な回数繰り返します。次に、フロースルーを含むS100A12を濃縮し、3キロダルトン遠心フィルターと遠心分離機に3200倍g、摂氏10度で約30分間積み込みます。これで、ボリュームは初期読み込みボリュームの 1/10 まで 1/5 に減少します。濃縮溶液を新しいチューブに移します。必要に応じて、濃度ステップを繰り返します。化学架橋後、原稿に従って、サイズ排除クロマトグラフィーを行う。HBSでカラムを平衡化し、サンプルをロードし、走行中に1〜2ミリリットルのピーク分率を収集します。これらの画分を4〜20%の勾配SDSページで分析した後、目的のタンパク質複合体の主要バンドと画分をプールする。次に、前に行ったソリューションを集中します。密度勾配遠心分離によりヒトバフィーコートから単球を分離するために、まず分離溶液を室温に平衡化する。20ミリリットルを15ミリリットルの遠心分離チューブに移し、1つのバフィーコートにつき2本のチューブを入れ替えます。HBSSでヒトのバフィーコートから血液を60ミリリットルの総体積に希釈し、この混合物の30ミリリットルを分離媒体の上に慎重に塗布します。室温で35分間550回gで遠心分離機。遠心分離機のブレーキを切ります。遠心分離後、単核末梢血細胞は分離培地の上に直接配置される。ピペットを使用して、これらの細胞を新鮮な50ミリリットルの遠心分離管に移します。チューブに50ミリリットル、遠心分離機を170倍の10分間充填します。上清を吸引し、ピペット処理により少量のHBSSで細胞ペレットを再懸濁する。その後、チューブを最大50ミリリットル、遠心分離機を290倍gで10分間充填します。再び上清を吸引する。HBSSと遠心分離機の50ミリリットルで細胞を10分間170倍に再懸濁します。上清を吸引し、細胞ペレットを1ミリリットルの分離バッファーの少量で再懸濁し、細胞を数え、1ミリリットル当たり7個の細胞に5倍の10の濃度にバッファーを加える。単核末梢血細胞からの単球分離のためには、磁気陰性細胞分離キットを使用し、製造業者の議定書に従ってください。自動化された細胞カウンターを使用して単球をカウントし、1ミリリットル当たり6細胞に対して2倍の濃度に単球培地で再懸濁する。単球を培養するために、懸濁細胞に適した疎水性ガス透過性フィルムを用いた細胞培養皿をレイアウトする。プレートをUV光下に約30分間置き、滅菌します。これらの培養プレートに細胞懸濁液の15〜25ミリリットルを移し、摂氏37度と5%の二酸化炭素で一晩休ませます。AIEXカラム及びそれに続くカルシウム依存性HICに対する予精製後、高純度タンパク質が得られた。さらなるコントロールとして、ヒト単球をLPSで刺激し、野生型タンパク質を産生した。異なるイオンへのタンパク質暴露は異なるS100A12オリゴマーの配置で生じる。亜鉛濃度を上げると、4~20%のクーマシー染色SDSページで分離した際に、S100A12を四量体とヘキサマーに配置することが必要になります。過剰なイオンを架橋前に適用すると、オリゴマー平衡の顕著なシフトを誘導した。S100A12は、25ミリモルカルシウムまたは25ミリモルカルシウムおよび1ミリモル亜鉛の存在下で架橋された。25ミリモル塩化カルシウムと塩化亜鉛1ミリモルとHBS緩衝液中で架橋した後、六重体と四量体を分離した。四量体と二量体を、25ミリモルクロライドでHBS緩衝液中で分離した。クーマシー染色した後にプール及び濃縮オリゴマーの一例は、4〜15%の勾配SDSのページに染色され、二量体、四量体、およびヘキサマーを示す。六方体S100A12による単球刺激は顕著なTNFα放出をもたらした。内毒素除去後、オリゴマーの後の発生および精製中にサンプルに汚染を再導入しないことが重要である。S100A12オリゴマー化に関する任意のプロセスの下流分析が考えられる。同様に、オリゴマー化プロセス自体に影響を与えるアミノ酸およびイオン条件を分析することができる。現在、記載されているプロトコルに従って分離されたS100A12オリゴマーを使用して、特定のペプチドリガンドと抗体を開発して、TLF4を介してタンパク質のシグナル伝達を遮断し、診断アッセイを開発および改善しています。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

蛍光活性化細胞選別（FACS）によって特定の細胞集団の精製

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

フローサイトメトリーによって負傷した脊髄組織における免疫細胞の定量的評価：セルの精製方法のための新しい使用法

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

マウス大動脈内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

機能心臓の免疫細胞の単離

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

2光子顕微鏡を用いてマウスの胸腺の生体内イメージング

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

ヒト末梢血の免疫表現型分析のための抗体のカクテルを準備する半自動のアプローチ

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...