Name: purification of human s100a12 and its ion-induced oligomers for immune cell stimulation
Uploaded: 2019-09-29T12:30:00
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이 연구는 Muenster 대학 의학 교수의 교내 혁신적인 의학 연구 프로그램에서 보조금에 의해 지원되었다 (KE121201 C.K.에) 독일 연구 재단 (DFG, Fo354/3-1 D.F.)

참고: 버퍼 및 재고 솔루션 준비는 보충 표 1을 참조하십시오.
1. 대장균의 단백질 발현
<ol><li>
복제
	<ol>
<li>복제없는 인간 S100A12 (NCBI 기준 서열: NP_005612.1) 박테리아 발현 벡터 pET11b 내로. 단백질을 발현하기 위해, 컨스트럭트를 대장균 BL21(DE3)으로 변형시킨다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
문화
	<ol>
<li>14 mL 원형 바닥 튜브?...

<ol>
	<li>Liston, A., Masters, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostasis-altering+molecular+processes+as+mechanisms+of+inflammasome+activation.">Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).</li><li>Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocyte-derived+S100+proteins+in+autoinflammation:+putative+role+in+pathogenesis+and+usefulness+as+biomarkers.">Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers.</a> Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).</li><li>Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+circular+dichroism+studies+of+iron(ii)+binding+to+human+calprotectin.">Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin.</a> Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).</li><li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein.">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).</li><li>Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nickel+Sequestration+by+the+Host-Defense+Protein+Human+Calprotectin.">Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).</li><li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12.">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex:+implications+for+host-parasite+defence.">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li><li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc:+new+insights+into+S100A12+oligomerisation.">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).</li><li>Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+the+human+(S100A8/S100A9)2+heterotetramer,+calprotectin,+illustrates+how+conformational+changes+of+interacting+alpha-helices+can+determine+specific+association+of+two+EF-hand+proteins.">The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+Ca2++and+Zn2++are+essential+for+S100A12+protein+oligomerization+and+function.">Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function.</a> BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).</li><li>Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ions+binding+to+S100+proteins.+I.+Calcium-+and+zinc-binding+properties+of+bovine+brain+S100+alpha+alpha,+S100a+(alpha+beta),+and+S100b+(beta+beta)+protein:+Zn2++regulates+Ca2++binding+on+S100b+protein.">Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).</li><li>Dell&#8217;Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+and+binding+properties+of+calgranulin+C,+a+novel+S100-like+calcium-binding+protein+from+pig+granulocytes.">Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).</li><li>Vogl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A12+is+expressed+exclusively+by+granulocytes+and+acts+independently+from+MRP8+and+MRP14.">S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).</li><li>Hofmann, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+mediates+a+novel+proinflammatory+axis:+a+central+cell+surface+receptor+for+S100/calgranulin+polypeptides.">RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides.</a> Cell. 97 (7), 889-901 (1999).</li><li>Foell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+S100A12+Can+Activate+Human+Monocytes+via+Toll-like+Receptor+4.">Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).</li><li>Kessel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+zinc+tune+autoinflammatory+Toll-like+receptor+4+signaling+by+S100A12.">Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).</li><li>Armaroli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-Derived+Interleukin-1beta+As+the+Driver+of+S100A12-Induced+Sterile+Inflammatory+Activation+of+Human+Coronary+Artery+Endothelial+Cells:+Implications+for+the+Pathogenesis+of+Kawasaki+Disease.">Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).</li><li>GE Healthcare. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Strategies for Protein Purification. 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O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+endotoxin+removal+from+biological+preparations:+a+review.">Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review.</a> Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).</li><li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+removal+from+protein+solutions.">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li><li>Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+partial+characterization+of+canine+S100A12.">Purification and partial characterization of canine S100A12.</a> Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).</li><li>Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+human+Ca2+-bound+S100A12.">Solution structure of human Ca2+-bound S100A12.</a> Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).</li><li>Endotoxin Removal. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Application Note - Sartorius Stedim Biotech. , (2010).</li><li>Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymyxin-B+Stimulates+Production+of+Complement+Components+and+Cytokines+in+Human+Monocytes.">Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).</li><li>Valentinis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+effects+of+polymyxin+B+on+human+dendritic+cells+maturation+-+The+role+of+I+kappa+B-alpha/NF-kappa+B+and+ERK1/2+pathways+and+adhesion.">Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).</li><li>Teuber, M., Miller, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Binding+of+Polymyxin-B+to+Negatively+Charged+Lipid+Monolayers.">Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).</li></ol>

이 프로토콜에서, 우리는 면역 세포 자극을 위한 다른 이온 유도 된 올리고머로의 분리뿐만 아니라 인간 S100A12의 태그 없는 세균 발현 및 그것의 정제를 기술한다. S100A12 단백질 정제8,23,24에대한 출판 된 문헌과 비교하여 소수성 상호 작용 크로마토그래피에서 높은 CaCl2 (25 mM)를 사용하는 것은 우리의 지식고유입니다. 1...

S100A12는 인간 과립구에 의해 주로 생성되는 칼슘 결합 단백질입니다. 단백질은 (전신) 염증 및 혈청 수준 동안 과발현되며, 특히 전신 성 청소년 특발성 관절염 (sJIA), 가족 지중해 열 (FMF) 또는 가와사키 질환 (KD)과 같은 (자동) 염증성 질환에서 질병 활동 및 치료에 대한 반응. 톨-유사 수용체(TLRs)와 같은 패턴 인식 수용체(PRR)에 따라, 선천적인 면역 계통은 리포폴리대당(LPS) 또는 손상 관련 분자 패턴(DAMPs)과 같은 병원체 관련 분자 패턴(PAMPs)에 의해 활성화될 수 있다. '알람'이라고도 불립니다. DAMPs는 세포 단백질, 지질 또는 핵산과 같은 내인성 분자1. DAMP 기능은 칼그라눌린 단백질 패밀리의 구성원인 S100A8/A9 및 S100A122의구성원에 대해 잘 설명되어 있으며, 이는 또한 이원성 금속 이온 킬레이트 화 항균 펩티드로 작동하는 것으로 보고되고3,4 ,4, 5,6. 사용 가능한 이온 강도 S100A12에 따라, S100 가족의 다른 구성원과 마찬가지로, 상이한 상동체로 배열하고 최근까지 PRR 상호 작용, 특히 TLR4에 S100A12-올리고머화의 영향은 알려지지 않았다.
단백질의 단모체 형태 (92 아미노산, 10.2 kDa)는 유연한 링커에 의해 연결된 두 개의 EF 손 나선 루프 나선 구조로 구성됩니다. C-단말EF-핸드는 고전적인Ca2+-결합 모티프를 포함하고 있는 반면,N-말단 EF-hand는 S100 단백질 특이적 확장 루프 구조('의사-EF-hand')를 나타내며 감소된Ca2+-affinity를 보여줍니다. Ca2+-결합 은 단백질의 C-종단에 있는 중요한 형태 변화를 유도할 수 있고, 이는 각 단량체에 소수성 패치의 노출을 초래하고 이량화 인터페이스를 형성한다. 따라서, 생리적 조건하에서, S100A12에 의해 형성된 가장 작은 사각 구조는 개별 단량체가 반평행 방향으로 있는 비공유 이량체(약 21 kDa)이다. 이량체로 배열될 때, S100A12는 Zn2+ 뿐만 아니라 다른 원화 금속 이온들, 예를 들어,Cu2+가 높은 친화성7을가진 격리기로 보고된다. 이러한 이온은 하나의 서브유닛 및 H85의 아미노산 H15 및 D25뿐만 아니라 반병렬화 다른 서브유닛8,9,10의 H89에 의해 S100A12 디머 계면에서 조정된다. 이전 연구는 Zn2+-로드 S100A12호모 테트라머 (44 kDa)로 단백질의 조직을 유도하고 증가Ca2 +-affinity11,12,최근 금속 적정을 초래할 수 있음을 제안하는 동안 연구6 은 Zn 2 + 단백질의 친화도를 높이기 위해 S100A12에 의한 Ca2+-바인딩을 제안합니다. 일단 S100A12 EF-hands가 Ca2+에의해 완전히 점유되면, 추가 Ca2+는 hexamer 형성 (약 63 kDa)을 트리거링, 디머 사이에 결합하는 것으로 생각된다. hexameric 분기 구조의 구조는 tetramer의 아키텍처와 분명히 다릅니다. 테트라머 인터페이스가 중단되어 hexamer형성(10)에이점을 주는 새로운 디머-디머 인터페이스를 야기하는 것이 제안된다. S100A12는 거의 독점적으로 인간 과립구에 의해 발현되며, 여기서 모든 세포종 단백질13의약 5%를 구성한다. DAMP 기능에서 S100A12는 역사적으로 고급 당화 최종 제품(RAGE)에 대한 다중 리간드 수용체의 작용제로서 기술된 후, 세포외 에서 새로 확인된 RAGE 결합 단백질(EN-RAGE)14라고불림하였다. 이기는 하지만 우리는 이전에 보고된 생화학적 S100A12-분노 및 TLR415둘 다에 결합하고, 우리는 최근에 TLR4 의존적인 방식으로 S100A12 자극에 반응하는 인간 단핵구를입증하였다 16. 이를 위해서는 S100A12를 Ca2+ /Zn2+-유도 된 hexameric 분기 구조16에배치해야합니다.
여기서 우리는 면역 세포 자극에 대한 재조합 인간 S100A12 및 이온 유도 올리고머에 대한 정제 절차를16,17에기술한다. 이것은 단백질을 분리하고 집중시키고 벌크 오염을 제거하기 위해 음이온 교환 컬럼을 포함하는 2단계 크로마토그래피 전략에 기초합니다(예를 들어, 내독소/리포폴리사카라이드)18. 이온 교환 크로마토그래피는 다른 순 표면 전하에 기초하여 단백질을 분리합니다. S100A12(5.81의 등전점)와 같은 산성 단백질의 경우 pH가 8.5이고 강력한 음이온 교환 수지의 완충 시스템이 양호한 분리를 유도합니다. 바운드 단백질을 고염 완충구로 용출시켰다. 용출 완충제에서 이온 강도의 증가와 함께 수지의 표면에 전하를 위해 단백질과 경쟁한다. 단백질은 그들의 순 전하에 따라 개별적으로 용해되고 그 결과, 본원에 기재된 완충제는 과발현된 S100A12 단백질을 분리하고 농축할 수 있게 한다. 리포폴리당에서 음전하를 띤 그룹으로 인해, 이 분자는 음이온 교환 수지에도 결합합니다. 그러나, 이들의 높은 순전하로 인해 적용된 고염 구배에서 나중에 용출이 발생한다. 정제 절차의 두 번째 단계는 연마 목적으로 도입되었습니다. 이것은 S100A12의 칼슘 결합 능력을 이용하고 소수성 상호 작용 컬럼에 남아있는 불순물을 제거합니다. S100A12의 칼슘 결합은 단백질의 표면에 형성적 변화 및 소수성 패치의 노출을 유도한다. 그 조건에서, S100A12는 수지의 소수성 표면과 상호 작용한다. EDTA에 의해 칼슘 킬레이트에 의해, 이 상호 작용은 반전. 이온, 특히 칼슘과 아연이있는 경우 S100A12는 동종 올리고머로 배열됩니다. 상이한 올리고머의 구조-기능 관계를 연구하기 위해, 화학 적 가교로 디메릭, 테트라메릭 및 hexameric 재조합 S100A12를 안정화하고 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에서 복합체를 분리했습니다. 마지막으로, 정제된 단백질 및 이온 유도 올리고머의 기능 및 생물학적 활성을 분석하기 위해, S100A12 및 LPS 자극 단핵구의 사이토카인 방출을 비교할 수 있다.
S100A12를 정화하기 위한 다양한 방법이 지금까지 설명되어 왔다. Jackson 등19,예를 들어, 음이온 교환 컬럼 및 후속 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제가 있는 프로토콜을 발표했다. 크기 제외 열의 정화 연마는 좋은 결과를 초래하지만, 예를 들어 제한된 로딩 볼륨으로 인해 확장성이 덜 유연합니다. Kiss et al.20에의해 출판된 다른 접근법은Ni2+ 친화성 컬럼을 통한 태그된 단백질의 정제를 첫 번째 정제 단계로 설명하고, 이어서 효소 절단을 제거하여 태그를 제거하고 추가정제 단계를 수행한다. 상기19,20,이 프로토콜에 기재된 바와 같이 생산된 단백질은 상기 면역 세포에 대한 실험을 위해 결정된다. 따라서, 세균 배양으로부터의 잔재내독생 오염은 도전이다. 내독소 제거를 위한 다른 접근법이 지금까지 기술되었지만, 주어진 단백질 용액21,22에대해 동등하게 잘 작동하는 균일한 방법은 없다.
요약하자면, 당사의 프로토콜은 박테리아 시스템에서 태그 없는 발현의 장점을 효율적인 내독소 제거 및 순수 단백질의 높은 수율과 결합합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pET11b vector</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x Non-essential amino acids</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K 0293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% HCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X897.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8722;20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciumchlorid Dihydrat</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5239.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human Monocyte Enrichment Kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19059</td>
			<td>Magnetic negative cell isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoLISA</td>
			<td>Hyglos</td>
			<td>609033</td>
			<td>Endotoxin detection assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxin-Free Ultra Pure Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TMS-011-A</td>
			<td>Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoTrap red</td>
			<td>Hyglos</td>
			<td>321063</td>
			<td>Endotoxin removal resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (heat-inactivated)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (high quality, endotoxin testet)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hTNF-alpha - OptEia ELISA Set</td>
			<td>BD</td>
			<td>555212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (isopropyl-&#223;-D-thiogalactopyranosid)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN08.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K 0282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Medium</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L6529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll, human</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-60500</td>
			<td>Separation solution (density gradient centrifugation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A 2212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl Sepharose High Performance</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1082-01</td>
			<td>Resin for hydrophobic interaction chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-pmb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Sepharose Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0510-01</td>
			<td>Resin for anion-exchange chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSep buffer</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>20104</td>
			<td>Cell separation buffer (section 5.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F 1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3957.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P031.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SLHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL roundbottom tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Erlenmyer flask</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>LY98.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well suspension plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 L measuring beaker</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CKN3.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL high-speed centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3,01,22,178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (100 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing Closures</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep magnet &#39;The Big Easy`</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector tubes 5 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>115101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox film, 25 &#181;m, 305 mm x 40 m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94,60,77,316</td>
			<td>Film for monocyte culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa)</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop filter unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C Incubator (with shaking)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA purifier UPC 10</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>FPLC System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Frac-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (with rotor A-4-81)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F-34-6-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean Tetra Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPhotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>P330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Brandelin</td>
			<td>UW2070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>infinite M200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Knick</td>
			<td>765</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of human s100a12 and its ion-induced oligomers for immune cell stimulation

본 프로토콜에서, 우리는 면역 세포 자극을 위한 대장균 배양으로부터 인간 칼슘 결합 단백질 S100A12 및 이온 유도 올리고머를 정제하는 방법을 기술한다. 이 프로토콜은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 대한 단백질 사전 정제및 소수성 상호작용 컬럼의 후속 연마 단계를 포함하는 2단계 크로마토그래피 전략을 기반으로 합니다. 이 전략은 관리 가능한 비용으로 고순도 및 수율의 S100A12 단백질을 생산합니다. 면역 세포에 기능적인 실험에 대 한 결국 잔재 endotoxin 오염 신중 한 모니터링 및 endotoxin 없는 단백질을 얻기 위해 추가 청소 단계를 필요. 내독소 오염의 대다수는 항이온 교환 크로마토그래피에 의해 제외될 수 있습니다. 잔류 오염을 고갈시키기 위해 이 프로토콜은 원심 필터를 사용하여 제거 단계를 설명합니다. 사용 가능한 이온 강도 S100A12에 따라 상이한 호모멀티머로 배열할 수 있다. 구조와 기능 사이의 관계를 조사하기 위해 이 프로토콜은 S100A12 단백질의 이온 처리를 더 설명하고 화학적 가교하여 S100A12 올리고머를 안정화시키고 크기 배제에 의한 후속 분리를 설명합니다. 크로마토그래피. 마지막으로, 우리는 정제된 단백질의 생물학적 활성을 확인하고 LPS 가 없는 제제를 확인하는 세포 기반 분석기를 기술한다.

AIEX 컬럼(도1A-C)에대한 사전 정제 에 이어 후속 칼슘 의존성 HIC(그림2A, B)를순차단백질(도2C)으로수득하였다. 또한, 내독소의 측정은 성공적인 LPS 제거를 밝혀. AIEX에 따른 LPS 함량은 분석 검출 한계, 즉 500 EU/mL 를 초과하는 1:10 희석으로 측정되었다. 50 kDa 필터 유닛을 통해 첫 번째 여과 후, LPS 함량은 1 EU/mL?...

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Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

본 프로토콜은 인간 단핵구 자극 분석법에 대한 재조합 태그 없는 칼슘 결합 단백질 S100A12 및 이온 유도 올리고머에 대한 정제 방법을 기술한다.

면역 세포 자극을 위한 인간 S100A12 및 그 이온 유도 올리고머의 정화

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

이 프로토콜은 인간 칼슘 결합 단백질, S100A12에 대한 완전한 정화 절차를 설명하고, 특히 다운스트림 연구 의미에 대한 상이온 유도 올리고머의 상이한 이온 유도 올리고머입니다. 이 기술을 통해, 우리는 매우 순수하고 내독신이없는 단백질의 높은 수율을 유지할 수 있습니다. 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 대한 화학적 교차 연결 및 분리는 추가 기능적 분석을 위해 호모-올리고메릭 단백질을 생성하는 설득력 있는 방법입니다.우리의 기술은 우리가 이상적으로 새로운 표적 내정간섭을 개발하고 진단 적인 연구력을 향상시키기 위하여 패턴 인식 수용체 리간드 및 예술 정보로 S100A12의 기계적인 양상을 허용합니다. 이 비디오를 보는 것 외에도 복잡한 다단계 절차를 설명하기 때문에 프로토콜을 주의 깊게 읽는 것이 좋습니다. 우선 투석 튜브를 약 30cm 의 적절한 길이로 자르고 공기를 위한 추가 공간을 확보하십시오.글리세롤을 제거하기 위해 15-30 분 동안 탈이온 물에 멤브레인을 담급니다. 클리어된 단백질 용액의 점도를 줄이기 위해 AIEX 버퍼 A.Attach의 25 밀리리터로 용액을 희석하여 튜브에 첫 번째 클로저를 부착합니다. 샘플을 멤브레인에 적재하고 튜브의 상단 끝에서 적어도 1센티미터 떨어진 두 번째 클로저에 부착합니다.섭씨 4도의 냉각실에 AIEX 버퍼 A를 넣고 저어줄과 단백질 용액으로 채워진 멤브레인을 넣습니다. 회전하는 교반 바에 간섭이 없도록 속도를 조정하여 시료를 회전시킵니다. 섭씨 4도에서 12~24시간 동안 투석한 버퍼를 무료 미리 냉각된 버퍼 A로 교체하고 최소 4시간 동안 계속합니다.투석 단백질 용액을 튜브에서 50 밀리리터 튜브로 0.45 미크론 필터 장치를 통해 전달합니다. 일반적인 유지 보수로 FPLC를 시작합니다. 열 버퍼A와 AIEX B를 FPLC의 열 포트에 열을 포함하는 밸브 및 음이온 교환 수지에 연결합니다.그에 따라 일반적인 크로마토그래피 매개 변수를 조정합니다. FPLC 소프트웨어에서 AIEX 프로그램을 시작하고 버퍼 A.Subsequently에 대한 평형 볼륨을 선택하고, 샘플을 컬럼에 로드하고 0%에서 100% 높은 염분 버퍼로 선형 그라데이션으로 단백질을 엘테우한다. 용출 중에 밀리리터 분수 2개를 수집합니다.실행을 완료한 후 용출된 분수를 분석합니다. 이를 위해 15%SDS 페이지에 각 분수의 마이크로리터 10개를 적재하고 S100A12를 포함하는 분획을 식별합니다. 투석용 분획을 포함하는 이러한 S100A12를 TRIS 버퍼식식라인으로 풀링합니다.단백질 정화를 계속하기 위해, 단백질 투석 후, 다음 단계에서 수지에 S100A12의 결합을 용이하게 할 것이다 25 밀리몰라의 최종 농도에 샘플에 염화 칼슘을 추가합니다. 그런 다음 0.45 미크론의 붓는 크기로 필터를 통해 샘플을 필터링합니다. HIC 버퍼와 샘플을 섭씨 4도까지 상화합니다.다음으로 열 버퍼HIC A와 B와 열을 시스템에 연결하고 매개 변수를 조정합니다. 버퍼 HIC A의 1~2개의 열 볼륨으로 컬럼을 상화하고 UV 신호로 시료를 로드하고 UV 신호가 기준선 수준에 다시 도달하는 방법을 시작합니다. 그런 다음 완충제 EDTA를 함유한 칼슘 첼라토르로 용출을 시작합니다.용출 시 피크 분수 2밀리리터를 수집합니다. 쿠마시에서 각 분수의 10 마이크로리터를 분석한 후 15% SDS 페이지에 스테인드되어 순수 S100A12 분획을 식별합니다. 이러한 분획을 풀과 HBS에 대한 투석.첫째, 50킬로달톤 원심 필터 장치에 15밀리리터의 시료를 적재합니다. 원심분리기는 섭씨 10도에서 3200배 g로 약 10분간. 얼음에, 신선한 선박에 여과 된 흐름을 전송합니다.이제 HBS의 1밀리리터를 사용하여 필터 멤브레인을 헹구고 필터 팁에서 농축 된 용액의 희석을 하십시오. 원심분리기는 다시 유동에서 가능한 한 많은 단백질을 회복합니다. 솔루션을 필터링하려면 필요한 경우 시료 적재 및 원심 분리를 자주 반복합니다.다음으로, 플로우를 포함하는 S100A12를 농축하기 위해 3킬로달톤 원심 필터와 원심분리기를 3200g, 섭씨 10도에서 약 30분간 적재한다. 이제 볼륨이 초기 로딩 볼륨의 1/5에서 1/10까지 감소합니다. 농축 솔루션을 새로운 튜브로 전송합니다.필요한 경우 농도 단계를 자주 반복합니다. 화학 적 교차 연결 후, 원고에 따르면, 크기 배제 크로마토그래피를 수행. HBS의 컬럼을 상화하고, 샘플을 로드하고, 실행 중에 1~2밀리리터의 피크 분수를 수집합니다.4 ~20% 그라데이션 SDS 페이지에서 이러한 분획을 분석한 후 원하는 단백질 복합체의 주요 대역으로 풀 분획을 제공합니다. 그런 다음 이전에 수행된 대로 솔루션을 집중합니다. 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 인간의 버피 코트로부터 단핵구를 분리하려면 먼저 분리 용액을 실온에 상량화합니다.20 밀리리터를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고, 버피 코트당 2개의 튜브를 전달합니다. HBSS로 인간의 버피 코트에서 혈액을 희석하여 총 60 밀리리터로 희석하고 분리 매체 위에 이 혼합물의 30 밀리리터층을 조심스럽게 층으로 희석시다. 원심분리기는 실온에서 35분 동안 550배 g로 원심분리기.원심분리기의 브레이크를 끕시합니다. 원심분리 후, 단핵 말초 혈액세포는 분리 배지 의 바로 위에 위치한다. 파이펫을 사용하면 이 세포를 50밀리리터 원심분리기 튜브로 이송합니다.튜브를 HBSS로 50밀리리터와 원심분리기를 10분 동안 170배 g로 채웁니다. 피펫팅에 의해 소량의 HBSS에서 슈퍼나티를 흡인하고 셀 펠릿을 재연합니다. 그런 다음 튜브를 최대 50 밀리리터와 원심분리기를 290배g에서 10분간 채웁니다.슈퍼상을 다시 흡인합니다. HBSS와 원심분리기의 50 밀리리터에서 10분 동안 170배 g로 세포를 재중단합니다. 상류체를 흡인하고 분리 버퍼의 1 밀리리터의 작은 부피로 세포 펠릿을 재보페, 세포를 계산하고, 밀리리터 당 7개의 세포에 5배 10의 농도에 버퍼를 추가한다.단핵 말초 혈액 세포에서 단핵 절연을 위해 자기 음성 세포 격리 키트를 사용하고 제조업체의 프로토콜을 따릅니다. 자동화된 세포 카운터를 사용하여 단핵구를 계산하고 단핵 매체에서 밀리리터당 6개의 세포에 2배 10의 농도로 재연한다. 모노사이클을 배양하려면 현탁세포에 적합한 소수성 가스 투과성 필름을 사용하여 세포 배양 접시를 배치한다.플레이트를 UV 광 아래에 약 30분간 배치하여 살균합니다. 이 배양 판에 세포 현탁액의 15 에서 25 밀리리터를 전송하고 37 섭씨 및 5 %의 이산화탄소에서 하룻밤 휴식을 취하십시오. AIEX 컬럼과 후속 칼슘 의존 HIC에 대한 사전 정제에 이어, 고순수 단백질을 얻었다.추가 대조군으로서 인간의 단핵구는 LPS로 자극되어 야생 형 단백질을 생산했습니다. 다른 이온에 단백질 노출은 다른 S100A12 올리고머의 배열을 초래한다. 아연 농도가 증가하면 4~20%의 Coomassie 염색 SDS 페이지에서 분리시 S100A12의 배열을 테트라머와 hexamers로 유도합니다.교차 연결 전에 과도한 이온이 적용되었을 때, 올리고머 평형의 뚜렷한 변화를 유도했다. S100A12는 25밀리몰라 칼슘 또는 25 밀리몰라 칼슘과 1밀리몰라 아연의 존재속에서 교차 연결되었다. HBS 버퍼에서 25밀리머 칼슘 염화물 및 1 밀리머 아연 염화물, hexamer 및 테트라머를 교차 연결한 후 분리되었습니다.테트라머와 이머는 25 밀리몰라 칼슘 염화칼슘으로 HBS 완충제에서 분리되었다. 4~15%의 그라데이션 SDS 페이지에 스테인드된 쿠마시에 분리된 후 풀링및 농축 된 올리고머의 예로 는 디머, 테트라머 및 hexamer를 보여줍니다. hexameric S100A12와 단세포 자극은 발음 TNF 알파 릴리스 결과.내독신을 제거한 후, 후속 생성 및 올리고머의 정제 시 시료에 오염을 재도입하지 않는 것이 중요하다. S100A12 올리고머화와 관련된 모든 공정의 다운스트림 분석은 생각할 수 있습니다. 유사하게, 올리고머화 공정 자체에 영향을 미치는 아미노산 및 이온 조건을 분석할 수 있다.현재 TLF4를 통해 단백질의 신호를 차단하고 진단 분석량을 개발하고 개선하기 위해 특정 펩타이드 리간드 및 항체를 개발하기 위해 기술된 프로토콜에 따라 분리된 S100A12 올리고머를 사용하고 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

형광 활성 세포 정렬 (외과)에 의해 특정 세포 인구의 정제

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

연구

면역학 및 감염병학

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

유동세포계측법에 의해 피해를 입은 척수 조직에서 면역 세포의 양적 평가 : 세포 정제 방법에 대한 소설을 사용

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

심장 기능 면역 세포의 분리

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

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2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

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Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

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Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...